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1、 流式细胞术在科研(k yn)(k yn)中 的应用 第一页，共五十五页。什么(shn me)是流式细胞仪流式细胞仪实物(shw)BD FACSVantageBD-Calibur 第二页，共五十五页。流式细胞(xbo)仪可检测到的细胞(xbo)参数n n非荧光非荧光(ynggung)(ynggung)信号信号颗粒颗粒(kl)度度细胞大小细胞大小=前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性性第三页，共五十五页。外周全外周全(zhuqun)
2、(zhuqun)血细胞散射光双参数点图血细胞散射光双参数点图第四页，共五十五页。n n荧光荧光(ynggung)(ynggung)信号信号n n荧光强度（荧光强度（荧光强度（荧光强度（FLFL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长荧光染料其发射波长荧光染料其发射波长荧光染料其发射波长(bchng)(bchng)不同。不同。不同。不同。uu有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标
3、记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）uu高高高高FLFL细胞与低细胞与低细胞与低细胞与低FLFL细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）n n一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm488nm），可测出三个），可测出三个），可测出三个），可测出三个FLFL，即，即，即，即FL1FL1、FL2FL2、FL3FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源，大型的流式细胞仪
4、装有两个或三个激光光源，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm488nm、633nm633nm和和和和325nm325nm），可测出），可测出），可测出），可测出6 6个个个个FLFL。第五页，共五十五页。荧光荧光(ynggung)(ynggung)信信号号双色直接双色直接(zhji)染色染色第六页，共五十五页。n n流流流流式式式式报报报报告告告告的的的的图图图图一一一一般般般般分分分分为为为为四四四四种种种种，即即即即散散散散点点点点图图图图、直直直直方方方方图图图图、密密密密度度度度图图图图和和和和二二二二维维维维等等等等高高高高图图图
5、图等等等等。最最最最常常常常用用用用的的的的为为为为散散散散点点点点图图图图和和和和直直直直方方方方图。图。图。图。n n几个概念：几个概念：几个概念：几个概念：n n%Gated%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。胞的数量。胞的数量。胞的数量。n nMeanMean：平均荧光强度，与被检测物质平均荧光强度，与被检测物质平均荧光强度，与被检测物质平均荧光强度，与被检测物质(wzh)(wzh)的表达的表达的表达的表达量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布
6、时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。n nGeo MeanGeo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。态分布时一般用该值。态分布时一般用该值。态分布时一般用该值。第七页，共五十五页。散点图 密度(md)图二维等高图直方图图 报告(bogo)中常见的几种流式细胞图第八页，共五十五页。图 Annexin V/PI双标记(bioj)分析细胞凋亡和坏死第九页，共五十五页。流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=点图分析点图分析点图分析点图分析
7、(fnx)(fnx)第十页，共五十五页。流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=直方图分析直方图分析(fnx)(fnx)第十一页，共五十五页。图中100101（M1）为阴性(ynxng)细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 第十二页，共五十五页。当前当前(dngqin)流式细胞分析发展趋势流式细胞分析发展趋势vv从相对从相对(xingdu)(xingdu)(xingdu)(xingdu)细胞计数到绝对细胞计数细胞计数到绝对细胞计数 vv从相对定量到绝对定量分析从相对定量到绝对定量分析vv从单色到多色荧光分析从单色到多色荧光分析 vv从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞膜成分到细胞内成分分析vv从细
8、胞分析到可溶性成分的流式细胞分从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析析 第十三页，共五十五页。今天主要(zhyo)内容：n n流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用(yngyng)(yngyng)n n流式细胞术在肿瘤细胞DNA倍体中的应用n n流式细胞仪的分选功能n n流式细胞术在蛋白检测中的应用第十四页，共五十五页。细细胞胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)凋凋亡亡检检测测第十五页，共五十五页。1、半胱氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期）检测法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）法（早期）3、Apo2.7检测法（早期）检测法（早期）4、TUNEL 法（晚期）法
9、（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）含量分析法（晚晚期）6、细胞凋亡相关、细胞凋亡相关(xinggun)(xinggun)蛋白的流式细胞术蛋白的流式细胞术检测检测流式细胞术检测流式细胞术检测(jin c)细胞凋亡细胞凋亡第十六页，共五十五页。细胞细胞(xbo)(xbo)凋亡的分析凋亡的分析n n细胞凋亡的主要细胞凋亡的主要细胞凋亡的主要细胞凋亡的主要(zhyo)(zhyo)表现表现表现表现uu细胞内水解酶改变：如细胞内水解酶改变：如细胞内水解酶改变：如细胞内水解酶改变：如Caspase-3Caspase-3活化活化活化活化uu细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但细胞膜不对称性改变，磷脂酰
10、丝氨酸外翻，但细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：仍然保持膜的完整性：仍然保持膜的完整性：仍然保持膜的完整性：Annexin V/PIAnnexin V/PIuu细胞核细胞核细胞核细胞核DNADNA的断裂改变：的断裂改变：的断裂改变：的断裂改变：TUNNELTUNNEL实验（实验（实验（实验（APO-APO-BRDUBRDU，APO-DIRECTAPO-DIRECT）n n凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：uuFasFasuuBcl-2Bcl-2第十七页，共五十五页。细胞细胞(xbo)凋亡凋亡Active C
11、aspases-3第十八页，共五十五页。细胞细胞(xbo)凋亡凋亡Caspases-3第十九页，共五十五页。细胞细胞(xbo)凋亡凋亡Annexin 第二十页，共五十五页。凋亡凋亡(dio wn)(dio wn)检测（检测（Annexin V/PIAnnexin V/PI法）法） PIAnnexin V-FITCAnnexin V-FITC第二十一页，共五十五页。DNA倍体的流式分析(fnx)(fnx)第二十二页，共五十五页。细胞细胞DNA含量含量(hnling)(hnling)检测检测细胞固定后用细胞固定后用细胞固定后用细胞固定后用PI PI （Propidium iodide碘化丙啶），碘
12、化丙啶），染色，染色，染色，染色，因为因为因为因为PIPI特异性结合于细胞特异性结合于细胞特异性结合于细胞特异性结合于细胞DNADNA，荧光强度与，荧光强度与，荧光强度与，荧光强度与PIPI的结合量的结合量的结合量的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNADNA含量含量含量含量(hnling)(hnling)。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。用于细胞周期、细胞倍体以及
13、凋亡的检测。 第二十三页，共五十五页。第二十四页，共五十五页。单参数(cnsh)(cnsh)直方图图中2N代表(dibio)G0/G1期细胞，4N代表(dibio)G2/M期细胞，两者中间代表(dibio)S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 第二十五页，共五十五页。DNA细胞周期分析细胞周期分析(fnx)细胞周期细胞周期G2MGG0 0GG1 1s 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNADNA分析分析分析分析(fnx)(fnx)DNA含量含量(hnling)细细胞胞数数量量2N2N4N4N第二十六页，共五十五页。第二十七页，共五十五页。2倍体倍体异倍体异
14、倍体4倍体倍体肿瘤肿瘤(zhngli)组织中的各种组织中的各种DNA倍倍体体第二十八页，共五十五页。含量含量(hnling)与凋亡关系与凋亡关系n nDNADNA亚亚亚亚G1G1峰的检测：利用峰的检测：利用峰的检测：利用峰的检测：利用PIPI染色，检测具有亚染色，检测具有亚染色，检测具有亚染色，检测具有亚GG1 1期期期期DNADNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。n n凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释
15、放，将DNADNA降解，分降解，分降解，分降解，分解成小的片段，在标本制备解成小的片段，在标本制备解成小的片段，在标本制备解成小的片段，在标本制备(zhbi)(zhbi)中的固定处理时，细中的固定处理时，细中的固定处理时，细中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNADNA片段从细片段从细片段从细片段从细胞内流出，造成总体胞内流出，造成总体胞内流出，造成总体胞内流出，造成总体DNADNA含量减少，成为亚含量减少，成为亚含量减少，成为亚含量减少，成为亚2 2倍体。倍体。倍体。倍体。
16、第二十九页，共五十五页。第三十页，共五十五页。第三十一页，共五十五页。Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 图图 FCM测试细胞测试细胞(xbo)周周 期分布和凋亡期分布和凋亡第三十二页，共五十五页。流式细胞(xbo)(xbo)仪的细胞(xb
17、o)(xbo)分选功能第三十三页，共五十五页。分选：分选：n n用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，n n用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般(ybn)(ybn)(ybn)(ybn)分选速度为每秒钟分选速度为每秒钟分选速度为每秒钟分选速度为每秒钟300300300300个细胞，个细胞，个细胞，个细胞，n n大型机分选速度可达到
18、每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞第三十四页，共五十五页。488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第三十五页，共五十五页。流式分选与分子生物学研究流式分选与分子生物学研究(ynji)(ynji)n n除了将分选得到的细胞除了将分选得到的细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)进行后续培进行后续培
19、养研究外，养研究外，FCMFCM分选系统可为分选系统可为PCRPCR、FISHFISH等分子技术提供纯度较高的特异等分子技术提供纯度较高的特异性细胞性细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)群，减少研究中的干扰因素，群，减少研究中的干扰因素，获得更准确的实验结果。获得更准确的实验结果。第三十六页，共五十五页。Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋流式液相多重蛋白白定量定量(dngling)技术技术第三十七页，共五十五页。导言导言(doyn)n n常规的蛋白分析方法：常规的蛋白分析方法：常规的蛋白分析方法：常规的蛋白分析方法：uuELISAELISA：一次反应
20、只能检测一个指标：一次反应只能检测一个指标：一次反应只能检测一个指标：一次反应只能检测一个指标uuWestern blotWestern blot：不能对蛋白精确定量：不能对蛋白精确定量：不能对蛋白精确定量：不能对蛋白精确定量uu不足之处：不足之处：不足之处：不足之处：检测多个指标需耗费大量样本检测多个指标需耗费大量样本分批操作导致组间差异大分批操作导致组间差异大操作繁琐操作繁琐(fn su)(fn su)，耗时耗力，耗时耗力n n如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并
21、加以定量，如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？获得高精确度的数据呢？获得高精确度的数据呢？获得高精确度的数据呢？n n针对于此，针对于此，针对于此，针对于此，BD-PharmingenBD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术重蛋白定量技术重蛋白定量技术重蛋白定量技术BD Cytometric Bead ArrayBD Cytometric Bead Array，简称，简称，简称，简称CBACB
22、A 第三十八页，共五十五页。CBACBA技术技术(jsh)(jsh)简介简介n nCBACBA是是是是一一一一系系系系列列列列带带带带有有有有不不不不同同同同强强强强度度度度红红红红色色色色荧荧荧荧光光光光、包包包包被被被被有有有有捕捕捕捕获获获获抗抗抗抗体体体体的的的的微微微微球球球球，类类类类似似似似(li (li s)s)ELISAELISA的的的的捕捕捕捕获获获获孔孔孔孔板板板板，可可可可以以以以捕捕捕捕获获获获液液液液相相相相样样样样本本本本（血血血血清清清清、血血血血浆浆浆浆或或或或者者者者细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养上上上上清清清清液液液液等等等等）中中中中相相相相应应应应的
23、的的的抗抗抗抗原原原原，再再再再结结结结合合合合PEPE标标标标记记记记检检检检测测测测抗抗抗抗体体体体，形形形形成成成成双双双双抗抗抗抗体体体体夹夹夹夹心心心心结结结结构构构构，通通通通过过过过流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪进进进进行行行行荧荧荧荧光光光光检检检检测测测测，便便便便可可可可同同同同时时时时对对对对样样样样本本本本中中中中的的的的多种可溶性蛋白成分进行定量多种可溶性蛋白成分进行定量多种可溶性蛋白成分进行定量多种可溶性蛋白成分进行定量+Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbB
24、ead第三十九页，共五十五页。BD Cytometric Bead Array123不同不同(b tn)强度红色强度红色荧光的捕获微球，在荧光的捕获微球，在FCM FL3检测检测不同的目标不同的目标(mbio)蛋蛋白白PE 标记的检测抗体，在标记的检测抗体，在FCM FL2检测。检测。 PE的荧光的荧光(ynggung)强度即强度即反映靶蛋白的含量反映靶蛋白的含量456第四十页，共五十五页。Human Th1/Th2 Lymphokine CBAn nTh1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TNFTh1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL1
25、0, TNF , IFN, IFN t t用用 FL3 FL3荧光的强度荧光的强度(qingd)(qingd)不同区别不同区别 种不同的微种不同的微球（球（beadsbeads）n nDirect sandwich immunoassayDirect sandwich immunoassayt tFL2 (PE) detector reagentFL2 (PE) detector reagentl l样本处理l l6 cytokines from a 50 6 cytokines from a 50 L sampleL samplel lThree pipetting stepsThree p
26、ipetting stepsl l3 hour total incubation3 hour total incubationl lQuantitative results and complete report generationQuantitative results and complete report generationn nSoftware assisted quantitative analysis, with curve Software assisted quantitative analysis, with curve fitting algorithmfitting
27、algorithmt tResult reporting included in softwareResult reporting included in software第四十一页，共五十五页。Human Th1/Th2 Lymphokine CBA第四十二页，共五十五页。 Chemokine-I CBA Assay Standard0 pg/mlCBA Assay Standard 第四十三页，共五十五页。10 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十四页，共五十五页。20 pg/mlCBA A
28、ssay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十五页，共五十五页。40 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十六页，共五十五页。80 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十七页，共五十五页。156 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十八
29、页，共五十五页。312 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十九页，共五十五页。625 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十页，共五十五页。1250 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十一页，共五十五页。2500 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine
30、-I CBA Assay Standard第五十二页，共五十五页。Human Th1/Th2 Lymphokine CBA 标准标准(biozhn)曲线曲线5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IFN- IL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IFN- 第五十三页，共五十五页。总结(zngji)流式细胞术检测的是处于流动状态中的被荧光素标记的微粒，包括细胞、细菌或者微球。对于可溶性抗原，只能用相应的抗体(kngt)(kngt)先包被微球，再来结合抗原进行检测。流式细胞仪器在临床和科研中具有广泛的用途。第五十四页，共五十五页。内容(nirng)总结流式细胞术在科研中。流式报告(bogo)的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。从细胞膜成分到细胞内成分分析。从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析。细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）。细胞凋亡Active Caspases-3。细胞凋亡Caspases-3。细胞凋亡Annexin 。Dip %CV: 6.04第五十五页，共五十五页。流式细胞术在科研中的应用描述
