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1、放射免疫分析技术放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）核医学核医学治疗：治疗：肿瘤、甲亢等肿瘤、甲亢等诊断诊断 体内体内PET、SPECT、 放射免疫成像等放射免疫成像等 体外体外放射免疫分析（放射免疫分析（RIA）标记免疫分析技术标记免疫分析技术 用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法分析方法特点：特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果三大标记免疫分析技术：三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、放射免疫、荧光免疫、酶免疫酶免疫 检测方法检测方法 检测范围检测范围生化、常规免疫生化、
2、常规免疫 mgg（10-3 10-6 g）荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫放射免疫、发光免疫、发光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）一、放射免疫分析技术（一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA） 女科学家女科学家 R.Yalow（美（美,1921）1950末末发明（胰岛素），发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖年获诺贝尔医学奖1. 基本原理基本原理（1）竞争结合分析：）竞争结合分析：Ag + Ab AgAb *Ag + Ab *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：免疫
3、放射分析）：2. 常用标记核素：常用标记核素：（1）125I： 射线，半衰期射线，半衰期 60 天天（2）3H： 射线，半衰期射线，半衰期 12.3 年年3. 测量仪器测量仪器（1） 计数仪计数仪（2） 液闪仪液闪仪4. 基本试剂基本试剂（1）标准品与质控品）标准品与质控品a. 意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据b. 要求：要求： 化学结构上化学结构上与待测物有相同的化学结构与待测物有相同的化学结构 化学纯度上化学纯度上对竞争反应有干扰的杂质的含量低对竞争反应有干扰的杂质的含量低 含量准确含量准确 注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；
4、注意有效期注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期c. 种类：国际标准、国家标准、企业标准种类：国际标准、国家标准、企业标准（2）标记物标记物a. 对对标记物的要求标记物的要求 比活度高：即单位物质的放射性强度高比活度高：即单位物质的放射性强度高 生物活性及免疫活性与标记前改变小生物活性及免疫活性与标记前改变小 放射化学纯度高：应放射化学纯度高：应 95% 稳定性好：标记的同位素不易脱落稳定性好：标记的同位素不易脱落b. 标记方法：标记方法： 氯胺氯胺-T 法：最常用的法：最常用的 125I 标记法，标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法与酪氨酸共价结合，方法简便，但易造成蛋白质的损伤
5、简便，但易造成蛋白质的损伤 乳过氧化酶法：乳过氧化酶法： Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应时间长时间长 置换法：置换法： 3H 最常用最常用c. 标记产物的纯化：常用标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶层析，也可用硅胶 G 薄板层析薄板层析或或 HPLC 分离分离d. 标记产物的鉴定：常用标记产物的鉴定：常用 RIA 法法 最大结合百分率最大结合百分率 标准曲线比较法标准曲线比较法e. 半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），），再对载体
6、作标记再对载体作标记（3）特异性结合抗体）特异性结合抗体a. 对特异性结合抗体的要求：对特异性结合抗体的要求： 亲和力（亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度值表示，反映灵敏度 特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应）低结合能力（交叉反应）低 滴度（效价）高：指结合滴度（效价）高：指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高标记抗原时抗体的稀释度高 稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定稳定性好：能长期保存
7、，化学性质、效价稳定b. 抗体的制备抗体的制备 选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊 应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +卡介苗卡介苗） 选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数 c. 抗体的纯化抗体的纯化 去除杂去除杂抗体：用抗原吸附法抗体：用抗原吸附法 提取特异性提取特异性 IgG：先用：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和盐析法粗提，再用离子交换层析或亲
8、和层析纯化层析纯化d. 抗体的鉴定抗体的鉴定 鉴定内容：效价、亲和力、特异性鉴定内容：效价、亲和力、特异性 鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA e. 单克隆抗体的使用：单克隆抗体的使用： 用于用于 IRMA 或或 RIA，特异性高特异性高 不一定优于传统的多克隆抗体不一定优于传统的多克隆抗体5. 竞争性放射免疫分析法的建立竞争性放射免疫分析法的建立（1）反应方式）反应方式a. 平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育b. 顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间
9、后再加入顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入标记抗原。可提高反应灵敏度标记抗原。可提高反应灵敏度c. STAT 法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件（2）反应体系）反应体系a. 缓冲液：常用缓冲液：常用 0.050.1 mol/L pH 7.47.5 磷酸或磷酸或 Tris-HCl 缓冲缓冲液。根据需要定液。根据需要定b. 反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差c. 反应时间：反应时间：d. 反应温度：反应温度：e. 反应物比例：减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体反应物比例：
10、减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体与标记的用量可扩大测定范围与标记的用量可扩大测定范围（3）分离方法）分离方法a. 对分离方法的要求：对分离方法的要求： 使结合部分（使结合部分（B）与游离部分（与游离部分（F）尽可能分离完全尽可能分离完全 分离后便于放射性测量分离后便于放射性测量 分离效果不受外界干扰因素的影响分离效果不受外界干扰因素的影响 操作简便、分离迅速、重复性好操作简便、分离迅速、重复性好 与游离标记物的非特异性结合尽可能小与游离标记物的非特异性结合尽可能小 试剂来源广泛、价格低廉试剂来源广泛、价格低廉b. 常用的分离方法常用的分离方法 二抗法：非特异性低，但沉淀较差二抗法：非
11、特异性低，但沉淀较差 PEG 法法：沉淀较好沉淀较好，但非特异性高但非特异性高 二抗二抗-PEG 法：较好，现常用法：较好，现常用 磁化颗粒法：磁化颗粒法： 固相法：现较常用固相法：现较常用 （4）添加剂的问题）添加剂的问题a. 防腐剂：低浓度防腐剂：低浓度 NaN3 对分析的影响小对分析的影响小b. 抗凝剂：抗凝剂：EDTA、肝素对分析无影响肝素对分析无影响c. 抑肽酶：对一般分析无影响抑肽酶：对一般分析无影响6. 放射免疫分析的数据处理放射免疫分析的数据处理（1）数据处理的基本步骤）数据处理的基本步骤a. 作图法作图法b. 数学模型法数学模型法（2）几种数学模型）几种数学模型a. 一般多项
12、式函数：普适性差，现基本不用一般多项式函数：普适性差，现基本不用b. 直线法：直线法：logit-lg 转换转换c. 四参数四参数 Logistic 模型：目前常用模型：目前常用7. 放射免疫分析的质量控制放射免疫分析的质量控制（1）放射免疫分析中的误差及引起误差的原因）放射免疫分析中的误差及引起误差的原因a. 系统误差：由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差系统误差：由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差 试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效；分离剂的试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效；分离剂的影响影响 仪器误差：测量仪器不准；加样器不准仪器误差：测量仪器不准；加样器不准
13、分离误差：分离不完全或失误分离误差：分离不完全或失误 数据处理误差：选用数学模型不当数据处理误差：选用数学模型不当b. 随机误差：偶然因素造成的误差随机误差：偶然因素造成的误差 同位素计数的统计涨落同位素计数的统计涨落（2）放射免疫分析的质量控制指标）放射免疫分析的质量控制指标a. 精密度：即重复性，是评价随机误差的指标，用标准差（精密度：即重复性，是评价随机误差的指标，用标准差（SD）、）、变异系数（变异系数（CV）、）、精密度图（精密度图（PDP）表示表示b. 准确度：指测定值与真值的符合程度，偏离程度叫偏差，常以准确度：指测定值与真值的符合程度，偏离程度叫偏差，常以偏离真值的百分比表示，
14、常用回收试验及平行性实验来评价偏离真值的百分比表示，常用回收试验及平行性实验来评价c. 灵敏度：指测定方法的最小可测值，灵敏度：指测定方法的最小可测值， 即能与零剂量相区别的最即能与零剂量相区别的最小剂量，以零剂量点结合率的均数减两个标准差后的结合率的对应小剂量，以零剂量点结合率的均数减两个标准差后的结合率的对应值作为最小可测值值作为最小可测值d. 特异性：常用交叉反应率来表示特异性：常用交叉反应率来表示e. 稳定性：即批间的重复性，稳定性：即批间的重复性， 常以剂量反应曲线参数的稳定性来常以剂量反应曲线参数的稳定性来评价，主要有零管结合率（评价，主要有零管结合率（B0%）、）、非特异性结合率
15、（非特异性结合率（NSB）、）、剂剂量反应曲线函数、相关系数量反应曲线函数、相关系数f. 临床有效性：诊断符合率，假阴性率、假阳性率临床有效性：诊断符合率，假阴性率、假阳性率（3）日常检测工作中的内部质量控制）日常检测工作中的内部质量控制a. 实验室内的批内质量控制实验室内的批内质量控制b. 实验室内的批间质量控制实验室内的批间质量控制c. 实验室之间的外部质量控制：对同一样品在不同实验室测定结实验室之间的外部质量控制：对同一样品在不同实验室测定结果作评判果作评判8. 放射免疫分析的临床应用放射免疫分析的临床应用临床常用近临床常用近 200 种种（1）肿瘤相关抗原的测定：）肿瘤相关抗原的测定：
16、AFP、CEA 、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA 等等（2）激素的测定：）激素的测定：下丘脑下丘脑-垂体垂体-甲状腺轴激素，下丘脑甲状腺轴激素，下丘脑-垂垂体体-性腺轴激素，下丘脑性腺轴激素，下丘脑-垂体垂体-肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等（3）非激素蛋白质的测定：）非激素蛋白质的测定：铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、III 型前胶原肽、层黏蛋白等型前胶原肽、层黏蛋白
17、等（4）酶的测定：）酶的测定：前列腺酸性磷酸酶、前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE 等等（5）药物及维生素的测定：）药物及维生素的测定：地高辛、叶酸、地高辛、叶酸、VitB12 等等（6）免疫分子的测定：）免疫分子的测定：各种各种 Ig、抗、抗 DNA、IL、CD、CIC（7）病原学研究：）病原学研究：现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值有一定的价值（8）其它：）其它：甘胆酸、透明质酸等甘胆酸、透明质酸等二、荧光免疫分析技术二、荧光免疫分析技术（Fluoroimmunoassay，FIA） 1941年年 Coons 等发明，最早建立的一种标等发明，
18、最早建立的一种标记免疫技术记免疫技术 用荧光素标记抗体或抗原，借助荧光检测用荧光素标记抗体或抗原，借助荧光检测仪察看荧光现象或测量荧光强度，从而判断抗仪察看荧光现象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗体的分布或含量原或抗体的分布或含量常用荧光免疫的类型常用荧光免疫的类型（1）荧光免疫染色：主要用于抗原抗体的定位，用荧）荧光免疫染色：主要用于抗原抗体的定位，用荧光显微镜观察光显微镜观察（2）荧光免疫测定）荧光免疫测定a. 荧光偏振免疫测定（荧光偏振免疫测定（FPIA）b. 荧光酶免疫测定（荧光酶免疫测定（FEIA）（3）时间分辨荧光免疫测定（）时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）三、酶免疫测定（三、酶
19、免疫测定（EIA）1. 均相酶免疫测定法：均相酶免疫测定法： 主要用于测小分子抗原。酶标抗原与待测抗原竞主要用于测小分子抗原。酶标抗原与待测抗原竞争结合定量抗体争结合定量抗体2. 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）：）： 为固相、非均相酶免疫测定法，目前应用最广泛为固相、非均相酶免疫测定法，目前应用最广泛的定性标记免疫分析技术，也可用于定量分析。的定性标记免疫分析技术，也可用于定量分析。1971 年年 van Weeman（荷）等发明荷）等发明3. 生物素生物素-亲和素系统免疫检测法亲和素系统免疫检测法生物素标记一抗或二抗，酶标记亲和素生物素标记一抗或二抗，酶标记亲和素4. 斑点
20、免疫结合试验斑点免疫结合试验 用醋酸纤维素膜为固相载体用醋酸纤维素膜为固相载体（1）斑点酶免疫渗滤试验）斑点酶免疫渗滤试验（2）斑点免疫金渗滤试验）斑点免疫金渗滤试验（3）斑点免疫金层析试验）斑点免疫金层析试验四、发光免疫分析技术（四、发光免疫分析技术（Luminescent immunoassay，LIA）1. 原理：原理：（1）LIA：在氧化还原反应中电子被激发，可释放光子，使鲁在氧化还原反应中电子被激发，可释放光子，使鲁米诺（氨基苯二酰肼类）发光剂发光。用发光剂标记抗原或抗体米诺（氨基苯二酰肼类）发光剂发光。用发光剂标记抗原或抗体（2）发光酶免疫测定（）发光酶免疫测定（LEIA）：）：用能催化发光反应的酶用能催化发光反应的酶（如葡萄糖氧化酶）标记抗原或抗体，酶可使发光剂发光。该法（如葡萄糖氧化酶）标记抗原或抗体，酶可使发光剂发光。该法经酶促放大，更灵敏经酶促放大，更灵敏 根据发光的强弱对抗原或抗体定量根据发光的强弱对抗原或抗体定量2. 优点：优点： 无放射性，故现正逐步取代无放射性，故现正逐步取代 RIA
