《临床血液学检验第5讲骨髓活检及细胞生物学实验技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床血液学检验第5讲骨髓活检及细胞生物学实验技术（69页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一节 骨髓象检验与分析第二节 细胞化学染色第三节 骨髓活体组织检查第四节 造血细胞培养第五节 血细胞染色体检验第六节 血液分子生物学检验 第七节 流式细胞术第四章 造血检验的基本方法第三节 骨髓活体组织检查一、骨髓活检 取一块骨髓活组织作切片，进行病理细胞学观察，了解骨髓组织结构，和涂片互为补充和配合。二、适应证：反复多部位干抽或稀释致骨髓穿刺失败全血细胞减少，骨髓增生低下，怀疑再障和有病态造血者涂片不能解决的不明原因贫血、发烧、肝脾淋巴结肿大。白血病治疗效果的观察：可观察到原始细胞簇骨髓组织切片三、正常骨髓的组织细胞定位1.粒系细胞主要位于远离静脉窦之造血索状组织深部。原粒与早幼粒细胞常单
2、个地分布于骨小梁旁以及小动脉和微动脉四周。较成熟的粒细胞定位于小梁间区，至晚幼粒以下逐渐向静脉窦窦壁移动，最后通过窦壁孔隙释放入血循环。2.红细胞岛常定位于小梁间区内静脉窦窦壁四周，内层的幼红细胞往往比外层更为幼稚。3.巨核细胞一般聚集于静脉窦窦壁外，少数散在分布于全骨髓切片的不同部位，成熟巨核细胞通过窦壁内皮间的小孔隙释放血小板。4.淋巴细胞、单核细胞常定位于造血组织小动脉的四周。 四、骨髓活体检查的意义1.确切了解骨髓增生程度，协助血液病的诊断 造血组织面积脂肪组织面积 纤维组织面积2.可发现穿刺涂片不易发现的病理变化 低增生白血病，肿瘤浸润，解决干抽和稀释问题3.早期诊断和判定预后 MD
3、S的ALIP（abnormal localization of immature precursor)现象: 35个以上原粒与早幼粒细胞聚集成簇，位于小梁间区或小梁旁区转移癌，恶性组织细胞病阳性率高 4.协助诊断慢性骨髓增殖性疾病涂片难发现 包括骨髓纤维化、真性红细胞增多，原发性血小板增多五、骨髓穿刺与活检的比较穿刺穿刺活检活检优优点点抽取骨髓液涂片，W-G染色活检针取一块骨髓组织、固定、包埋、切片、染色1.操作简便1.保持造血组织结构，便于判断造血组织和脂肪组织面积2.细胞分布均匀，胞体舒展，细微结构清晰，易识别2.判断增生度准确3.易识别巨型变、巨样变和小巨核细胞3.避免稀释4.细胞化学染
4、色效果好，可量化4.特殊疾病有确诊价值、可细胞定位、干抽的鉴别缺缺点点1.组织结构已破坏1.细胞聚集，类型不易区分2.易稀释2.细微结构不能观察3.对干抽无法分析第四节 造血细胞培养1.干/祖细胞培养红系祖细胞培养粒-单系祖细胞培养巨核系祖细胞培养混合祖细胞培养研究造血细胞分化、发育、调节，药物影响，发病机制，治疗效果分析2.白血病细胞系传代培养名称类型培养条件THP-1急性单核细胞白血病( FAB-M5)高糖DMEM培养基，含15%胎牛血清、10mM HEPES、1.0mM 丙酮酸钠、0.05M 2-巯基乙醇、100U/ml青链霉素HL-60急性早幼粒细胞白血病(FAB-M3) RPMI-1
5、640培养基，含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及链霉素K562慢粒急性变白血病Dami急性巨核细胞白血病( FAB-M7)Meg-01急性巨核细胞白血病( FAB-M7)高糖DMEM培养液，含10%胎牛血清、100U/ ml青霉素及链霉素。 3.培养条件：培养基：RPMI1640，MEM，TC199温度：37湿度：饱和5%CO2：提供碳源和调节酸碱度生长因子：胎（小）牛血清第五节 血液细胞染色体检验一、染色体结构二、显带G带R带高分辨率带染色体显带三、血液病常见染色体改变1.慢性粒细胞白血病8590的慢粒患者有t（9；22）异常，即Ph染色体。慢粒慢性期约1520病人伴有其他附加染色体变
6、化，且在急变期其发生率可明显增高。附加变化多为：8，i（17 q）或19。Ph染色体的有无可将慢粒分为Ph阳性与阴性两类，前者慢性期较长，发生急变时间晚，后者反之。染色体的异常图解 易位使易位使9 9号染色体长臂（号染色体长臂（9q349q34）上的原癌基因上的原癌基因c- c- ablabl和和2222号染色体号染色体(22q11)(22q11)上的上的bcr(breakbcr(break point cluster point cluster region)region)基因重新组合成融合基因。基因重新组合成融合基因。PhPh染色体致病的分子机制：染色体致病的分子机制：IgIgc-ablc
7、-ablc-cisc-cis融合基因融合基因bcrbcr9 9c-ablc-ablIgIgbcrbcrc-cisc-cis22222.急性非淋巴细胞白血病 染色体异常出现的亚型预后价值t（8；21）M2预后较好t（15；17）M3预后较好Inv（16），del（16q）M4Eo预后较好+8各种亚型预后不良+21M1，M7+13双表型预后不良5q，5，7继发性白血病预后不良t（v；11）*M4，M5a预后不良t（8；16）M5b预后不良t（9；22）M1等预后不良t（4；11）双表型预后不良3.急性淋巴细胞白血病 染色体异常出现的亚型预后价值t（4；11）L2预后不良t（1；9）L1预后较好t（
8、8；14）L3（包括B、T细胞型）预后不良t（2；8）L3（成熟B细胞型）t（8；22）L3（成熟B细胞型）t（1；19）前B细胞型预后不良超二倍体L1，L2预后良好t（9；22）L1，L2预后不良t（10；14）T细胞型t（7；14）T细胞型t（7；7）T细胞型t（7；9）T细胞型4.慢性淋巴细胞白血病2162的B-CLL有12三体异常，当出现12三体以外的其他异常克隆，意味疾病已进入晚期。T-CLL常涉及14q11的易位。HCL病例可有del（6q），3及12号染色体三体，易位常涉及14q32。5.骨髓增生异常综合征常见的异常克隆有5，7，85q及7因为有独特的临床特征常称为“5q综合征”
9、和“7单体综合征”，前者80发病年龄超过50岁，后者常见于儿童。许多资料表明有核型异常易演变成白血病。 第六节 血液分子生物学检验一、分子生物学技术 1.核酸分子杂交技术（1）Southern印迹杂交以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交，对待测DNA进行分析。（2）Northen印迹杂交用DNA或RNA探针对待测RNA进行分析。（3）核酸原位杂交标记的DNA或RNA探针在组织、细胞及染色体上与其相关的核酸序列杂交，简称原位杂交（in situ hybridization）。荧光原位杂交技术（FISH）：将标记探针与中期或间期染色体杂交，间接免疫荧光与探针结合，染色体用碘
10、化丙啶（PI）染色，荧光显微镜观察，染色体呈紫红色，染色体上的特异杂交带呈另一颜色。 Southern Blot 操作步骤：操作步骤：DNA 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 印迹转移印迹转移 预杂交预杂交 杂交（变性探针）杂交（变性探针） 洗膜洗膜 放射自显影或显色放射自显影或显色2.聚合酶链式反应技术特定基因片断扩增PCRQ-PCR3.基因芯片又称DNA微阵列（DNA microarray），固定大量以特定方式排列的基因探针或基因片段于硅片、玻片和塑料片上，待测DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，与微阵列杂交后再通过荧光扫描仪及计算机分析，可获得关于待测样品的大量基因序列及表
11、达信息。二、恶性血液病融合基因 （1）慢性粒细胞白血病(CML)bcr-abl融合基因 （2）急性早幼粒细胞白血病(M3,APL)PML-RARa融合基因 （3）急性粒细胞白血病M2型的AML1-ETO融合基因（4）ALL免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体（TCR）基因重排应用：微量残留病（白血病细胞）的检测三、与遗传有关血液病的诊断血红蛋白病是常见的遗传性溶血性疾病血友病是常见的遗传性出血性疾病 第七节 流式细胞术一、概念什么是什么是 FCM ？z流式细胞术：是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特
12、定群体加以分选。 z激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术二、流式细胞仪（FCM，flow cytometer）1973年 推出世界第一台流式细胞仪FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter）1980年中国的第一台流式细胞仪FACS II生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域美国BD 公司成立于1897年，是世界上最大的医疗技术及医疗设备公司之一。业务分三大类：BD医疗系统、BD生物科学系统、BD临床实验室系统，经营的产品多达一万余种，足迹遍及世界，跻身财富五百强之列。BD FCM的特点的特
13、点z测量速度快z可进行多参数测量z具有明显的统计学意义z高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度100MESFz既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上流式细胞检测原理1.流式细胞仪仪器结构流式细胞仪仪器结构液流系统液流系统光学系统光学系统激光光源光收集系统电子系统电子系统光电转换数据处理系统（原幼粒、单细胞）单核细胞 成熟粒细胞非红的原始/幼稚细胞,而幼红细胞或浆细胞不表达。SSC（侧向角光散射）其反映的是细胞的颗粒和核形复杂程度，SSC在成熟粒细胞最大单核细胞原/幼细胞与淋巴细胞红细胞。三、流式细胞仪的应用三、流式细胞仪的应用淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析CD4
14、绝对计数HIV的诊断与研究淋巴细胞 CD4/CD8分析CD4绝对计数T细胞活化流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化细胞因子的研究淋巴细胞的增殖树突状细胞的研究HLA-B27检测流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数PNH诊断网织红细胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用细胞周期分析肿瘤相关基因表达的研究多药耐药基因的研究细胞凋亡的分析凋亡细胞的分析凋亡相关蛋白的分析四、细胞表型分析CD1982年国际人类白细胞分化抗原协作组（HLDA）设立，专门研究白细胞
15、表面的分子，对有关细胞分化抗原的单克隆抗体进行联合鉴定和统一命名，使用分化群（Clusters of differentiation, CD）作为分化抗原的命名 。到2010西班牙Barcelona 举行的第9届HLDA国际会议已正式命名了363个CD 。CD抗体范围已扩大到各种血细胞，甚至之外的内皮细胞、上皮细胞和神经细胞，不再局限于白细胞，同时也由细胞表面扩展到了细胞浆内。HCDM (human cell differentiation molecules)白血病免疫分型常用的单抗主要特异性CDT细胞CD1,CD2,CD3,CD4,CD5,CD7,CD8B细胞CD10,CD19,CD20,CD21,CD22髓系细胞CD13,CD14,CD15，CD33,CD64，CD117，CD36NK细胞非系性标志CD16，CD56,CD57CD34、CD38 、CD45、HLA-DR正常人骨髓分析正常人骨髓分析HLA-B27阴性标本阴性标本 HLA-B27阳性标本阳性标本 重点内容：1.骨髓活检的适应证及与骨髓涂片检查的比较2. CML、M3、M2b和MDS的染色体异常3. CML、M3（APL）、M2b融合基因和急性淋巴细胞白血病的基因重排4.FCM工作原理及应用评价
