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1、五、离子通道药物筛选五、离子通道药物筛选 (Screening strategies for ion channel targets)I. IntroductionIon ChannelPlay a central role in human physiology1)Help regulate cellular ion homostasis2)Adjust the electrical activity of nerve3) and muscle cells4)3) Control the release of transmitters and 5) hormones.Modulation o
2、f ion channel activity represents an effective therapeutic strategy for a wide variety of disorders.II. Ion channel function1.Form a narrow aqueous pore spanning the membrane that 2. selectively allows the passage of one or a few classes of ions,3. e.g. Na+, K+, Ca2+, or Cl-.4.2. They are gated pore
3、s, allowing controlled, rather than 5. continuous, ion flux.Gating mechanisms: “ligand-binding” (ligand-gated), “voltage-dependent mechanism (voltage-gated) III. Ion channel-related diseaseLong-QT syndromes (遗传性长QT综合症） (K+ )Defects in cardiac K+ channels (occur in only 1 in 15,000 individuals and re
4、sult in cardiac arrhythmia (心律失常)and sudden death).Deafness （耳聋)、Hyperinsulinemia (高胰岛素症) (K+ )Cystic fibrosis (囊肿纤维化) 、Myopathies (肌肉病变) (Cl+ )Hereditary hypertension (遗传性高血压) (Na+)Periodic paralysis (周期性瘫痪) (Na+)Malignant hyperthermia (恶性高热) (Ca2+)【相关报道】【相关报道】美国两位科学家获美国两位科学家获2003年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖IV.
5、Established assay methodsSimple blockers or openers, modulatory compounds.Detect modulation of any of the properties: signal conductance, directionality, ion selectively, gating dependence on the binding of a ligand or membrane potential, and desensitization六、抗六、抗HIV药物筛选药物筛选 艾滋病由一种逆转录病毒引起的艾滋病由一种逆转录病
6、毒引起的1 1）19831983年著名的法国巴斯德研究所肿瘤病毒室主任年著名的法国巴斯德研究所肿瘤病毒室主任蒙嗒尼尔蒙嗒尼尔( (MontagnierMontagnier) )首先从一名患淋巴结病综合症的男性同性恋者的首先从一名患淋巴结病综合症的男性同性恋者的淋巴结中分离到一种艾滋病的淋巴结中分离到一种艾滋病的淋巴结病相关病毒淋巴结病相关病毒( (LymphaenopathyLymphaenopathy Associated Virus) Associated Virus)简称简称LAVLAV。2 2）19841984年美国国立肿瘤研究所的研究人员也报告从艾滋病病年美国国立肿瘤研究所的研究人员
7、也报告从艾滋病病人血液标本中分离到多株逆转录病毒，命名为人血液标本中分离到多株逆转录病毒，命名为嗜人嗜人THTH淋巴细胞淋巴细胞三型病毒三型病毒(Human T-(Human T-LymphotrophicLymphotrophic Virus) Virus)简称简称HTLV-HTLV-。这这两种病毒被认为是同一种逆转录病毒的变种，并肯定为引起艾两种病毒被认为是同一种逆转录病毒的变种，并肯定为引起艾滋病的病原体、把它称为滋病的病原体、把它称为LAV/LTLV-LAV/LTLV-。1、HIV简介简介1986年年7 7月月2525日日，世界卫生组织，世界卫生组织(WHO)(WHO)发布公报，发布公
8、报，国际病毒分类委员会会议决定，将艾滋病病毒改国际病毒分类委员会会议决定，将艾滋病病毒改称为称为人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒( (HmuanHmuan Immunodeficiency Virus) Immunodeficiency Virus) 简称简称HIVHIV。 HIV呈袋状球形，直径呈袋状球形，直径约150毫微米，包膜由一薄毫微米，包膜由一薄层类脂脂质构成，具有抗原性。构成，具有抗原性。HIV有有10%碱基序列不同。碱基序列不同。是是单链RNA病毒病毒，外有核壳蛋白，此外，外有核壳蛋白，此外还有一种特殊有一种特殊的逆的逆转录酶酶，能以，能以单链RNA作作为模模块，转录为双双链DN
9、A，该双双链DNA可与宿主可与宿主细胞的胞的DNA结合然后逆合然后逆转录为病毒的病毒的单链DNA，因此因此感染艾滋病病毒后，病感染艾滋病病毒后，病毒的核酸永毒的核酸永远与宿主与宿主细胞胞结合在一起，使得感染不能合在一起，使得感染不能消失，机体无法清除病毒。消失，机体无法清除病毒。NC：核壳蛋白：核壳蛋白HIV pictureHIV由由皮皮肤肤破破口口或或粘粘膜膜进入入人人体体血血液液，主主要要攻攻击和和破破坏坏的的靶靶细胞胞T4淋淋巴巴细胞胞(T4淋淋巴巴细胞胞在在细胞胞免免疫疫系系统中中起起着着中中心心调节作作用用，它它能能促促进B细胞胞产生生抗抗体体)，使使得得T4细胞胞失失去去原原有有的
10、的正正常常免免疫疫功功能能。当当激激活活免免疫疫反反应的的T4细胞胞几几乎乎全全部部被被HIV消消除除，T4细胞胞抑抑制制细胞胞在在数数量量上上巨巨增增，相相反反病病人人体体内内T4细胞胞在在数数量量上上骤减减，从从而而导致致病病人人的的免免疫疫功功能能全全部部衰衰竭，竭，为条件性感染条件性感染创造了极造了极为有利的条件。有利的条件。HIV是嗜是嗜T4淋巴淋巴细胞和嗜神胞和嗜神经细胞的病毒。胞的病毒。 The Threat of HIV/AIDS in ChinaAccording to figures from the Ministry of Public Health, around 85
11、0,000 people in China have been infected by the HIV virus since the deadly disease was first detected in the country in 1985. The total number of people to develop full-blown AIDS is estimated to have reached around 200,000, only 80,000 and 100,000 of whom are still alive, hiding their conditions fo
12、r fear of discrimination and unable to afford AIDS drugs. In the first half of 2002, reported cases of HIV infection rose in China at a rate of 16.7% compared with the same period of 2001. The World Health Organization has warned that China could have over 10 million HIV/AIDS carriers by the year 20
13、10 if no efficient measures to counter the spread of the disease are taken. According to the Ministry of Health, the sharing of needles among intravenous drug users caused 68 percent of confirmed HIV cases, while unclean blood collecting and transfusions are responsible for 9.7 percent. Another 7.2
14、percent of HIV carriers contracted the disease through unsafe or unprotected sex. The central governments budget for the prevention of AIDS has increased from 15 million yuan in 2001 to 100 million yuan. A total of 1.25 billion yuan in national bonds has been issued to strengthen supervision of the
15、construction of blood banks in western regions of China, where more people have HIV than in other parts of the country。2、HIV life cycle3 3、抗、抗HIVHIV药物设计与筛选药物设计与筛选1 1）病毒与靶细胞结合阻止剂）病毒与靶细胞结合阻止剂（ HIV-gp41, CD4）(invasion) HIVHIV与靶细胞膜表面的与靶细胞膜表面的CD4CD4受体结合。受体结合。该该类类药药物物设设计计的的着着眼眼点点放放在在特特异异性性作作用用于于病病毒毒蛋蛋白白（尤
16、尤其其是是被被膜膜蛋蛋白白）或或靶靶细细胞胞T4T4抗抗原原，病病毒毒结结合合位位点点以以及及能能干干扰扰病毒被膜的完整上。病毒被膜的完整上。HIVHIV病毒病毒利用其表面的利用其表面的gp160gp160蛋白辨认宿主细胞膜。蛋白辨认宿主细胞膜。gp160gp160蛋白由蛋白由gp120gp120与与gp41gp41組成。（組成。（gp120gp120功能为辨认，功能为辨认，gp41gp41功能为伸入宿主細胞膜，結合病毒細胞膜）。功能为伸入宿主細胞膜，結合病毒細胞膜）。 利用药物抑制利用药物抑制gp41gp41的作用，也是目前的一种治疗方法。的作用，也是目前的一种治疗方法。药物筛选策略药物筛选
17、策略寻找特异性结合寻找特异性结合gp41,gp120,CD4蛋白的化合物蛋白的化合物“第三者第三者”插插足？足？SPRVirus adsorption (gp 120) inhibitorsVirus adsorption (gp 120) inhibitorsViral fusion (gp 41) inhibitors2 2） HIV HIV病毒逆转录酶抑制剂病毒逆转录酶抑制剂 (HIV-RT) (HIV-RT)(replication)(replication)病病毒毒进进入入靶靶细细胞胞后后，其其逆逆转转录录酶酶RT是是催催化化产产生生正正链链DNA共共聚聚物物的的关关键键。因因此此，
18、该该类类药药物物设设计计的的最最佳佳靶靶点点为为逆逆转转录录酶酶。目目前前批批准准上上市市的的五五个个药药物物均均基基于于这这一一着着眼眼点点，但但它它们们均均属属于于核核甙甙类类化化学学药药物物，毒毒副副作作用用大大，选选择择性性不不高高，且且有有耐耐药药菌菌珠珠出出现现，故故都都面面临临被被淘淘汰汰的的危危险险。因因此此，具具有有选选择择性性高高的的非非核核甙甙类类RT抑抑制制剂剂是未来抗是未来抗HIV药物的研究热点之一。药物的研究热点之一。HIV逆转录酶（逆转录酶（HIV RT)基本特征基本特征RT是由是由p66和和p51两个亚基组成的异源二聚体，两两个亚基组成的异源二聚体，两亚基亚基N
19、端序列相同，端序列相同，p51比比p66缺少了缺少了C端的端的Rnase H 活性区活性区RT从结构上分为聚合酶活性区和从结构上分为聚合酶活性区和Rnase H 区区两个两个domain，前者又分为前者又分为 4 subdomains-finger，palm, thumb, connection两个两个domain对应对应RT的两种不同酶活性：的两种不同酶活性：RNA- or DNA- dependent DNA polymerase activity 和和ribonuclease (Rnase) H activityp66-in color; p51-in grayRT的功能的功能RT在在H
20、IV病毒生活史中将病毒生活史中将HIV的的单链单链RNA基基因组反转成为双链因组反转成为双链DNART是治疗是治疗AIDS的重要靶标，抑制的重要靶标，抑制RT的活性成的活性成为为AIDS治疗的主要手段治疗的主要手段目前的药物主要针对目前的药物主要针对RT的聚合酶活性的聚合酶活性筛选筛选RT抑制剂的方法抑制剂的方法同位素应用的方法同位素应用的方法有较大的局限性有较大的局限性非非同位素方法同位素方法比色法比色法Colorometry荧光法荧光法Fluorescence发光法发光法Luminescence时间分辨荧光时间分辨荧光HTRF(homogeneous time-resolved fluor
21、escence)闪烁亲和测定闪烁亲和测定(scintillation proximity assay,SPA)SPRRT主要的抑制剂主要的抑制剂RT抑制剂分为两类抑制剂分为两类 Nucleoside RT inhibitors (NRTIs)核苷类核苷类: 10 个上市个上市-AZT, Ziagen, Epivir, Viread, Trizivir, Combivir, Zerit, Videx EC, HIVID, Retrovir Nonnucleoside RT inhibits (NNRTIs)非核非核苷类：苷类： 3 个上市个上市-Rescriper, Sustiva, Viram
22、uneNNRTI非核苷类抑制剂与非核苷类抑制剂与RT结合示意图结合示意图3 3） HIV- HIV-整合酶抑制剂筛选整合酶抑制剂筛选(HIV-Integrase)(HIV-Integrase) 整合酶的基本功能、性质整合酶的基本功能、性质HIV 整合酶（整合酶（Integrase,IN) ： HIV 第三酶第三酶 HIV病毒病毒pol基因基因3 端编码端编码 32KDal 三个结构域（晶体结构均已解析）三个结构域（晶体结构均已解析）基本功能：基本功能： 催化病毒复制基本步骤病毒双链催化病毒复制基本步骤病毒双链DNA 整合到宿主整合到宿主DNA作为治疗作为治疗AIDS靶标优点：靶标优点： 人体内
23、尚未发现该酶类似物人体内尚未发现该酶类似物 B A C 病毒双链病毒双链DNA 整合到宿主整合到宿主DNA整合酶作用部位整合酶作用部位1. 形成整合酶、病毒形成整合酶、病毒DNA复合物复合物2. 剪切病毒剪切病毒DNA 3 末端末端3. 转移病毒转移病毒DNA 4. 剪切细胞剪切细胞DNA5. 连接病毒连接病毒DNA 和细胞和细胞DNA药物筛选方法药物筛选方法SPA: Scintillation Proximity Assay SPABead3H L-731,988 DNAFLAG-integraseBiotinylated anti-FLAG antibodyAmy S. Espeseth
24、et al. (2000) PNAS SPABead主要抑制剂主要抑制剂 aac.asm.org/cgi/content/full/46/10/3301/F1 acids 类类L-731,988.Ryan Reinke et al (2002) A.A.C.Daria J. Hazuda et al(2000) science4 4） Drug Screening based on Drug Screening based on Interaction of CypA and HIV capsidPackaging of cyclophilin A (CypA) into HIV-1 viri
25、ons is essential for efficient replication.Incorporation of CypA into viral particles is mediated through binding to the Gly-89-Pro-90 peptide bond of the N-terminal domain of HIV-1 capsid (CAN) at a CypA: CA ration of about 1:10 .Identification of resides within CAN that change in chemical shift on
26、 binding and catalysis by CypA. CypA (blue) is shown bound to the flexible loop between Pro-85 and Pro-93 of CAN (yellow). Backbone amides of CAN that shift on CypA binding by more than 14Hz are highlight in red. Proline within CAN(1-146) are shown in green.Disruption of CypA incorporation into HIV-
27、1 virions by CSA correlates with inhibition of HIV-1 DNA synthesisJurkat cells were infected with viral stocks produced in the presence of 0,0.5,2.5uM CSA,as indicated. Virions were pelleted from drug-containing medium and used to infect cells in the absence of the drug. PCR was performed and phosph
28、orImager quantitation of products shown . 七、七、 基于基于COXCOX2/5-LOX2/5-LOX为靶点的为靶点的抗炎药物筛选抗炎药物筛选炎症反应炎症反应被被 多多 种种 炎炎 症症 介介 质质 所所 介介 导导 ， 其其 中中 花花 生生 四四 烯烯 酸酸（Arachidonic Acid，AA）的的代代谢谢产产物物前前列列腺腺素素（PGs）和和白白三三烯烯（LTs）是是其其中中重重要要的的两两个个炎炎症症介介质。质。 膜膜磷磷酸酸酯酯经经由由磷磷酸酸酯酯A2(PLA2)产产生生游游离离的的花花生生四四烯烯酸酸(AA), 环环加加氧氧酶酶(COX-
29、1和和COX-2) 将将AA转转化化为为前前列列腺腺素素G2 (PG2), 接接着着将将其其产产物物转转化化为为前前列列腺腺素素H2(PGH2), 组组织织特特异异性性的的同同功功酶酶将将PGH2代代谢谢为为前前列列腺腺素素的的其其它它形形式式或或血血栓栓烷烷A2(TxA2)。同时。同时, AA在在5-脂氧酶的作用下代谢为白三烯脂氧酶的作用下代谢为白三烯(LTs)。 COX1COX1：主要存在于胃、肠、肾和血小板中，主要存在于胃、肠、肾和血小板中，具有维持细胞内环境稳定性具有维持细胞内环境稳定性 COX2COX2：是一种分裂素诱导的环氧酶的异构酶，是一种分裂素诱导的环氧酶的异构酶，主要存在于炎
30、症细胞中，可促使炎症反应及组主要存在于炎症细胞中，可促使炎症反应及组织损伤，因此，织损伤，因此，由由 COXCOX2 2催化合成的前列腺素催化合成的前列腺素类被认为是诱发组织损伤及疼痛的主要因子。类被认为是诱发组织损伤及疼痛的主要因子。5LOX催化途径COX2 抑制剂的筛选方法抑制剂的筛选方法化学发光法Cox-2筛选方法 (Cayman) 可用于Cox-1,2的抑制剂筛选：利用亚铁血红素催化的绵羊环氧化酶的氢过氢化物酶（hydroperoxidase ）活性，在发光氨型的环化naphthalene hydrazide 和底物花生四烯酸存在下，产生化学发光。5-LOX 抑制剂的筛选方法抑制剂的筛
31、选方法5-脂加氧酶(5-lipoxygenase) 属于脂过氧化酶家族，在动物和植物界都有表达。5-LOX分子约有672或673个氨基酸，分子量7280KD.5-LOX的晶体结构至今未有报道。由于5-LOX的酶活性要求其分子中的铁原子为3价形式，所以在体外该酶很容易失活。因此有人使用细胞裂解液直接加底物。但没有一个通用的可靠测活方法。LOX家族的其他成员，如12-LOX,15-LOX的酶活可以通过测量共轭双烯产物在236nm的紫外吸收得到，而人5-LOX在236nm有相当强的背景吸收，因此不利于定量。有文献报道，通过测量5-LOX催化花生四烯酸的过程氧气的消耗量来测定酶活。 此法因实验设备而异.(e.g Gilson model 5/6 oxygraph+Clark 电极恒温槽） 另有细胞水平的测活方法。
