菌种的保藏概述

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1、菌种的保藏和防止衰退的措施 菌种保藏的要点： 选择适宜的培养基培养温度和菌龄，以便得到健壮的细胞或孢子；保存于低温隔氧干燥避光的环境中，尽量降低或停止微生物的代谢活动，减慢或停止生长繁殖；不被杂菌污染，在较长时期内保持著生活能力。 方法和原理 定期移植法： 将菌种接种于所要求的培养基上，在最适温度中培养，至静止期或产生成熟的孢子时，置入 5的冰箱(或冰库)保存。在培养和保存的过程中，由于代谢产物的累积而改变了原菌的生活条件，结果菌落群体中的个体就不断衰老和死亡，因此每 515 天或 14 个月重新移植一次，具体间隔时间因种而异。凡能人工培养的微生物都可用此法保存。此法不需特殊设备，但烦琐，费时

2、，而且经常移植容易引起菌种退化。 矿油封藏法： 将化学纯的液体石蜡(矿油)经高压蒸气灭菌，放在 40恒温箱中蒸发其中的水分，然後注入斜面培养物中，使液面高出斜面约 1 厘米。将试管直立，放在 1520室温中保存。由于在斜面培养物上覆盖一层液体，既能隔绝空气，又能防止培养基因水分蒸发而干燥，可以延长菌种保藏的时间。但注入的液体必须不与培养基混溶对菌种无毒，不易被利用和挥发。此法适用于酵母菌芽孢杆菌；不适用于固氮菌乳酸杆菌明串珠菌法门氏菌和毛黴目中的大多数属种。此法简便易行，但必须注意防火和污染。 沙土管法： 将沙或土过筛烘干装管灭菌然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀，放到盛氯化钙的干燥器里吸除水

3、分，干燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态，可保存较长时期。此法适用于芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌镰刀菌等。 麸皮法： 将麸皮制成培养基，培养要保存的菌种，待生长良好後，置干燥器中保存。这是根据中国酿造酒醋酱时制麴的经验所采用的一种保藏方法，适用于谷物微生物区系中的种类。 L干燥法： 又称液体干燥法或真空干燥法， 用含3%谷氨酸钠的 0 1M磷酸缓冲溶液 做分散媒，将待保藏的微生物制成高浓度的细胞悬液，滴入无菌安瓿瓶中，每管毫升；将安瓿瓶固定在多歧管上，并以水浴保持安瓿瓶内样品温度为 10，在 帕的真空度下干燥，火焰封管保存。此法不经冻结，用真实泵迅速抽乾，可避

4、免菌种的冻伤或死亡。广泛应用于病毒噬菌体细菌酵母菌蓝藻原生动物等。 梭氏法: 将容有 1 滴细胞悬液的小管，置于盛有氢氧化钾或五氧化二磷吸水剂的大试管中，用真空泵抽至帕时，将大试管密封保存。这是为减少细胞死亡率而采取的一种不经冻结缓慢脱水的干燥保藏法，适用于多种细菌真菌。 冷冻真空干燥法: 将细胞悬液每毫升注入一无菌安瓿瓶， 于-40预冻 1 小时， 再于-2030真空度为帕的条件下脱水。在脱水过程後期，安瓿瓶外温度可逐渐升至 25。脱水後的样品含水量应在 3%以下。最後，将安瓿瓶保持真空度 帕，用火焰溶封，置 10保存。为防止细胞在冻结和脱水过程中损伤或死亡，要用保护剂制备细胞悬液。保护剂有

5、脱脂牛奶血清10%蔗糖或葡萄糖溶液等，其作用是通过氧和离子键对水和细胞所产生的亲合力来稳定细胞成分的构型。此法适用于病毒衣原体枝原体细菌放线菌酵母菌丝状真菌等的长期保存，是当前保藏菌种的一个重要方法。但是，盐杆菌发光杆菌黏杆菌阿舒囊黴多囊黴担子菌中的大多数属种不适用于此法保存。 液态氮超低温冻结法: 用甘油或二甲亚(DMSO)作保护剂制备细胞悬液，分装入无菌安瓿瓶，每管毫升，在控制温度下降速率为 1/分钟的条件下预冻至-40，然後立即放入液氮生物贮存罐中气相(-150)保存。恢复培养时，先直接侵入 38水浴中解冻 510 分钟，再种植于适宜培养基内培养。这是根据在低于-130时一切生化反应处于

6、停止状态微生物也不能进行代谢活动而设计的冻结法。为避免冻死冻伤和细胞内形成大量冰晶，用保护剂制备悬液并控制预冻时的冷却速率和解冻时融化速率。微生物的大多数属种适于慢速冻结和快速解冻。此法适用于病毒枝原体各种细菌放线菌酵母菌丝状真菌蓝藻等。 分工和机构： 菌种保藏可按微生物各分支学科的专业性质分为普通工业农业医学兽医抗生素等保藏管理中心。此外，也可按微生物类群进行分工，如沙门氏菌弧菌根瘤菌乳酸杆菌放线菌酵母菌丝状真菌藻类等保藏中心。 目前，世界上约有 550 个菌种保藏机构。其中著名的有美国典型菌种保藏中心(简称 ATCC，马里兰)；1925 年建立，是世界上最大的保存微生物种类和数量最多的机构

7、，保存病毒衣原体细菌放线菌酵母菌真菌藻类原生动物等约 29000 株，都是典型株；荷兰真菌菌种保藏中心(简称CBS，得福特):1904 年建立，保存酵母菌丝状真菌约 8400 种18000 株，大多是模式株；英国全国菌种保藏中心(简称 NCTC，伦敦)：保存医用和兽医用病原微生物约 2740 株；英联邦真菌研究所(简称 CMI，里郡)：保存真菌模式株生理生化和有机合成等菌种 2763 种， 8000 株； 日本大阪发酵研究所(简称 IFO，大阪):保存普通和工业微生物菌种约 9000 株；美国农业部北方利用研究开发部(北方地区研究室，简称 NRRL，伊利诺伊州皮契里亚)：收藏农业工业微生物分类

8、学所涉及的菌种，包括细菌 5000 株，丝状真菌 1700 株酵母菌 6000 株。 1970 年 8 月在墨西哥城举行的第 10 届国际微生物学代表大会上成立了世界菌种保藏联合会(简称 WFCC)，同时确定澳大利亚昆士兰大学微生物系为世界资料中心。这个中心用电子计算机储存全世界各菌种保藏机构的有关情报和资料1972 年出版世界菌种保藏名录。 中国于 1979 年成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(简称 CCCCM， 北京)。 防止衰退的措施： 提供良好的环境条件，进行合理的传代 (发酵工业用三代内的菌种)，采用优越的保藏方法 ， 定期纯化菌种， 防止自身突变 用遗传性稳定的突变体做菌种，用合适接种物传代（即采用幼龄菌和孢子传代） 。