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1、仪器分析课程讲义仪器分析课程讲义第五节第五节 高效液相色谱法的应用高效液相色谱法的应用型液相色谱简介液相制备色谱液相制备色谱 Preparative liquid chromatography氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪Amino Acid Autoanalyzer,AAAAmino Acid Autoanalyzer,AAA超临界流体色谱超临界流体色谱Supercritical fluid chromatograph, SFC型液相色谱简介一、液相制备色谱一、液相制备色谱 1. 1. 概述概述细管柱细管柱细管柱细管柱：内径：内径：内径：内径2 mm2 mm2 mm2 mm；分析柱：分析柱
2、：分析柱：分析柱：2 2 2 26 mm6 mm6 mm6 mm5 5 5 540 cm 40 cm 40 cm 40 cm ；柱容量有限，采；柱容量有限，采；柱容量有限，采；柱容量有限，采取小量、多次进样能取得取小量、多次进样能取得取小量、多次进样能取得取小量、多次进样能取得ugugugug级的纯组分。级的纯组分。级的纯组分。级的纯组分。半制备柱半制备柱半制备柱半制备柱：8mm 8mm 8mm 8mm 20mm 20mm 20mm 20mm15 15 15 15 30cm 30cm 30cm 30cm ，一次制，一次制，一次制，一次制备量备量备量备量.1.1.1.1mgmgmgmg。制备柱制
3、备柱制备柱制备柱：20202020500mm500mm500mm500mm50cm 50cm 50cm 50cm ，泵流量大、进样量，泵流量大、进样量，泵流量大、进样量，泵流量大、进样量大，可取得大，可取得大，可取得大，可取得10mg10mg10mg10mg至至至至g g g g级纯组分。级纯组分。级纯组分。级纯组分。 型液相色谱简介制备色谱制备色谱：以色谱技术来分离、制备较大以色谱技术来分离、制备较大量纯组分的方法，量纯组分的方法，结构与分析型一样，但结构与分析型一样，但采用大流量输液泵、采用大流量输液泵、制备柱、制备柱、柱后馏分收柱后馏分收集器（按照固定体积顺序收集组分）。集器（按照固定体
4、积顺序收集组分）。 应用应用：制备标准物；对有机复杂组分进行：制备标准物；对有机复杂组分进行结构鉴定分析。结构鉴定分析。型液相色谱简介 2 2. .色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷） 分析柱：不影响分析柱：不影响柱效柱效时的最大进样量；时的最大进样量； 制备柱：不影响收集物制备柱：不影响收集物纯度纯度时的最大进样时的最大进样量；量； 超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰形变宽。峰形变宽。 超载可提高超载可提高制备效率制备效率，以柱效下降一半，以柱效下降一半或容量因子或容量因子k降低降低10%为宜。为宜。型液相色谱简介3.3.液相制备色谱方
5、法液相制备色谱方法a.欲分离组分呈现一个单峰欲分离组分呈现一个单峰b.两个或多个主组分两个或多个主组分c.较少的组分是预分离制备较少的组分是预分离制备化合物化合物型液相色谱简介a. a. 欲分离组分呈现一个单峰欲分离组分呈现一个单峰欲分离组分呈现一个单峰欲分离组分呈现一个单峰首先在分析型首先在分析型首先在分析型首先在分析型HPLCHPLC上进行试验，上进行试验，上进行试验，上进行试验，优化操作条件以提高分离度，优化操作条件以提高分离度，优化操作条件以提高分离度，优化操作条件以提高分离度，在负载极限内，按比例扩大柱径在负载极限内，按比例扩大柱径在负载极限内，按比例扩大柱径在负载极限内，按比例扩大
6、柱径或使用制备柱，并相应扩大输液或使用制备柱，并相应扩大输液或使用制备柱，并相应扩大输液或使用制备柱，并相应扩大输液泵流量；泵流量；泵流量；泵流量；若还需大量纯物质，可使柱超载若还需大量纯物质，可使柱超载若还需大量纯物质，可使柱超载若还需大量纯物质，可使柱超载运行，中心切割法收集中间馏分运行，中心切割法收集中间馏分运行，中心切割法收集中间馏分运行，中心切割法收集中间馏分型液相色谱简介c. 两主成分之间的小组两主成分之间的小组分；分； 达到最佳分离度后，达到最佳分离度后，利用柱超载，在洗脱区利用柱超载，在洗脱区收集要求分离的组分，收集要求分离的组分，并将各馏分合并使待分并将各馏分合并使待分离组分
7、成为主成分（富离组分成为主成分（富集）集） ，再按照，再按照a法对这一法对这一富集的试样进行纯化制富集的试样进行纯化制备。备。 型液相色谱简介二、超临界流体色谱二、超临界流体色谱 Supercritical fluid chromatograph, SFC1.1.概述概述 超临界流体超临界流体：在高于临界压力与临界在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。温度时，物质的一种状态。 型液相色谱简介超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点具有液相、气相色谱不具有的优点:1）可处理高沸点、不挥发试样；）可处理高沸点、不挥发试样；2）比）
8、比HPLC有更高的柱效和分离效率有更高的柱效和分离效率型液相色谱简介2. 2. 超临界流体性质超临界流体性质1 1、性质介于液体和气体之间、性质介于液体和气体之间; ; 具有气体的低黏度、液体的高密度，扩具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。散系数位于两者之间。2 2、可通过改变超临界流体的密度（程序升压）、可通过改变超临界流体的密度（程序升压）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）液相色谱中的梯度淋洗）。型液相色谱简介超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。型液相色谱简介3.超临界流体色谱仪超临界
9、流体色谱仪型液相色谱简介3.3.超临界流体色谱仪超临界流体色谱仪SFC的流动相的流动相：超临界流体；超临界流体；CO2、N2O、NH3等。等。SFC的固定相的固定相： 可使用液相色谱的柱填料。可使用液相色谱的柱填料。 填充柱填充柱SFC 毛细管柱毛细管柱SFC分离机理：分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；配系数不同而被分离；型液相色谱简介 压力效应：压力效应：在在SFC中，压力变化对容量因中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗加而增加，密度增加提高溶剂效率
10、，淋洗时间缩短。时间缩短。 压力控制压力控制：通过电子压力传感器和流量检：通过电子压力传感器和流量检测器，由计算机控制，程序地改变流动相测器，由计算机控制，程序地改变流动相的密度和流量。的密度和流量。型液相色谱简介程序升压程序升压型液相色谱简介 冷冻装置：冷冻装置：超临界流体从流体源出来后，超临界流体从流体源出来后，经冷冻装置预冷却成液体，再进行压力经冷冻装置预冷却成液体，再进行压力和温度的平衡，形成超临界流体。和温度的平衡，形成超临界流体。 检测器：检测器：可用气相色谱和液相色谱的检可用气相色谱和液相色谱的检测器，但超临界流体进入检测器之前需测器，但超临界流体进入检测器之前需转变成为气体或液
11、体。转变成为气体或液体。型液相色谱简介甘油三酸酯的分析甘油三酸酯的分析四种组分仅双键数目四种组分仅双键数目四种组分仅双键数目四种组分仅双键数目和位置不同，难分离和位置不同，难分离和位置不同，难分离和位置不同，难分离色谱柱：色谱柱：色谱柱：色谱柱：DB-225 SFCDB-225 SFCDB-225 SFCDB-225 SFC毛细管柱；毛细管柱；毛细管柱；毛细管柱；流动相：流动相：流动相：流动相：COCO2 2 ；从从从从15MPa15MPa15MPa15MPa程序升压到程序升压到程序升压到程序升压到27MPa 2.5hr27MPa 2.5hr27MPa 2.5hr27MPa 2.5hr完全分离
12、。完全分离。完全分离。完全分离。型液相色谱简介第六节第六节 氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪型液相色谱简介 高高速速氨氨基基酸酸分分析析仪仪的的实实质质是是一一台台专专用用的的高高效效液液相相色色谱谱仪仪，所所用用的的类类型型是是离离子子交交换换色色谱法。谱法。 特点：特点：分析时间缩短；分析时间缩短； 精确度越来越高；精确度越来越高； 完全实现自动化。完全实现自动化。型液相色谱简介一、固定相和流动相一、固定相和流动相1固定相固定相：强酸性阳离子交换树脂：强酸性阳离子交换树脂 磺酸型磺酸型 SO3Na氨基酸与树脂的亲和力：氨基酸与树脂的亲和力： 碱性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸中性氨基酸 酸性氨
13、基酸酸性氨基酸 型液相色谱简介氨基酸自动分析仪出峰次序为：氨基酸自动分析仪出峰次序为： Asp Asp Thr Thr Ser Ser Glu Glu Pro Pro Gly Gly Ala Ala Cys Cys Val Val Met Met Ile Ile Leu Leu Tyr Tyr Phe Phe Lye Lye NH3 NH3 His His Arg Arg 酸性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸中性氨基酸 碱性氨基酸碱性氨基酸型液相色谱简介在同类型氨基酸中，在同类型氨基酸中，短碳链短碳链的小分子先洗的小分子先洗脱下来，脱下来，长碳链长碳链的大分子后洗脱下来。的大分子后洗脱下来。如如 G
14、1y 和和Ala ， Val和和Leu 。对碳数相同的氨基酸，对碳数相同的氨基酸，有支链有支链的先流出，的先流出，无支链无支链的后流出。如的后流出。如 I1e 和和1eu 。碳链上存在碳链上存在羟基羟基可加速洗脱。如可加速洗脱。如 Ser和和A1a， Tyr和和Phe 。型液相色谱简介型液相色谱简介2流动相流动相 Na型型：柠檬酸的钠盐：柠檬酸的钠盐 标准分析标准分析 （蛋白质水解产物分析）（蛋白质水解产物分析） Li型型：柠檬酸的锂盐：柠檬酸的锂盐 生理体液（尿、血浆、组织提取液）生理体液（尿、血浆、组织提取液） 通通过过改改变变缓缓冲冲液液的的PH，离离子子强强度度，加加有有机机溶溶剂可改
15、善部分峰分离。剂可改善部分峰分离。 型液相色谱简介二、氨基酸分析仪的结构二、氨基酸分析仪的结构 输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统记录系统记录系统 型液相色谱简介1输液泵输液泵：双泵，：双泵，分别输送流动相和茚分别输送流动相和茚 三酮溶液三酮溶液 。 2进样器进样器3分离柱分离柱 玻璃管或不锈钢管，玻璃管或不锈钢管， 柱柱温温：适适当当改改变变柱柱温温可可以以改改善善某某些些峰峰的分离效果。的分离效果。 柱长与内径柱长与内径 ：与固定相颗粒大小有关。与固定相颗粒大小有关。型液相色谱简介4反应器反应器氨基酸与茚三酮的反应在氨基酸与茚三酮的反应在100 DYDA（双二
16、酮茚亚（双二酮茚亚胺）最大吸收波长胺）最大吸收波长570nm 测测定定亚亚氨氨基基酸酸选选用用440nm。（Pro）型液相色谱简介5 检测器检测器光栅式分光光度器光栅式分光光度器 流动池石英流动池石英 两个吸收波长即两个吸收波长即570nm和和440nm荧光检测器荧光检测器荧光剂为荧光胺和邻苯二胺荧光剂为荧光胺和邻苯二胺 荧光检测器不能测定亚氨基酸。荧光检测器不能测定亚氨基酸。型液相色谱简介三、三、 试样处理方法试样处理方法1.上机分析试液的要求上机分析试液的要求 (1)澄清透明澄清透明 (2)无色或略带浅黄色无色或略带浅黄色 (3)含盐量低，含氨量低含盐量低，含氨量低 (4)无蛋白质或肽类物
17、质无蛋白质或肽类物质 (5)pH以以22为宜为宜 (6)氨氨基基酸酸合合适适浓浓度度以以氮氮计计为为110nm50ul左右。左右。型液相色谱简介2.试样的前处理试样的前处理1）酸处理法）酸处理法 一一般般用用 6Mol.L-1盐盐酸酸溶溶液液，于于110水水解解20-90h ,稀稀释释过过滤滤后后真真空空蒸蒸发发至至干干, 加加 0.02mol.L-1盐酸溶解。盐酸溶解。 可得到除可得到除色氨酸色氨酸、胱氨酸胱氨酸外的所有氨基酸。外的所有氨基酸。型液相色谱简介过甲酸氧化法过甲酸氧化法 在盐酸水解前，先用过甲酸氧化，在盐酸水解前，先用过甲酸氧化，再进行盐酸水解，再进行盐酸水解， 胱氨酸与半胱氨酸
18、得到测定，色氨酸胱氨酸与半胱氨酸得到测定，色氨酸和蛋氨酸回收提高。和蛋氨酸回收提高。 型液相色谱简介 2）碱水解法）碱水解法 一一般般用用氢氢氧氧化化铵铵或或氢氢氧氧化化钠钠，置置入入水水解解管管中中于于110水水解解20h，水水解解液液用用盐盐酸酸中中和和，过过滤后上机分析，。滤后上机分析，。 保护色氨酸，但其他氨基酸被破坏。保护色氨酸，但其他氨基酸被破坏。型液相色谱简介3）酶水解法）酶水解法 蛋蛋白酶具有专一性白酶具有专一性 酶本身是蛋白质，除去困难酶本身是蛋白质，除去困难 现只能运用于特定氨基酸的分析。现只能运用于特定氨基酸的分析。型液相色谱简介测定正丁醇的校正因子，以乙醇做内标，测定正
19、丁醇的校正因子，以乙醇做内标，称取称取0.1268g0.1268g正丁醇和正丁醇和0.1783g0.1783g乙醇，溶乙醇，溶解混匀后，取解混匀后，取1uL1uL注入色谱柱中进行分析，注入色谱柱中进行分析，测得峰面积正丁醇为测得峰面积正丁醇为108.4mm108.4mm2 2，乙醇为，乙醇为185.4mm185.4mm2 2。计算正丁醇相对于乙醇的校正。计算正丁醇相对于乙醇的校正因子。因子。型液相色谱简介某试样只要求分析其中二甲苯的三个某试样只要求分析其中二甲苯的三个异构体，若选用甲苯做内标，称取试异构体，若选用甲苯做内标，称取试样样0.4385g0.4385g，内标甲苯，内标甲苯0.0530g0.0530g。测得。测得的个实验数据如下，计算各组分含量。的个实验数据如下，计算各组分含量。组分组分邻二甲苯邻二甲苯对二甲苯对二甲苯间二甲苯间二甲苯甲苯甲苯f1.150.7080.8561.00A/mm23.581.380.6830.95型液相色谱简介
