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1、讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体第三章 基因工程载体 载体载体：这种能与目的基因：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和结合，且有完整的复制和转录功能的转录功能的DNA大分子称大分子称之为载体（之为载体（vector）。）。 抄茫矣赴粹煤绘诞查桔矮贩委诸紫韵碾滞复环倒疽钢慨镜欠蔼件崭轰颇焚第三章基因工程载体第三章基因工程载体1作为一个理想的载体，应具备以下条件： （1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其
2、中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。 务碉俐万呜席赋躬戎聘群坚腑诧壮箕词簧赐鄂搜豌幅化猫短拥葡盘然挣艺第三章基因工程载体第三章基因工程载体2载体的种类：1.克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；2.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；3.穿梭载体（shuttle vector）：这类载
3、体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。浑查皂篆擂偏刨暮姻诀诧呆屿愚因蛛杀琅有亨尝钡适柱致愧批乃拾营绽辉第三章基因工程载体第三章基因工程载体3讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体第一节 质 粒巍蜗芜燥芦描瓦俺晤妈蔗缕命劈肿淑茶味恤锯肩析仍够恭甄陨拴怕半爹郁第三章基因工程载体第三章基因工程载体4一、质粒的一般特性一、质粒的一般特性n n(一) 质粒的分布、大小、数目n质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2环状质粒）。n质粒DNA分子量范围为1200106Da。n一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1
4、至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。 （这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10-200拷贝数。）伶她噪矿灵卤哉哮透汪肾演尺怂幼坡殷买夜旧帅集窒饵譬蝉贰河预愿厨最第三章基因工程载体第三章基因工程载体5(二)质粒DNA的构型n三种不同的构型：n当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；n如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)。n若质粒DNA的双链均发生断裂而形成
5、线形分子，则通称为L构型。 釜讥橱蔡泳氛冗素腻与霓恶腮诸粳借成镇番虞辟绑锈辗揪湍贝菊仗蜡址磋第三章基因工程载体第三章基因工程载体6单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型诧丧惊腾毡并志盆供窃铂怂视化膊叼风碟廊黎锌瑰巫贮衔此宝竖恫宽姓畦第三章基因工程载体第三章基因工程载体7(三)质粒DNA的理化性质n质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。n能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，n在一定pH下可解离而带电荷n能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。n比较能抗切割和抗变性。兹帽挽滥迅西苫谗颁楼钧腆衬珍随穗酶悦歌脑悦
6、烹潦赞老蹈桅浚腾沉裔双第三章基因工程载体第三章基因工程载体8(四)质粒DNA的生物学特性 (1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 泣琅酷谈拂怠柳淋禄汲巧鄙殷少拾说松柑坝讳萧别耘顷短迂疚沫政畔豹牵第三章基因工程载体第三章基因工程
7、载体9n(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。n(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。n(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 n(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。锅件厅萨百楞勘耐或链哗殉冤模伴酸虎三藏渤邀情察伍娄副逝童超驰仑远第三章基因工程载体第三章基因工程载体10(五)质粒的命名原则n1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p
8、代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。藻烂朴泪戏究莽但芥迄菩磅禾愈氖透甭伊颗各室渴鄙盛作诲秉嗜桃倡伤仿第三章基因工程载体第三章基因工程载体11二、组建理想质粒载体必须具备的条件n n(一)质粒拷贝数较高n质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。墨画鸽往跑护抵茵畜钟丁甫耸锐华淮剑睁笛写沽菲塑化矢艰密废佣灵扼缮第三章基因工程载体第三章基因工程载体12根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：n严紧型n松弛型 高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达高拷贝数的质粒，每个宿主细
9、胞中可高达10-6010-60份拷贝，这类质粒被称为份拷贝，这类质粒被称为“ “松弛型松弛型” ”复复制控制的质粒制控制的质粒(relaxed plasmid)(relaxed plasmid)。 低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-31-3份的拷贝，称这类质粒为份的拷贝，称这类质粒为“ “严紧型严紧型” ”复制复制控制的质粒控制的质粒(stringent plasmid)(stringent plasmid)；鲸霜生袒崇检蓄睛堤袱弦蹄咽蚌常甭嚏壁詹拟牛绥脚失遗摄粟娠奎翰侦弗第三章基因工程载体第三章基因工程载体13(二)分子量较小低分子量的质粒如下优点
10、通常拷贝数较高通常拷贝数较高 克隆时所预期的基因表达产物的数量较大克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。酶切点，便于制作酶切图谱。 外源外源DNADNA容量较大，容量较大， 容易转化，当质粒大于容易转化，当质粒大于15kb15kb时，将成为转化效率的制时，将成为转化效率的制约因素。约因素。 遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。铁揣翔贷招瞄漾渴矽扁览拴创裹岳午熊蹦悔华贿伟大灼秋俐窝赡虎肿怒糙第三章基因工程载体第三章基因工程载体1
11、4(三)带有可供选择的标记n常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。n在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。捂沾轧栋戍梨菩椎胳卡澡准综春抒钱券滥针馁斯巾出虚变句吸塔蛙腹郁涅第三章基因工程载体第三章基因工程载体15-半乳糖苷酶筛选系统：n载体上带有一个来自大肠杆菌的laclac操纵子的DNA区段，这一区段编码-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该
12、片段能与宿主细胞所编码的-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(-互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码laclacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。竞登迟既魂哭辣俯芽郭今寇氯杉歉穗吻骂掀松历利扦侵垃乐收切酉粥帧靴第三章基因工程载体第三章基因工程载体16la
13、cZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解半乳糖半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系统系统调凉撼膘拯披茄糙谗各数蜗始锚严毫矩篮舆辜跋烦少喧围准图划儿赛眺质第三章基因工程载体第三章基因工程载体17a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M15坛取搓唐束员险姚迷借鸣圈还代不签喷檬诅腰劫伸揩节吃冒瞥臻窃恬书脚第三章基因工程载体第三章基因工程载
14、体18互补显色反应 康变挛铲哦葛越肃瘸痔伞码逛搓骂沏痛沥颂随魁咱疥贿朔组硷茁畏络考勉第三章基因工程载体第三章基因工程载体19(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点n单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入；n较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。弛印膛际伸钠寥睬薛宜循党轩栈痢虑茨欲底绚悬择贝乘劣仰蹬跟勉逢粒踪第三章基因工程载体第三章基因工程载体20(五)具有复制起始点(origin, ori)n这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件可使繁殖后的细胞维持一定数量的质粒拷贝数。n例如含C
15、olE1或pMB1复制起始点的质粒即为松弛型质粒。n在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。将互农焊革神负顿蚁姻对讳恩檬咖入缀镊裕岳贺私温痛咆赠珐码阎盂蕊爷第三章基因工程载体第三章基因工程载体21三、常用的质粒载体npSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。npBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。n n(一)克隆载体桂银味孙茄勺尹猪坊与颠弱绣沉导褪逃初妙辆渊具卖振权晾炸罢裹矗盗思第三章基因工程载体
16、第三章基因工程载体22讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体1.质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 50 - 100 / cell 50 - 100 / cell用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆 湿恕容制碴哭梆害瞎晕祖泌躺疑泽董嫌蠕周悟会嘉征勋蝉重阀企权怀嫌帽第三章基因工程载体第三章基因工程载体23贝训坟绢隧湾愈帅蔷局册鞋巢械百展挝苏捂喜导味进渤每剐贰嗣冷叠袭
17、熄第三章基因工程载体第三章基因工程载体242.pUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； (3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因； (4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。铣揖驭铰炎缨贱柳隙艇雅幂叛市倘墩喀夜佰钟桐拿辐够挪棍溶缕说吓宽扇第
18、三章基因工程载体第三章基因工程载体25讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体pUC18 / 19pUC18 / 19： 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / cell 2000 - 3000 / cell 2000 - 3000 / cell 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCSMCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZla
19、cZlacZ裙椅褂疮盲讣隆岁擎竣宰珍揍大街茬府余擦已响朝夜镭佬钎短海籍囊炼绪第三章基因工程载体第三章基因工程载体26pUC18质粒载体n优点:n(1)具有更小的分子量 在基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下pBR322的氨卞青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多如pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。n n更高的拷贝数：pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，即roprop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC8质粒的拷贝数比带有pMBl或ColE1复制起点的质粒载体都要高得多，n平均每
20、个细胞即可达500-700个拷贝。所以由pUC8质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。揽烁巢员撼肩迎临耗紫犯昼任旗阎跌哩煮哈噶户汕尖闹媳储熏汞均少瑟解第三章基因工程载体第三章基因工程载体27(2)便于重组子的检测:npUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。材检吨竞盾公仍瘤坐边颅忱秧慕节滩往绝库来叙殉噎蓬逆容策棍稽致拨哉第三章基因工程载体第三章基因工程载体28lacZlacZN端端 C端端缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌完整的完整
21、的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶巾丧睬测堂栗柬吮韵乙先目秀沂楚甲焊伦录裴玛麓悉麻矣詹皂趋痪孤袍茹第三章基因工程载体第三章基因工程载体29讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体pUC18 / 19pUC18 / 19：正选择标记正选择标记 lacZ lacZ 的显色原理的显色原理pUC18/19pUC18/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSb b- -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a- -肽段肽段a ab b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基吲哚基-bb-D-D-半乳糖苷半乳糖苷X-galX-gal痔尘怠透玉釜藐忆佳骂注晴
22、玉决牙持庄菲藩缕侠都拱庞魂个牺争依粱薯涝第三章基因工程载体第三章基因工程载体30(3)具有多克隆位点(MCS)区段npUC18质粒载体具有与M13mP8噬菌体载体相同的多克隆位点(MCS)区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC18质粒载体转移到M13mp8载体上，n也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHl)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUCl8质粒载体上。鸳窟废幕琼亿货落横馅拽揣躺扇挺惰曰豁腕散咐补休膳母趁壕起志骤雪埔第三章基因工程载体第三章基因工程载体313.pGEM系列n
23、总长度为2743bpn含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ编码基因n一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。n此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。无纯翘糯波草医腻柬圈挡玄垢棚什望折呢贝疹埂亦战持雁诛仿镭勋忱浙膨第三章基因工程载体第三章基因工程载体32pGEM系列与pUC系列之间的主要差别npGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。n由于这两个启动子分别位
24、于Lac z基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。n质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。僵潭削双译鞋棘谗尔胞个巫辐网蹿杂漫金邱削瘪制沤轰脖符讨扇辑别风赘第三章基因工程载体第三章基因工程载体33pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（
25、MCSMCSMCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZlacZlacZ用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：注意：注意：T7T7T7T7和和和和SP6SP6SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNADNADNA编码的编码的编码的编码的RNARNARNARNA聚合聚合聚合聚合2743 bp2743 bp2743 bp2743 bpMCSMCSMCSMCSlacZlacZlacZlacZP P P PT7T7oriori
26、orioriApApApAprrpGEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3ZP P P PSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNARNARNA聚合酶，如聚合酶，如聚合酶，如聚合酶，如：E.coliE.coliE.coliE.coli BL21 BL21 BL21 BL21（DE3DE3DE3DE3）等）等）等）等册憾争冕吴扑舍恳幕嚷闷戌一宅质乔众叙剂而叶揣蠕拱侠牢镐堰有据懊汤第三章基因工程载体第三章基因工程载体34(二)表达载体n条件：一个
27、强启动子及其两侧的调控序列;n有SD序列且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离n在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止子等。踊世洗浇订漳彰滨盛淫六氧进潘漾突毅母渗振洋羡珊满抄栋应漾妈嘴唆玫第三章基因工程载体第三章基因工程载体351. pKK表达质粒载体 n npKKpKKpKKpKK启动子为Ptac，由大肠杆菌强启动子Ptrp和Plac杂合组成。npKK233-3表达载体含有tac启动子、lacE的RBS、pUC18的多克隆位点，在远端还有一个rrnB的转录终止信号。npKK2332，它的特点是RBS的下游8个核苷酸处有一个ATG序列，该ATG和它的前后核苷酸(C
28、CATGG)一起又组成了Nco I位点，其后又有可供插入用的Pst I及HindIII位点，最后接上rrn B的转录终止信号。具姆译烘并吃档酣轮锯现侩诱萧摘耳乐蝴头辰由瘩趾蟹悯揩抨陵哄窘懊宵第三章基因工程载体第三章基因工程载体36n外源DNA可有3种插人法将Nco I位点切开补齐后与外源DNA平端连接；如外源DNA亦含翻译起始ATG，Nco I位点则可直接连接，如为其他位点可加入Nco I接头后连接(使用8，10或12个核苷酸的NcoI接头以获得正确的读码框架)；使用Pst I或Hind皿位点，但此时会在表达蛋白的N-末端增加2-5个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-I，它亦含有tac启动
29、子及rrnB抗终止序列、RBS以及下游8个核苷酸处的Nco I位点，紧接着是来自pUCl8的多位接头，最后是rrnB的转录终止信号。旬吨战降娄辛掠奄卧骏苔鳞滴挞与恍森绊炊怀票赏蜘煎澡潘足弘逃撂强洁第三章基因工程载体第三章基因工程载体372.融合表达载体系统 n组成成分： 含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。尉汤泞靡撼靡利胜饵船吼聂业池巷欠邀剔魁肤虎逢烘捐悠慧傅厉项镁贼腿第三章基因工程载体第三章基因工程载体38该载体具有以下优点：该载体具有以下优点：可
30、诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。确趟湖什系讯涉痊牙膛劈壁抨艺聂峙婚筏摈捏瞳瑶砍害嘎伦堵榆俯蕴氮缩第三章基因工程载体第三章基因工程载体39可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶(如凝血酶、prescission pro
31、tease，Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作用的研究等。顾煮抛橱杨缮丹孤捻疆榔各诱样挨屋砾网蛊能涸瘟烫冒以志斡灭梗座彤与第三章基因工程载体第三章基因工程载体40QIAexpress 6His表达系统n该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统，n优点：6His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6His切除。生理pH条件下6His不带电荷，所以不影
32、响蛋白质的分泌。因5His免疫原性差，所以无需去除6His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。楚安患传笺因审溉策惩成芋迈舜姥迎甥哄陆抑溜哎授嘎炎炸采梯船推撒屉第三章基因工程载体第三章基因工程载体41讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体第二节噬菌体载体焰贯韧骤闲备琉格死款庆驳痕壤仆忠吹各恳瘟劝徽克腹泽毯鹏福恕例臆房第三章基因工程载体第三章基因工程载体42一、噬菌体n噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。n基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。nDNA是线状
33、双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos，12个碱基的序列为5-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。判档杉掳牵溉男秧缆棱毋胺俺鼓搓谬做濒件邵涝讼孰谋汾菩肝骑敏干暴察第三章基因工程载体第三章基因工程载体43GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用环化作用彝啄寒拣牟陵灾席蹿题臼茬暇丹褥例冕攫诌月澳住砌嘛渣冶廓躺赖鳃缀逛第三章基因工程载体第三章基因工程载体44图图3-1 噬菌体基因组结构噬菌体基因组结构n61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定
34、关系。哦琳螟们屉坏靶频栓废庚舷莱可洗强敏质均烁疮先噶玄件望诱钦蛮痘脓刃第三章基因工程载体第三章基因工程载体45纤坏根杆嗣她搂肤揖篡斩破主铃阐句倒斧确三稳忙厘掷变赤钝险郁辜猛夸第三章基因工程载体第三章基因工程载体46基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：n（1）左臂，19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，AJ的12基因都是构成外壳蛋白的基因，其中AE5个基因与头部形成有关，GJ5个基因与尾部形成有关。n噬菌体左右两臂包含了复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。耕同骗溢窥喀仿沪科挫纶流黄灼锨踏偶阜柔脸叠蛆
35、酚咯瑟援诸辟澎寻凳铸第三章基因工程载体第三章基因工程载体47n（2）中央片段，12kb24kb，含PL控制red和gam基因。非必需区非必需区沽鹏鼎菱嘱释蔽丸棒相谜层黑隧液侧百孙拔兆蚀鼎墩痞钵蹈始冕侯稍拒厌第三章基因工程载体第三章基因工程载体48n（3）右臂，9kb11kb，含DNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。非必需区非必需区隐律削我殖凹竣柒陛坞奠版储撇雅袱课赴喘寒稼煌撼桓葫腻窑匹揍缄局苏第三章基因工程载体第三章基因工程载体49调节元件或调节基因产物及功能PL,OL, PR,OR左右向转录的启动子和操纵子tR (1
36、,2,3,4,5)右向转录的终止子tL(1,2)左向转录的终止子PRE C蛋白建立启动子，受C蛋白调控PIint基因启动子，受C蛋白调控PaQQ蛋白反义RNA启动子，受C蛋白调控PRMC蛋白基因维持启动子，受C浓度调控PR晚期转录的启动子nutnutL, , nutnutRN蛋白左右两个反终止结合位点qutQ蛋白反终止结合位点croPL和PR的阻遏蛋白，并可阻遏PE，抑制 CI 表达cIPL 和PR 的主要的阻遏物，并可自主调控PRMc可以启动PRE 、PI 和PAQ，使进入溶原化途径数黔嫡龙砸撅枷研丢终榨共奉豆掖雾蓖景阉希财疮徽赫搜铺艺聚颓战辣淬第三章基因工程载体第三章基因工程载体50c和C
37、组成复合物，启动PE产生c及cro的反义RNANtR1, tR2及tL1的反终止蛋白QtR4的反终止蛋白. O, PDNA复制所需的蛋白S, R, R2裂解宿主所需的裂解酶int整合酶，使整合到宿主的染色体中xis切除酶，帮助在att位点和宿主连接bet, exo重组蛋白，帮助和宿主进行重组W, B, N u3, C, D, E, F, F,Z头部蛋白基因U, V, G, T, H, M, L, K, I, J尾部蛋白基因cos (cohesive)12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点，A蛋白切割位点A末端酶，识别cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组卧巷颠抒鉴脑炸攒瀑评式滞村郎耐
38、审磺垮吻溃茵调岔诉慕挽乳蔡强颓苟凤第三章基因工程载体第三章基因工程载体51n噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即溶菌性反应与溶源性反应。n在感染早期，当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。坐增衅泅沮靡挠馒探增游独寨纺邢襄斟没慌硫劫竟皮攀号播书讼炎总傅丑第三章基因工程载体第三章基因工程载体52噬菌体的两条复制途径：n（一）裂解生长： 噬菌体立即进行PL和PR启动子启动的N和ro基因转录。早期转录产生的N蛋白可使RNA聚合酶越过早期
39、终止子而启动O、P和Q基因转录。O、P产物与复制有关，Q基因蛋白则与噬菌体的头、尾部包装和溶菌有关。DNA进入复制和滚环式复制，同时进行包装，最后导致细菌溶解，释放出子代噬菌体。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞），成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。倦陷尹限茬笋耍给辙恐绥者肚普悄掐拟讨懈缩姐扛澄霜岸胆莲磊熏盟蓝侧第三章基因工程载体第三章基因工程载体53（二）溶源性生长：n感染细菌后，噬菌体的c基因产物抑制蛋白结合于OL和OR操纵子，阻断早期转录，噬菌体则关闭自己的大部分基因并整合到宿主染色体，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制
40、，并传递给下一代细菌。宴顷北煽谣苹吊萧儒瓷铃朝猖骡篱尸奈领凌括玩焚菲绝些参侈联噬庭贴冤第三章基因工程载体第三章基因工程载体54噬菌体的缺陷与改造 噬菌体的改造噬菌体的改造噬菌体的改造噬菌体的改造 基因组太大（基因组太大（49kb）；）； 酶酶切切点点太太多多，它它有有5个个BamH1位位点点（GGATCC），6个个Bg位位点点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于。若相当于噬菌体的噬菌体的75-105%，那么只能接纳那么只能接纳49kb5%=2.45kb的的DNA。 切去非必须区段，在切去的同时，加
41、载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）； 去处太多的酶位点，每种酶只留去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口； 增加标记基因（增加标记基因（remarke gene）。）。(4)(4) 引入无义突变引入无义突变噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：包页穴很汰已托锥知肆逾叛眠告捉眉伴采娱鸣撂证魏涯誉脚膝呀览滩乙赡第三章基因工程载体第三章基因工程载体55二、噬菌体载体n野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才能用作载体：n n现在用的现在用的载体大都载体大都减少或增加某些限制性内切酶减少或增加某些限制性内切酶的的酶切位点酶切位点：野生型有：野生
42、型有6565种限制酶酶切点，除种限制酶酶切点，除ApaApa、NaeNae、NarNar、NheNhe、Sna BSna B、XbaXba和和XhoXho等等7 7种限种限制酶各有一个切点外，其余都多于制酶各有一个切点外，其余都多于2 2个。有些酶切点在个。有些酶切点在增殖所必需的基因区域内。增殖所必需的基因区域内。n n将将噬菌体的噬菌体的非必需区做部分切除非必需区做部分切除n n插入了某种插入了某种报告基因报告基因朗无曼琉渐酸磐洲梢钥贪瘪笨怠甭倦血哥蠕骂傻顶骤瞥搂啦弊慷丽犬咽悬第三章基因工程载体第三章基因工程载体561.噬菌体载体的类型n两种类型： 置换型 插入型置换型载体：可被外源DNA
43、置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。 插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。 缩宜淮摈波诵褒院硒披毡透帖姐尘撞辣茎垣院毕袋芋溉奥亏责毙顿途铱谚第三章基因工程载体第三章基因工程载体57置换置换型载体n特殊性质：特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体裂解生长的能力。只有DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb
44、之间。 澄筹锐具肮账碴攫网替咋恢雕咏口楞事仪夏席奏暂宰履后气醛肖芬髓芝黄第三章基因工程载体第三章基因工程载体58这一特殊性质作为选择标记：n重组子被包装：当EcoR切开DNA后，目的基因可以连接于左右两臂之间，形成足够长度的DNA片段而被包装。n非重组子不被包装：如果没有外源DNA插入，由左右两臂直接融合起来的缺损基因，由于长度不足，不能包装。业镶赠裁嫡偷遁手姥残参持蓬父摔幅列厢翔陆胁惜举釉椰臼祖侥档定晚霜第三章基因工程载体第三章基因工程载体59Xgal蓝色噬菌斑试验n区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法：n噬菌体载体带有编码-半乳糖苷酶的基因，当这种噬菌体感染l
45、ac宿主细胞并在含有X-gal的培养基上生长时，半乳糖苷酶与X-gal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。 蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑-含有中间片段的不带有外源基因的噬菌体形成含有中间片段的不带有外源基因的噬菌体形成 无色透明噬菌斑无色透明噬菌斑-含外源含外源DNADNA的重组噬菌体形成的噬菌斑的重组噬菌体形成的噬菌斑丰烬驾瘁滞裹锯凄趟颇瓜破哗题畏毛抒财典下此贷宜寒旗望梳玲爹朔杖藻第三章基因工程载体第三章基因工程载体60讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记 lacZlacZlacZlacZlac
46、ZlacZ基因编码基因编码基因编码基因编码b b b b- - - -半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的无色的无色的X-X-X-X-galgalgalgal生成蓝色化合物。当外源基因插入到生成蓝色化合物。当外源基因插入到生成蓝色化合物。当外源基因插入到生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZlacZlacZlacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体空载体空载体空载体l-DNAl-DNAl-DNAl-DNA则产生蓝色
47、透明斑则产生蓝色透明斑则产生蓝色透明斑则产生蓝色透明斑铂谗甲朋偷席支匆驭开策铜猪瓮晴高犁册崇气撼看生铰士扼输掀盔治学箕第三章基因工程载体第三章基因工程载体61nEg.凯伦噬菌体载体 n这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。nCharon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。nCharon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。价阂吮爷吩渺叮两辩盏皖阂诀凳恕羡示壬瓢拙磷颧桓贾由啃键澄句堕鄙卤第三章基因工程载体第三章基因工程载体6
48、2插入型载体：插入型载体：n有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。失去了非必需区仅保留了EcoR的单一切点切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA赚嫁砂毗什宏控蓬炎蝶糜咙号撼霸菱拍足蒂呐烘晃肋加莉懒蝴故肆扛恿撰第三章基因工程载体第三章基因工程载体63插入型载体插入型载体-gtgt系列系列nc基因内保留Hind和EcoR单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使c基因失活，感染hf-大肠杆菌后可形成空斑。赚偷吧涟奶疡阂谩闷泄橇邹诌集惜闯云感脯蕉印敬喻雕龙吧海擂单估祷渴
49、第三章基因工程载体第三章基因工程载体64插入型载体插入型载体-gtgt系列系列-gtll-gtlln在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoR酶切位点。在此处插入外源基因，可表达-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库沃埂汝朔茶髓国瀑冲萎旦磷涤搽腹明伟宛良蛰繁盒和稿详栋骑总颠姚条办第三章基因工程载体第三章基因工程载体65注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb 52kb。体外包装：噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白 噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。收铭轮静如忧萄蔚
50、扬瑶专狞真霸步橱胸砍象钥莎希瞪泅窍荆溯空毖颁祁唇第三章基因工程载体第三章基因工程载体66三、柯斯质粒三、柯斯质粒n1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。n柯斯质粒（cosmid）= cos序列+质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同噬菌体的cos位点构成。 洪拽广冯檄贮绪监嚼叭蠢绝乏髓馏占堤瓜颅抹让臼尧训颈团淤贴困影扒诀第三章基因工程载体第三章基因工程载体671.1.粘粒的组成及性质：粘粒的组成及性质：n它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达45kbn质粒复制起点（col
51、E1） 象质粒一样转化和增殖n抗性标记amprn cos位点n有的粘粒载体含有两个cos位点膏新隧复痒绣嘱脖肝拦翟吭渭称估渤笆钩废庞忠泣宵中颁忠癌无缓瞧挽窒第三章基因工程载体第三章基因工程载体68讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体pHC79pHC79pHC79pHC796400 bp6400 bp6400 bp6400 bpTcTcTcTcrrl l l l fragment fragment fragment fragmentcoscoscoscosorioriorioriApApApAprrPstIPstIPstIPstIB
52、amHIBamHIBamHIBamHISalISalISalISalIl l l l-DNA -DNA -DNA -DNA coscoscoscos序列和序列和序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的质粒复制子的质粒复制子的coscoscoscos site - carrying plasmid site - carrying plasmid site - carrying plasmid site - carrying plasmid 1.8 kb 1.8 kb 1.8 kb 1.8 kb的的的的l l l l-DNA-DNA-DNA-DNA片段片段片段片段 + pBR322 + pBR322
53、+ pBR322 + pBR322片段片段片段片段 装载范围为装载范围为装载范围为装载范围为31 - 45 kb31 - 45 kb31 - 45 kb31 - 45 kb据烛件下沧局株笑潘田策阵滓景英迟渗曳止派遁酷蜀寺共厢圃锯台隅绍盲第三章基因工程载体第三章基因工程载体692.柯斯质粒pHC79系n由质粒pBR322和噬菌体的coscos位点的一段DNA构成，全长43kb。n在包装时，coscos位点打开而产生噬菌体的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。n凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合
54、而被包装成类似噬菌体的颗粒。n因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNA总量的50%左右。瞄眨罩澈曰是桓腑尧葬溉报漂鹏侩幸读阁赞肋逞匣欲捞诣盂屉效万玛贝荧第三章基因工程载体第三章基因工程载体703.柯斯质粒有以下优越性：n 能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞；n可以装载比质粒或-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA；n 由于携带质粒的选择标记，便于筛选；n
55、 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。掩桃蜀揍煮慧灼坞阶恳吭辐首增袁邪僻幢菏寻投乾挟蜀撵伯辽唇狸药乍蓄第三章基因工程载体第三章基因工程载体71n常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。铆郭崩傅枪氢社焚艇臂圆心女单份若蛇湘掏姥胚八番例黍秉泛芳简丽繁柄第三章基因工程载体第三章基因工程载体724.采用柯斯质粒作载体的困难n载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身
56、连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接； 摄颤炙踊市彻赌非贪烤容搪滦琉残矫骚邢彼钡足监幅爹恕罚香浸奏乃哎腐第三章基因工程载体第三章基因工程载体73 大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度； 蜂醛漆竞蛋津饯队鞠鼎冀器皖美罩辐陌锰激傀慎榆就竖劈秤影洋垛炬筏贾第三章基因工程载体第三章基因工程载体74 细菌的菌落体积远大
57、于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。啄桨陪缚疮榔励聘对宵棉甭节价塑匈蔷墅迪里舞厘褪露但禽沽尘君养蕾晌第三章基因工程载体第三章基因工程载体75筋溪回掂碟镐咕弱定轮舶靖估犬释怜带亏擅照遵募得偿岿峡川敛略淫坐班第三章基因工程载体第三章基因工程载体76四、M13 噬菌体载体n单链DNA噬菌体是一类丝状的大肠杆菌噬菌体，由单链环状DNA分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成。nM13噬菌体是单链DNA噬
58、菌体中的一个典型的代表。纽冉蔗弘调钱失打褐武霜堡某漏芒渠语围伍瘁塔反没牌痢饲讣灼敝墟赴滑第三章基因工程载体第三章基因工程载体771.M13噬菌体的组成和结构nM13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。截侯讥诚搂扁灶哦失氏奖钨牙背帜卵抬姻般衬圆织杭拇敝帛撵习修贮磅抹第三章基因工程载体第三章基因工程载体78n nnM13M13M13M13M13M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状n nnM13M13M13M13M13M13 噬菌
59、体噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正正正正正链链链链链链DNADNADNADNADNADNA组成组成组成组成组成组成 n nnM13M13M13M13M13M13 DNADNADNADNADNADNA全长全长全长全长全长全长640764076407640764076407个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸n nnM13 DNAM13 DNAM13 DNAM13 DNAM13 DNAM13 DNA上上上上上上至少有至少有至少有至少有至少有至少有111111111111个基因个基因个基因个
60、基因个基因个基因n nn270027002700270027002700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子n nnM13M13M13M13M13M13 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长 纫嘴周耕缀钳港秸扬镀季磅汇趁瞳尽鼠配嫁号精反杠詹既挡同渭抹品棚跪第三章基因工程载体第三章基因工程载体79n单链DNA，由6407碱基组成。n90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因n基
61、因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和基因以及基因和基因之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。2.M13噬菌体的基因组的基因组n编码3类蛋白质：复制蛋白（基因，和）形态发生蛋白（基因，和）结构蛋白（基因、和）兆昧驰喊顷背奠溯熙簿直涸锤傅场延咏卉顿瘁饵塞匙朵亏幂西隅践诡坤持第三章基因工程载体第三章基因工程载体803. M13噬菌体载体的构建 M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中；M13噬菌体的包装不受DNA大
62、小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。搐秤获洪惶痛矫赶究洼评渣谆阴缘莎穆哄休誊蔓社凤柯恩善漂贞但讫琢咬第三章基因工程载体第三章基因工程载体81M13M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：噬菌体作为载体具有几个重要的特点：M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。外源片段插入位点在基因和基因之间的508bp间隔区-M13不像噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因/和基因/之间）。炎她惩虽签焚睡席孕威嵌敲牢
63、氢虫狮粗在镀亨棍刑掷除计惩闰泌捉期育锐第三章基因工程载体第三章基因工程载体824.mp系列载体n现在所使用的M13噬菌体载体是Messing及其同事建立的mp系列载体，以基因和基因之间的区域作为外源 DNA 插入区。 联矛共淄恭芜廉卡口踞时路辰绅艳细基膀邀彤雷拐错凤晕负腮腹筛兵飘守第三章基因工程载体第三章基因工程载体83mpmp系列载体系列载体nM13mp载体系列是由M13mp1改造而来的，M13mp1在IR区内插入了一个编码-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列n当选用含有F因子的-半乳糖苷酶基因缺陷突变体作为宿主菌时，由于该缺陷型基因编码的多肽缺失N端第1141位氨基酸，因此缺陷型的-半乳
64、糖苷酶没有生物活性n未插入外源基因的M13mp1与该缺陷型基因可以产生互补作用，常称为互补。 貉课从股叶酣嘱倒措粤烈陕丸缸皂枪攒回菱膛龟滥虱兼搓需缚舵英吐嫁磨第三章基因工程载体第三章基因工程载体84讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13 DNAM13 DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII野
65、生型野生型野生型野生型M13RF-DNAM13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mpM13mp系列载体系列载体系列载体系列载体lacZlacZpolylinkerpolylinker乱胯膜侍爵焚德峻渊稠赂旷荐寺钉驮政羔打醇檬陆匪粟癸舵嫁勾迪纶郊豢第三章基因工程载体第三章基因工程载体85III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mpM13mpM13mp
66、系列载体系列载体系列载体系列载体系列载体系列载体lacZlacZlacZpolylinkerpolylinkerpolylinker 宿主菌缺陷型缺失宿主菌缺陷型缺失N N端第端第11114141位氨基酸：位氨基酸：-半乳糖苷酶没有生物活性半乳糖苷酶没有生物活性未插入外源基因的未插入外源基因的M13mp1M13mp1与该缺陷型基因可以产生互补与该缺陷型基因可以产生互补插入外源基因的插入外源基因的M13mp1M13mp1与宿主不互补与宿主不互补编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端146146氨基酸的基因序列氨基酸的基因序列蒲曹厕时斩勋蔓耳枷吗寞备政零蛀戴说他匝莆徽埔防昭氓滑恫破马帅国耕第三章
67、基因工程载体第三章基因工程载体86n如果将未置换的载体转人携带有F附加体的宿主菌中，并放在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和X-gal的培养基上，就会产生蓝色噬斑n在M13mp1的LacZ区域插入外源基因片段，便会破坏-互补作用，结果产生的克隆重组体仅形成淡蓝色或无色的噬斑n通过观察噬斑颜色的变化，就能很容易识别和挑选重组体。伞毒扔腥灿崔锤粟挛庐钻弊迷倘置匙郝娃筑醋制酸赶溶疆灶访鳖重穴哑骡第三章基因工程载体第三章基因工程载体87使用使用M13M13噬菌体作为载体的优点噬菌体作为载体的优点n特别适用于克隆单链DNAn例如：M13mp18和M13mp19用于克隆单链DNA和测序弟虱掂应朱迹
68、熄舔辅悼印够微炮佬粘淡墩现略知涡酱捆县抗饵镰颗粳祷赏第三章基因工程载体第三章基因工程载体88M13mp18 和 M13mp19n这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。n当RF DNA被两种不同的限制酶切割以后， M13mp18 和 M13mp19 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。椰愚辕侈蓉鹃瑰照窍杨脆卑摔杜噶类陆蚀艰弟逆手揉愚领泡马颈充煮走凉第三章基因工程载体第三章基因工程载体89M13mp18 和 M13mp19n这
69、一片段在 M13mp18 和 M13mp19 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在 M13mp18 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mp19 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即 M13mp18 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链，M13mp19重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。n故用 M13mp18 和 M13mp19 作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。垛鉴冲诡匠矫碧脾敌掌虚皋胀蹿瞎伸慌况钧卿沏还摸钝碟臀违疗
70、棉鬃溶报第三章基因工程载体第三章基因工程载体90M13噬菌体产生单双链DNA的机制：1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒
71、的。 碎侣帆柯梳肖硝故养讼六贯他体券顽拖朋众勿支掘堤赎帐湖呻寸抨说哭托第三章基因工程载体第三章基因工程载体91+- -+- -+- -+- -+- -+- -单链结合蛋白单链结合蛋白RF型型DNA复制约复制约200copy+以以- -链链DNA为模为模板合成板合成+链链DNA乍冀韭露讹拍悄频践斜渔殆筷讲赵戮津驭德乐驻鸯轰动固运以却置载昂慧第三章基因工程载体第三章基因工程载体92n nnM13M13M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 感染周期感染周期感染周期感染周期感染周期感染周期n nn+ + + DN
72、ADNADNAn nn（+ + +）DNADNADNARFDNARFDNARFDNARFDNARFDNARFDNAn nnRFDNARFDNARFDNA-DNA-DNA-DNAn nnI I II I In nnV VV障碱磨茂夏二平乱诚邪懦嘻烙降炯含婴辟豪噶量遗析贰娩网各卞吐例袒舷第三章基因工程载体第三章基因工程载体93第三节第三节 其他载体其他载体盖视椰橙适长拍歼拟制逢汇旱劣妨芭玄舶俘碾另简遏暑蚤际藕笔贷狠酥咕第三章基因工程载体第三章基因工程载体94病毒载体概述（病毒载体概述（1）要求：要求：1 1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2 2、介导外
73、源基因转移和表达、介导外源基因转移和表达 3 3、对机体不致病、对机体不致病容量：容量：自身基因组大小的自身基因组大小的105%110105%110% 类型：类型：1 1、重组型病毒载体、重组型病毒载体 2 2、无病毒基因的病毒载体、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型复制缺陷型 可复制型可复制型 复制缺陷型复制缺陷型组成：组成：1 1、病毒复制和包装元件、病毒复制和包装元件 2 2、病毒基因、病毒基因 3 3、插入的外源基因或元件、插入的外源基因或元件 4 4、病毒外壳、病毒外壳/ /外膜外膜 用途：基因转移和表达用途：基因转移和表达 1、基因治疗、基因治疗 2、疫苗、疫苗 3、器官移植、器官移
74、植 4、组织工程、组织工程 5、转基因动物、转基因动物 6、基因功能研究、基因功能研究 一一、病病毒毒载载体体零乖籍靡钒帜率颇炮惹敝矣周驳腆打洽了尸拈混好歼总吏厂疹或砚青澈薪第三章基因工程载体第三章基因工程载体95病毒载体概述（病毒载体概述（2）优点：优点：1 1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2 2、复杂的装配过程由细胞完成；、复杂的装配过程由细胞完成； 3 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点、不同的病毒载体具有不同的表达特点。存在的问题：存在的问题：1 1、安全性、安全性2 2、靶向性、靶向性3 3、有效性、有效性细胞毒性细胞毒性
75、染色体毒性染色体毒性免疫毒性免疫毒性转导靶向性转导靶向性转录靶向性转录靶向性转导效率转导效率靶向性靶向性基因表达水平和持续时间基因表达水平和持续时间表达的可调控性表达的可调控性暴纤蔼蜕绸刀幌辜逝蓄悉甄驼鳃娘恕做嫉矣式哆蜘甩坡录扳慢蘑顶淌藐怨第三章基因工程载体第三章基因工程载体96常用的病毒载体的特点：常用的病毒载体的特点：董估发连绦诗诧策追枚旋拧两岔卸信毋栽蟹匪阴做记湛枝赂秽敛嵌域众枷第三章基因工程载体第三章基因工程载体97Ti质粒质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之中。土壤农杆菌可感染大多
76、数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤产生冠瘿瘤(grown gall tumors)。Ti 质粒。质粒。 Ti质粒的一部分质粒的一部分DNA叫做叫做转移转移DNA（T-DNA），当），当T-DNA整合到宿整合到宿主植物细胞的染色体后，就主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱合成冠瘿碱(opine),作为土作为土壤农杆菌的碳源和氮源壤农杆菌的碳源和氮源 。二、Ti质粒撕韭匝宴菠决柏耍惧谚握畅哄仲骄酶俏亥藏浪糕饭加贰篷姆握汰饭巢品黎第三章基因工程载体第三章基因工程载体98（1）T-DNA区（区（transferred-DNA regions） T-DN
77、A是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入质粒上导入植物细胞的一段植物细胞的一段DNA。 T-DNA两端各有一段两端各有一段25bp的重复序列的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。进行细胞分化。Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留保留T-DNA两端的末端序列，然后用外源两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接
78、取代野生型插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。奴佳杰珠寂脓款武披蚕戏盲苇译玫喳磺坛膏琐渔阅拜兔媚寿扶纸苫纬媳华第三章基因工程载体第三章基因工程载体99（2）Vir区（区（virolence region）Vir区段上的基因与区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区区。Vir区段总长度大约区段总长度大约35kb，由，由7个互补群组成，分别命名为个互补群组成，分别命
79、名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和和VirH。（3）Con区区(regions encoding conjugations) 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tratra），），调控调控TiTi质粒在农杆菌之间的转移。质粒在农杆菌之间的转移。 （4）Ori区区(origin of replication) 该区段基因调控该区段基因调控TiTi质粒的自我复制，故称之为质粒的自我复制，故称之为复制起始区复制起始区。米宵醋抿化颧吉鲍肯极平吓燎迄酝点马由议忽雨迹减仔管屑野挪吓赔霸侦第三章基因工程载体第三章基因工程载体10
80、0（1）双元载体系统（）双元载体系统（binary vector）具有两个质粒具有两个质粒穿梭质粒和穿梭质粒和Ti质粒。质粒。（2）共整合载体（）共整合载体（integrated vector）共整合载体系统包括在共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成区经上的激素合成区经过突变后的过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。质粒和中间载体两部分。Ti质粒的衍生载体质粒的衍生载体濒刃纲冠古龟卒吃粒嘶曙鸦恒晌拐钥蜒叭煌睫砍参砧弗键湖疫挡部瓜珠具第三章基因工程载体第三章基因工程载体101三、三、酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YACyea
81、st artificial chromosome, YAC） 四、四、细菌人工染色体细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BACbacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）逆转录病毒）尹厄迂巷嗓筑粱恶蚊牲惹拥健拖滁算随龟啡按瓜及剪娘陛饼圆炙躇捧一袜第三章基因工程载体第三章基因工程载体102 人基因组十分庞大，约含人基因组十分庞大，约含4 410109 9bpbp，建，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量
82、更大立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（的载体，酵母人工染色体（yeast yeast artificial chromosome,YACartificial chromosome,YAC）载体应运而生。）载体应运而生。YACYAC含有酵母染色体端粒（含有酵母染色体端粒（telesometelesome）、着丝）、着丝点点(centromere)(centromere)及复制起点等功能序列，可及复制起点等功能序列，可插入长度达插入长度达200-500kb200-500kb的外源的外源DNADNA，导入酵母，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，细胞可以随细胞
83、分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要成为人基因组研究计划的重要礁坚泵事旧瞳村运闽率浙邢响谈蝇菌蛙笑穷羞邹赏吗搅报历芯蛙蚂远势路第三章基因工程载体第三章基因工程载体103the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping The functional elements of a yeast chromosome 酬就责疫措路忱兵旅胳糖瞪硬乳宰白概苦抿脸稿眩倚片吸渭愤倪渗卿躬我第三章基因工程载体第三章基因工程载体
84、104向搬彰仑闸驱偏悄上谤秀空渝痹讳知捉过抿菲牟颈惨从镜虫踌台滤械仅即第三章基因工程载体第三章基因工程载体105正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染色体含有：* 四膜虫端粒（四膜虫端粒（tel)* 酵母自主复制序列（酵母自主复制序列（ARS)* 酵母着丝点酵母着丝点 (CEN)酵母的选择标记酵母的选择标记 (TRP1、 URA1)YAC载体载体毕胺邑娱稼鳞降昧认乏啥氨钳磨阐操爷底膨书浇廖惊透痔秋透祈妙射诧塘第三章基因工程载体第三章基因工程载体106BAC载体载体棚尾出戌讶屠幸行拦匙径亿蔷炽郭诵迁沼皆鼎蜀敖姆苞碍柬萎捉之汝蝎聂第三章基因工程载体第三章基因工程载体107Structure of
85、a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning si
86、tes at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.投湾呛厄尝昭钢沉籍拴审褪弛谴漳褂将墙没剧浊替柑撑惫眠寥吼媒升塌珍第三章基因工程载体第三章基因工程载体108吓帆诅癣哮创丁管牟多灾傣义胁誓玻摹猪积拦捞蚁讥宋猖孪细写还汗综救第三章基因工程载体第三章基因工程载体109PAC载体载体药摊比居硝菏疼软崩催灾垢疯泞彤荤此榷接赁慎条茁霓适
87、篙裴慕宜趾依休第三章基因工程载体第三章基因工程载体110质粒质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体克隆克隆克隆克隆DNADNA大片段大片段大片段大片段 * *+ + +- -构建基因组文库构建基因组文库构建基因组文库构建基因组文库- -+ + +- -构建构建构建构建DNADNA文库文库文库文库+ +- - - -常规的亚克隆化常规的亚克隆化常规的亚克隆化常规的亚克隆化+ +- - - -构建新型的构建新型的构建新型的构建新型的DNADNA结构结构结构结构+ +- - - -序列分析序列分析序列分析序列分析+ +- - -
88、+ +单链探针单链探针单链探针单链探针+ +*- - -+ +外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达+ +- - - -四种常用载体的比较* * 外源外源DNADNA如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和，则重组质粒的转化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低* * 已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的妊礁茁滦犹炳铱侯呼净攒溉湛倔瓢辖揣煌备驶帚唯恃烈樊褒忠听减监柏珍第三章基因工程载体第三章基因工程载体111 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核满足真核DN
89、ADNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒病毒SV40SV40（Simian Virus 40Simian Virus 4
90、0）、逆转录病毒和昆虫）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。作基因治疗等。虽雨彪巍龚嫉蝇紊绎松峨截窘懂拯号悉砾蛇门尽昔感巢刁斜有启炕羚绍哺第三章基因工程载体第三章基因工程载体112 猴病毒猴病毒4040（SV40SV40）的基因组常用来作为克隆载体，）的基因组常用来作为克隆载体，把外源把外源DNADNA转入哺乳类细胞。猴病毒转入哺乳类细胞。猴病毒4040是球形动物病毒，是球形动物病毒，直径直径40nm40nm，呈，呈2020
91、面体，有一个共价闭环的双链面体，有一个共价闭环的双链DNADNA基因基因组，全长组，全长5244bp5244bp。它在猴肾中增殖。被。它在猴肾中增殖。被SV40SV40感染的细感染的细胞都会出现胞都会出现SV40SV40的的T T抗原。早已证明完整的小鼠染色体抗原。早已证明完整的小鼠染色体珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在合在SV40SV40中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠鼠珠蛋白的初级转录本。珠蛋白
92、的初级转录本。绪榴填洗窘伯笔攫更哀订煤卵坡瑰捂障臣卜镁迟胸寥样载培绳充涟砍荷踪第三章基因工程载体第三章基因工程载体113SV40SV40作为克隆载体有其局限性：作为克隆载体有其局限性：SV40SV40基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源源DNADNA的重组和表达；的重组和表达；早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；虑；重组重组DNADNA片段的大小受体限制。片段的大小受体限制。趴赣鲸嘻冕种货靴粟凛法殆烂姻一鞭缺鲍附秋胸幅毙劣祭倪卓绿负叠蛤吹第三章基因工程载体第三章基因工程载体114 逆转录病毒是逆转录病毒是RN
93、ARNA病毒，它有三个基因：病毒，它有三个基因：gag-gag-编编码病毒的核心蛋白；码病毒的核心蛋白；pol-pol-编码逆转录酶；编码逆转录酶；env-env-编码编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（voncvonc），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（已设计构建成一些缺陷型病毒（defective virusdefective virus）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细
94、胞中表达。性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。删肢彦涯辟胸园增绽茄文驶特御纷生名汇瓶速漠膳尿匹镜豺回鹿舌抗氧肥第三章基因工程载体第三章基因工程载体115 HockHock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的（一段尚未鉴定的DNADNA顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus
95、helper virus）。）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的株后，逆转录病毒的RNARNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNARNA，进入骨髓细胞，病毒，进入骨髓细胞，病毒DNADNA插入插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷陷”在在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。煮殆掖举数摆秃务别曲蔫属膜搀杖钨粘垒乌樊彝讣丘琶杂过挤沾傅溜滴识第三章基因工程载体第三章基因工程载体116
