免疫组化与原位杂交

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1、免疫组化与原位杂交Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望 免疫组织化学免疫组织化学 前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。 一、基本原理一、基本原理 ： 利用利用 抗体（抗体（antibody）与）与 相应抗原（相应抗原（antigen）的特）的特 异性结合异性结合, 通过与抗体连接通过与抗体连接 的酶反应或荧光染料显示的酶反应或荧光染料显示 抗原所在的位置。抗原所在的位置。二、常用于标记抗体的标记物二、常用于标记抗体的标记物一

2、）酶（一）酶（enzymeenzyme）1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRPhorseradish peroxidase, HRP） 辣根过氧化物辣根过氧化物酶的作用物（底物，酶的作用物（底物，substratesubstrate） 1 1）二氨基联苯胺（二氨基联苯胺（3,33,3-diaminobenzidine-diaminobenzidine，DABDAB） 显色特点：显色特点： - 棕色棕色 -不溶于水及脂类溶剂（酒精不溶于水及脂类溶剂（酒精 ethanol, 二甲苯二甲苯xylene） -不扩散不扩散 - -永久保存永久保存 2

3、 2）3 3氨基氨基9 9乙基卡巴唑（乙基卡巴唑（3-Amino-9-Ethylcarbazole3-Amino-9-Ethylcarbazole，AECAEC） 显色特点：显色特点： - -棕红色棕红色 - -不溶于水，但不溶于水，但溶于溶于脂类溶剂脂类溶剂 - -容易扩散容易扩散 - -不能永久保存不能永久保存 3 3）4 4氯氯1 1萘酚（萘酚（4-Chloro-1-naphthol4-Chloro-1-naphthol，CNCN） 显色特点：显色特点： -蓝色蓝色 - -不溶于水，但溶于脂类溶剂不溶于水，但溶于脂类溶剂 - -容易扩散容易扩散 - -不能永久保存不能永久保存 4 4）四

4、甲基联苯胺（四甲基联苯胺（3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB） 显色特点：显色特点： -深蓝色深蓝色 - -不溶于水及脂类溶剂不溶于水及脂类溶剂 - -不扩散不扩散 - -永久保存永久保存2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, APalkaline phosphatase, AP） 碱性磷酸酶的碱性磷酸酶的作用物（底物，作用物（底物，substratesubstrate） 1 1）四唑淡蓝四唑淡蓝 /5- /5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚- -磷酸盐磷酸盐(

5、Nitro-Blue-(Nitro-Blue- Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl- Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl- phosphate phosphate, NBT/BCIPNBT/BCIP） 显色特点：显色特点： - -紫色紫色 - -不溶于水但溶于脂类溶剂不溶于水但溶于脂类溶剂 - -容易扩散容易扩散 - -不能永久保存不能永久保存 2 2）快红快红（固红（固红/ /萘酚磷酸盐，萘酚磷酸盐，Fast Red TR/Naphthol AS-MXFast Red TR/Naphthol AS-MX） 显

6、色特点：显色特点： - -桃红色桃红色 - -不溶于水但溶于脂类溶剂不溶于水但溶于脂类溶剂 - -容易扩散容易扩散 - -不能永久保存不能永久保存 3 3）快蓝快蓝（固蓝（固蓝BB/BB/萘酚磷酸盐，萘酚磷酸盐，Fast Blue BB/Naphthol AS-MX)Fast Blue BB/Naphthol AS-MX) 显色特点：显色特点： - -蓝色蓝色 - -不溶于水但溶于脂类溶剂不溶于水但溶于脂类溶剂 - -容易扩散容易扩散 - -不能永久保存不能永久保存4 4）品红（品红）品红（品红/ /萘酚磷酸盐，萘酚磷酸盐，Fuchsin/Naphthol AS-TRFuchsin/Napht

7、hol AS-TR） 显色特点：显色特点： - -红色红色 - -不溶于水及脂类溶剂不溶于水及脂类溶剂 - -不扩散不扩散 - -永久保存永久保存DABFast blueFast redNBT/BCIPAEC二）荧光染料（二）荧光染料（fluorescent dyefluorescent dye） 常用的荧光染料常用的荧光染料1.1.异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanatefluorescein isothiocyanate，FITCFITC）分子量为分子量为389389，最大吸收光波长为，最大吸收光波长为490490495nm495nm，最大发射光

8、波长为，最大发射光波长为520520530nm530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光素。素。2.2.四甲基异四甲基异硫氰酸罗达明硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITCtetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC） 分子量为分子量为444444，最大吸收光波长为，最大吸收光波长为550nm550nm，最大发射光波长为，最大发射光波长为620nm620nm，呈现橙红色荧光。，呈现橙红色荧光。3.3.羰花青类（羰花青类（carbocy

9、anine dyes)carbocyanine dyes)荧光较强，不易淬灭，近年来应用广泛。荧光较强，不易淬灭，近年来应用广泛。4.Alexa Fluor4.Alexa Fluor吸收光波及发射光波长范围广，也是目前应用最广泛的荧光素。吸收光波及发射光波长范围广，也是目前应用最广泛的荧光素。三）生物素三）生物素( (维生素维生素H, Biotin )H, Biotin ) 水溶性维生素，属于维生素水溶性维生素，属于维生素B B族。相对分子量族。相对分子量244244， 分子结构简单，通过其羧基与被标记物的氨基结分子结构简单，通过其羧基与被标记物的氨基结 合，可标记抗体、酶、激素、核酸、凝集素

10、等，合，可标记抗体、酶、激素、核酸、凝集素等， 由于其分子小，不影响被标记物的理化和免疫学由于其分子小，不影响被标记物的理化和免疫学 特性。极易于亲和素（特性。极易于亲和素（AvidinAvidin）结合，形成）结合，形成亲和亲和 素素- -生物素复合物（生物素复合物（Avidin-biotin complex,ABCAvidin-biotin complex,ABC）因此，常与亲）因此，常与亲 和素一起被用于免疫组化的和素一起被用于免疫组化的ABCABC方法中。方法中。四）胶体金（四）胶体金（colloidal goldcolloidal gold） 又称金溶胶（又称金溶胶（gold sol

11、utiongold solution），是指分），是指分 散相粒子直径在散相粒子直径在l150nml150nm之间的金溶胶，之间的金溶胶， 能稳定又迅速地吸附蛋白质，能稳定又迅速地吸附蛋白质，可以作为可以作为 标记物标记抗体、抗原、激素、核酸等，标记物标记抗体、抗原、激素、核酸等， 在药物检测、生物医学等许多领域有广在药物检测、生物医学等许多领域有广 泛的应用，常用于透射电镜泛的应用，常用于透射电镜。 三、组织标本的制备三、组织标本的制备一）一）组织标本的取材组织标本的取材 取材原则取材原则: :尽可能快的切取所需组织浸入固定液或快速冰冻尽可能快的切取所需组织浸入固定液或快速冰冻, ,保持保持

12、 组织的新鲜以组织的新鲜以最大限度地防止抗原破坏和降解。最大限度地防止抗原破坏和降解。二）二）固定固定（Fixation):Fixation):根据所检测抗原的性质选择适当的固定液根据所检测抗原的性质选择适当的固定液 和固定方法，固定液用量应是标本的和固定方法，固定液用量应是标本的4040倍。倍。1.1.常用的固定剂常用的固定剂(Fixative solution)(Fixative solution)1 1）单纯固定剂）单纯固定剂 丙酮丙酮(Acetone)(Acetone)：主要用于新鲜组织冰冻切片的快速固定，以：主要用于新鲜组织冰冻切片的快速固定，以 检测细胞表面抗原、自身抗体及细胞内外

13、的免疫球蛋白。检测细胞表面抗原、自身抗体及细胞内外的免疫球蛋白。甲醇甲醇(Methanol)(Methanol)：与：与丙酮相似。丙酮相似。 乙醇乙醇(Ethanol):(Ethanol):与丙酮相似。与丙酮相似。甲醛甲醛(formaldehyde):(formaldehyde):使用最广泛的固定剂，有多种剂型，包使用最广泛的固定剂，有多种剂型，包 括：括： 福马林（福马林（formolformol）: :即即10%10%甲醛水溶液，最常用的固定剂，甲醛水溶液，最常用的固定剂， 适用于各种组织固定。适用于各种组织固定。 中性福马林：含过饱和碳酸钙中性福马林：含过饱和碳酸钙（calcium ca

14、rbonate)calcium carbonate)的的10%10%甲甲 醛水溶液。醛水溶液。 缓冲中性福马林：以磷酸盐缓冲液配制的缓冲中性福马林：以磷酸盐缓冲液配制的10%10%甲醛溶液。甲醛溶液。 4% 4%多聚甲醛（多聚甲醛（paraformaldehydeparaformaldehyde）：以磷酸盐缓冲液配制的）：以磷酸盐缓冲液配制的 4% 4%多聚甲醛溶液。多聚甲醛溶液。2 2）复合固定剂）复合固定剂 Bouin Bouin氏液：含苦味酸（氏液：含苦味酸（nitroxanthic acidnitroxanthic acid）和冰醋酸）和冰醋酸 （glacial acetic acid

15、glacial acetic acid）的甲醛溶液。）的甲醛溶液。 Zamboni Zamboni氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。 PLP PLP（periodate-lysine-paraformaldehydeperiodate-lysine-paraformaldehyde）：含过碘酸和赖）：含过碘酸和赖 氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需预固定的冰冻组织切片。氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需预固定的冰冻组织切片。 2.2.固定方法：固定方法：必须用预冷（必须用预冷（4 4）的固定液固定，并保持低温持）的固定液固定，并保持低温持 续固定至所需时间续固定至所需

16、时间。 1 1）灌注固定（）灌注固定（perfusion fixationperfusion fixation）：最好的固定方法，尤其适）：最好的固定方法，尤其适 用于神经组织如脑、脊髓和视网膜。用于神经组织如脑、脊髓和视网膜。灌注固定后应迅速切取灌注固定后应迅速切取 所需组织，在预冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。所需组织，在预冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。2 2）浸泡固定：最普通和常用的固定方法，适用于除神经组织外的浸泡固定：最普通和常用的固定方法，适用于除神经组织外的 各种组织。各种组织。三）包埋和切片（三）包埋和切片（embedding and sectionembedding

17、 and section）1.1.石蜡切片基本步骤：石蜡切片基本步骤：1 1）逐级乙醇溶液脱水：使组织脱水，便于二甲苯（）逐级乙醇溶液脱水：使组织脱水，便于二甲苯（xylenexylene）介入）介入 的过程。时间的长短取决于组织块的过程。时间的长短取决于组织块的大小及的大小及结构。置结构。置80%80%以上的以上的 乙醇溶液时间过长，会使组织变硬变脆，应当避免。乙醇溶液时间过长，会使组织变硬变脆，应当避免。 70% 80% 90% 100%I 100%II 100%III 70% 80% 90% 100%I 100%II 100%III 2 2）透明：）透明：组织组织用二甲苯处理用二甲苯处理

18、以便石蜡以便石蜡介入的过程，时间长短取决介入的过程，时间长短取决 于组织快的大小，但不宜过长，以免组织过硬易脆。于组织快的大小，但不宜过长，以免组织过硬易脆。 二甲苯二甲苯I I 二甲苯二甲苯II II 二甲苯二甲苯III III 3 3）浸蜡：组织经二甲苯（）浸蜡：组织经二甲苯（xylenexylene）处理后石蜡介入的过程，时间）处理后石蜡介入的过程，时间 长短取决于组织快的大小。温度应控制在长短取决于组织快的大小。温度应控制在56 - 6056 - 60。4 4）包埋：用模具使组织块包于石蜡中成型的过程。）包埋：用模具使组织块包于石蜡中成型的过程。5 5）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多

19、余的部分，修成一定形状）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多余的部分，修成一定形状 的过程。的过程。6 6）切片：）切片：将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。一一 般切般切3636m m。2.2.冰冻切片的基本步骤：冰冻切片的基本步骤：1 1）固定：根据所检测组织的抗原性质决定是否先进行固定及选择固定：根据所检测组织的抗原性质决定是否先进行固定及选择 适当的固定剂。除非有特殊要求，否则应当适当的固定剂。除非有特殊要求，否则应当先进行固定以防止先进行固定以防止 抗原破坏及降解。抗原破坏及降解。 常用的固定液是常用的固定液是4%4%多聚甲醛（多聚

20、甲醛（paraformaldehydeparaformaldehyde）2 2）减少组织水分防止冰晶形成）减少组织水分防止冰晶形成: :通常采用高渗的通常采用高渗的30%30%蔗糖蔗糖(sucrose)(sucrose) 溶液吸收组织中的水分。溶液吸收组织中的水分。3 3）包埋：用于）包埋：用于冰冻切片组织的包埋剂冰冻切片组织的包埋剂是是OCT ( Cryo Embedding OCT ( Cryo Embedding Medium ) Medium ) 4 4）切片：将包在）切片：将包在OCTOCT中的组织安装在冰冻切片机上进行切割，切中的组织安装在冰冻切片机上进行切割，切 片的厚度一般为片

21、的厚度一般为5-205-20m。5 5）后固定：适用于未经固定的冰冻组织切片，常用固定液是丙酮）后固定：适用于未经固定的冰冻组织切片，常用固定液是丙酮 （acetone)acetone)和和4%4%多聚甲醛。多聚甲醛。四）预防脱片的措施：四）预防脱片的措施：1.1.载玻片的处理：载玻片的处理： 重铬酸钾（重铬酸钾（bichromicum Kaliumbichromicum Kalium）浓硫酸（）浓硫酸（concentrated concentrated sulfuric acidsulfuric acid）清洁液浸泡）清洁液浸泡2424小时小时 充分流水冲洗充分流水冲洗 去去离子水冲洗离子水

22、冲洗2 2遍遍 烘干烘干2.2.粘附剂的使用：粘附剂的使用： 2%3 2%3氨基乙氧基甲硅烷（氨基乙氧基甲硅烷（3-amino propyltriethoxy silane,3-amino propyltriethoxy silane, APES APES）：适用于石蜡切片的载玻片。）：适用于石蜡切片的载玻片。 0.1% 0.1%多聚左旋赖氨酸（多聚左旋赖氨酸（poly-L-lysinepoly-L-lysine）：）：适用于冰冻切片的适用于冰冻切片的 载玻片载玻片 四、常用的免疫组化方法四、常用的免疫组化方法一）免疫荧光法（一）免疫荧光法（应注意标本中自应注意标本中自 发荧光的影响发荧光的影

23、响）1.1.直接法或一步法直接法或一步法(direct method (direct method or one-step staining method) or one-step staining method) 用标记了荧光素的特异性抗体直用标记了荧光素的特异性抗体直 接与标本中相应的抗原结合。接与标本中相应的抗原结合。 优点：特异性高优点：特异性高 缺点：敏感性低缺点：敏感性低 2.2.间接法（间接法（indirect methodindirect method）：）： 荧光素不是荧光素不是标记在与标本中相应标记在与标本中相应 抗原结合的特异性抗体上抗原结合的特异性抗体上，而是而是 标记

24、在抗特异性抗体的第二抗体标记在抗特异性抗体的第二抗体 上。上。 优点：敏感性高优点：敏感性高 缺点：特异性低缺点：特异性低 二）免疫酶法二）免疫酶法1.1.直接法或一步法直接法或一步法(direct method or one-step staining (direct method or one-step staining method) method) 用标记了酶的特异性抗体直接与标本中相应的抗原结合，以酶底用标记了酶的特异性抗体直接与标本中相应的抗原结合，以酶底 物的反应显示抗原的分布物的反应显示抗原的分布。2.2.间接法间接法(indirect method)(indirect met

25、hod)： 常用的间接法：常用的间接法：1 1）两步法两步法（two-step staining methodtwo-step staining method）：）：优点优点: :敏感性很高，特异性高，不受内源性生物素影响。敏感性很高，特异性高，不受内源性生物素影响。缺点缺点: :背景染色高。背景染色高。2)2)过氧化物酶抗过氧化物酶过氧化物酶抗过氧化物酶（peroxidase anti-peroxidaseperoxidase anti-peroxidase，PAPPAP） 或碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（或碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（alkaline phosphatase anti- alka

26、line phosphatase anti- alkaline phosphatase, alkaline phosphatase, APAAPAPAAP）methodmethod优点：特异性高，优点：特异性高， 背景染色很低，不受内源性生物素影响。背景染色很低，不受内源性生物素影响。缺点：敏感性相对低。缺点：敏感性相对低。3.3.亲和素亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶复合物过氧化物酶复合物( avidin-biotin-eroxidase( avidin-biotin-eroxidase complex complex，ABC )ABC )或链亲和素或链亲和素- -生物素生物素- -

27、过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法 (labelled strepavidin-biotin-eroxidase complex (labelled strepavidin-biotin-eroxidase complex，LSAB)LSAB) method method 是是最广泛使用但不建议使用的方法，最广泛使用但不建议使用的方法，因为目前尚无去除内源性因为目前尚无去除内源性 生物素和亲和素的方法。生物素和亲和素的方法。 优点：敏感性高，特异性很低。优点：敏感性高，特异性很低。 缺点：极易受内源性生物素影响，假阳性率极高。缺点：极易受内源性生物素影响，假阳性率极高。五、免疫组织化学的特异

28、性与敏感性五、免疫组织化学的特异性与敏感性一）特异性（一）特异性（specificity):specificity):指免疫组化染色结果是否真正由特异指免疫组化染色结果是否真正由特异 性抗体和相应抗原结合而产生。包括方法特异性和抗体特异性。性抗体和相应抗原结合而产生。包括方法特异性和抗体特异性。1.1.方法特异性：证明是由抗体结合引起的结果。方法特异性：证明是由抗体结合引起的结果。 如：如： 加一抗加一抗 - - 有染色结果有染色结果 不加一抗不加一抗 - - 无染色结果无染色结果2.2.抗体特异性：证明是由所检抗原而非其它成分与一抗结合引起抗体特异性：证明是由所检抗原而非其它成分与一抗结合引

29、起 的染色结果。的染色结果。 如：用肝细胞抗体染肝组织如：用肝细胞抗体染肝组织 - - 有染色结果有染色结果 用肝细胞抗体染肾组织用肝细胞抗体染肾组织 - - 无染色结果无染色结果二）特异性染色和非特异性染色二）特异性染色和非特异性染色 1.1.特异性染色：由一抗与相应抗原特异性结合而产生的染色。染特异性染色：由一抗与相应抗原特异性结合而产生的染色。染 色部位是抗原分布的部位，显示出一定的结构背景，如细胞核色部位是抗原分布的部位，显示出一定的结构背景，如细胞核 细胞质和细胞膜，或组织和细胞内的某些特殊成分。细胞质和细胞膜，或组织和细胞内的某些特殊成分。2.2.非特异性：不是非特异性：不是由一抗

30、与相应抗原特异性结合而引起的染色。由一抗与相应抗原特异性结合而引起的染色。染染 色部位与抗原分布的部位无关。色部位与抗原分布的部位无关。3.3.特异性染色的检测特异性染色的检测1 1）设阳性对照：用已知抗原存在的标本对比所检测的标本。）设阳性对照：用已知抗原存在的标本对比所检测的标本。2 2）设阴性对照：用已知抗原不存在的标本或除去一抗的方法对比）设阴性对照：用已知抗原不存在的标本或除去一抗的方法对比 所检测的标本。所检测的标本。 阴性标本阴性标本: :不存在被检抗原的标本。不存在被检抗原的标本。 空白实验：组化染色程序中不加一抗。空白实验：组化染色程序中不加一抗。 替代实验：替代实验：组化染

31、色程序中组化染色程序中用同型（用同型（isotypeisotype）抗体替代一抗。）抗体替代一抗。 吸收实验：组化染色程序中用过量相应抗原吸收一抗以阻止标吸收实验：组化染色程序中用过量相应抗原吸收一抗以阻止标 本中的抗原与一抗结合。本中的抗原与一抗结合。三）敏感性三）敏感性(sensitivity)(sensitivity)：指所用的免疫组化方法能检测的抗原：指所用的免疫组化方法能检测的抗原 量。量。1.1.敏感性与特异性的关系：一般是相反的关系。敏感性与特异性的关系：一般是相反的关系。2.2.提高敏感性的方法：提高敏感性的方法：选用敏感的免疫组化染色方法：选用敏感的免疫组化染色方法： 如如E

32、nVisionEnVision两步法，两步法，PAPPAP或或APAAPAPAAP法，法，ABCABC法。法。选用含有放大作用的酶的免疫组化染色方法：选用含有放大作用的酶的免疫组化染色方法： 如碱性磷酸酶（如碱性磷酸酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase）对底物（）对底物（substratesubstrate） 的作用随时间的增加而增加，可选用含的作用随时间的增加而增加，可选用含碱性磷酸酶的碱性磷酸酶的EnVisionEnVision两两 步法或步法或APAAPAPAAP法。法。增加抗体的孵育时间：一般采取增加抗体的孵育时间：一般采取4 4过夜的方

33、式。过夜的方式。四）非特异性染色的来源及消除四）非特异性染色的来源及消除1.1.标本固定不适当或不充分标本固定不适当或不充分 丙酮固定的标本，尤其是它的冰冻切片标本，有极强的非特异性丙酮固定的标本，尤其是它的冰冻切片标本，有极强的非特异性 染色。应选用适当的固定剂及充分固定。染色。应选用适当的固定剂及充分固定。2.2.染色过程中切片干燥染色过程中切片干燥 应用湿盒及防止切片干燥应用湿盒及防止切片干燥3.3.内远性酶活性未被抑制或消耗内远性酶活性未被抑制或消耗 经固定的标本，其细胞内的过氧化物酶经固定的标本，其细胞内的过氧化物酶(peroxidase)(peroxidase)和碱性磷酸和碱性磷酸

34、 酶（酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase）不会被灭活，仍保持活性。）不会被灭活，仍保持活性。 过氧化物酶过氧化物酶 - 0.3%H2O2 - 0.3%H2O2消耗消耗 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 - - 左旋咪唑抑制，微波加热或左旋咪唑抑制，微波加热或0.2N 0.2N 盐酸盐酸(HCL)(HCL)破破 坏。坏。 采用免疫荧光方法。采用免疫荧光方法。4.4.游离醛基游离醛基 醛类固定剂未洗净，残留的游离醛基易与抗体非特异性结合。醛类固定剂未洗净，残留的游离醛基易与抗体非特异性结合。 彻底冲洗及用赖氨酸彻底冲洗及用赖氨酸、甘氨酸、白蛋白或正常血清封闭。

35、、甘氨酸、白蛋白或正常血清封闭。5.Fc5.Fc受体受体 标本中，尤其是冰冻切片或细胞甩片中，细胞膜上的免疫球蛋白标本中，尤其是冰冻切片或细胞甩片中，细胞膜上的免疫球蛋白 (immunoglobulin) Fc (immunoglobulin) Fc受体与抗体结合。受体与抗体结合。 与二抗同源的血清或非特异性抗体封闭。与二抗同源的血清或非特异性抗体封闭。6.6.疏水键和离子键疏水键和离子键 免疫球蛋白可通过疏水键和离子键与标本中的蛋白及其他成分非免疫球蛋白可通过疏水键和离子键与标本中的蛋白及其他成分非 特异性结合，抗血清中的补体也可通过疏水键和离子键与标本中特异性结合，抗血清中的补体也可通过疏

36、水键和离子键与标本中 的蛋白结合，再与抗体结合。的蛋白结合，再与抗体结合。 正常血清封闭正常血清封闭 尽可能稀释抗体尽可能稀释抗体 灭活补体灭活补体 增加抗体稀释液的离子强度（将增加抗体稀释液的离子强度（将PBSPBS改为改为TBSTBS） 抗体稀释液中添加去污剂（如抗体稀释液中添加去污剂（如TritonX-100, Twen-20)TritonX-100, Twen-20)7.7.天然抗体天然抗体 接受免疫的动物在自然过程中产生的对某些动物组织或血清成分接受免疫的动物在自然过程中产生的对某些动物组织或血清成分 的抗体。的抗体。 用相对应的动物血清或组织成分吸收用相对应的动物血清或组织成分吸收

37、, 或尽可能提高抗体稀释度。或尽可能提高抗体稀释度。8.8.杂质抗体杂质抗体 由于免疫原不纯，混有某些组织成分免疫动物所产生的抗体。由于免疫原不纯，混有某些组织成分免疫动物所产生的抗体。 尽可能提高抗体稀释度。尽可能提高抗体稀释度。9.9.自发荧光自发荧光 标本中的某些成分如红细胞标本中的某些成分如红细胞、弹性纤维、脂质等有自发荧光。、弹性纤维、脂质等有自发荧光。 改用免疫显色方法。改用免疫显色方法。六、免疫组化双重及多重染色六、免疫组化双重及多重染色一）免疫荧光一）免疫荧光双重及多重染色双重及多重染色 1.1.免疫荧光双重染色免疫荧光双重染色1)1)直接法：直接法： 直接用不同荧光染料标记的

38、两种抗体孵育标本。直接用不同荧光染料标记的两种抗体孵育标本。 如用如用FITC-CD45antibodyFITC-CD45antibody（绿色）（绿色）和和 Alexa flour555-CD20Alexa flour555-CD20 antibodyantibody（红色）（红色）检测淋巴组织中的检测淋巴组织中的T T细胞和细胞和B B细胞。细胞。 优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主（优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主（hosthost）的）的 抗体。抗体。 缺点：敏感性低。缺点：敏感性低。2)2)间接法间接法: : 第一抗体来源于第一抗体来源于非非同一种属同一种属,

39、可用以下方法：可用以下方法： A)A)先用各自非标记一抗孵育标本，再用不同荧光染料标记的各自二先用各自非标记一抗孵育标本，再用不同荧光染料标记的各自二 抗结合一抗。二抗可以是抗结合一抗。二抗可以是来源于同一种属，也可以不是来源于同一种属，也可以不是。如：如：一抗一抗: mouse anti-CD45 rabbit anti-CD20: mouse anti-CD45 rabbit anti-CD20二抗二抗: : FITC-goat anti-mouseFITC-goat anti-mouse IgGIgG TRITC-goat anti-rabbit IgGTRITC-goat anti-r

40、abbit IgG (green)(green) or or TRITC-donkey anti-rabbit IgGTRITC-donkey anti-rabbit IgG (red)(red) 优点：增加了敏感性。优点：增加了敏感性。 缺点：需用缺点：需用3-43-4种抗体，且一抗不能来源于同一种属。由于所用种抗体，且一抗不能来源于同一种属。由于所用 的抗体来源于不同种属，存在交叉反应的可能性，使用前的抗体来源于不同种属，存在交叉反应的可能性，使用前 需进行种属间的交叉实验。需进行种属间的交叉实验。B)B)也可先完成第一套抗体显示第一抗原，再进行第二套抗体显示第也可先完成第一套抗体显示第一

41、抗原，再进行第二套抗体显示第 二抗原。二抗原。第一抗体来源于第一抗体来源于同一种属，同一种属，可采取以下方法进行：可采取以下方法进行：A)A)在在完成第一套抗体显示第一抗原及保存了相应的图像后，用微波完成第一套抗体显示第一抗原及保存了相应的图像后，用微波 处理灭活第一套抗体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二处理灭活第一套抗体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二 抗可以是来源于同一种属，也可以不是抗可以是来源于同一种属，也可以不是, 但须标记不同荧光染料但须标记不同荧光染料。B)B)在完成第一套抗体显示第一抗原后，用饱和的与第一套一抗同一在完成第一套抗体显示第一抗原后，用饱和的与第一套一抗

42、同一 种属的免疫球蛋白封闭第一套抗体中二抗的未结合位点，再用荧种属的免疫球蛋白封闭第一套抗体中二抗的未结合位点，再用荧 光标记的第二套一抗直接进行第二抗原的显示。光标记的第二套一抗直接进行第二抗原的显示。2.2.免疫荧光多重染色免疫荧光多重染色 理论上可以使用理论上可以使用N N个不同荧光染料标记的抗体检测个不同荧光染料标记的抗体检测N N个不同抗原，个不同抗原， 实际使用上受荧光显微镜设置的荧光通道限制。通常荧光显微镜实际使用上受荧光显微镜设置的荧光通道限制。通常荧光显微镜 最多只能设置最多只能设置3-43-4个荧光通道。个荧光通道。1)1)直接法：直接法： 可直接用可直接用3 3个或个或3

43、 3个以上不同荧光染料标记的一抗显示相应的抗原。个以上不同荧光染料标记的一抗显示相应的抗原。2)2)间接法间接法: : 优点：可在一标本上检测优点：可在一标本上检测3 3个或个或3 3个以上不同的抗原。个以上不同的抗原。 缺点：由于缺点：由于不同种属来源的抗体间存在交叉反应的可能性大，不同种属来源的抗体间存在交叉反应的可能性大，非非 特异性反应极高。特异性反应极高。 第一抗体来源于第一抗体来源于非非同一种属，同一种属，可用以下方法：可用以下方法：A)A)先用先用3 3种或种或3 3种以上不同种属的非标记一抗孵育标本，再用不同荧种以上不同种属的非标记一抗孵育标本，再用不同荧 光染料标记的二抗各自

44、结合一抗，一抗和二抗间不能有来源于同光染料标记的二抗各自结合一抗，一抗和二抗间不能有来源于同 一种属的抗体。一种属的抗体。B)B)也可按先后顺序进行各套抗体显示各自抗原。也可按先后顺序进行各套抗体显示各自抗原。第一抗体来源于第一抗体来源于同一种属：同一种属： 可在完成每套抗体显示各自抗原及保存了相应的图像后，用微波可在完成每套抗体显示各自抗原及保存了相应的图像后，用微波 处理灭活各套抗体处理灭活各套抗体, ,再进行后续不同荧光的各套抗体显示后续的再进行后续不同荧光的各套抗体显示后续的 各个抗原。各个抗原。 此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微

45、波处理。二）免疫酶双重及多重染色二）免疫酶双重及多重染色 前提条件：必须预先去除内源性因数（如过氧化物酶，碱性磷酸前提条件：必须预先去除内源性因数（如过氧化物酶，碱性磷酸 酶，生物素，亲和素等）的影响。酶，生物素，亲和素等）的影响。应该提醒的是，目前尚无方法应该提醒的是，目前尚无方法 去除内源性生物素和亲和素。去除内源性生物素和亲和素。1.1.免疫酶双重染色免疫酶双重染色1)1)直接法：直接法： 先去除先去除内源性内源性因数因数( (如过氧化物酶，碱性磷酸酶，生物素，亲和如过氧化物酶，碱性磷酸酶，生物素，亲和 素等素等) )的活性的活性, 再加不同的酶标记的抗体再加不同的酶标记的抗体, ,以各

46、自抗体标记酶的底以各自抗体标记酶的底 物反应显示抗原的分布。如用物反应显示抗原的分布。如用HRPHRP-CD68 antibody -CD68 antibody 和和 APAP-CD105-CD105 antibody antibody 检测炎症组织中的巨噬细胞和中性粒细胞检测炎症组织中的巨噬细胞和中性粒细胞, ,分别以分别以DABDAB ( (棕色棕色) )和和 fast redfast red（红色红色）显色。）显色。 优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主的抗体。优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主的抗体。 缺点：敏感性低缺点：敏感性低, ,必须用不同的标记酶及底物。必须用

47、不同的标记酶及底物。2)2)间接法间接法: : 优点：敏感性高。优点：敏感性高。 缺点：特异性低。缺点：特异性低。第一抗体来源于第一抗体来源于非非同一种属，同一种属，可用以下方法：可用以下方法：A)A)先用各自非标记一抗孵育标本，再加不同酶标记的二抗系统先用各自非标记一抗孵育标本，再加不同酶标记的二抗系统( (如如 HRP-polymer HRP-polymer和和AP-polymer,SP-ABCAP-polymer,SP-ABC和和SAP-ABC)SAP-ABC)及酶底物显示各自及酶底物显示各自 抗原。二抗系统可以是来源于同一种属，也可以不是，但必须标抗原。二抗系统可以是来源于同一种属，也

48、可以不是，但必须标 记不同的酶。记不同的酶。B)B)也可先完成第一套抗体系统显示第一抗原，再进行第二套抗体系也可先完成第一套抗体系统显示第一抗原，再进行第二套抗体系 统显示第二抗原。它们的二抗系统可以是来源于同一种属，也可统显示第二抗原。它们的二抗系统可以是来源于同一种属，也可 以不是，但必须标记不同的酶。以不是，但必须标记不同的酶。C)C)如欲使用如欲使用PAPPAP和和APAAPAPAAP的二抗系统，则二抗系统之间及二抗系统与的二抗系统，则二抗系统之间及二抗系统与 一抗之间一抗之间不能不能有来源于有来源于同一种属同一种属的抗体。的抗体。第一抗体来源于第一抗体来源于同一种属：同一种属： 可在

49、完成第一套抗体显示第一抗原后可在完成第一套抗体显示第一抗原后, , 用微波处理灭活第一套抗用微波处理灭活第一套抗 体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二抗可以是来源于同体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二抗可以是来源于同 一种属，也可以不是一种属，也可以不是, ,但必须标记不同的酶。但必须标记不同的酶。2.2.免疫酶多重染色免疫酶多重染色 理论上可以使用理论上可以使用N N个不同酶标记的抗体显示个不同酶标记的抗体显示N N个不同抗原，实际使个不同抗原，实际使 用上受常用标记酶的限制。通常最常用的是用上受常用标记酶的限制。通常最常用的是过氧化物酶过氧化物酶和和碱性磷碱性磷 酸酶酸酶，而酶的

50、底物则相对多些。，而酶的底物则相对多些。1)1)直接法直接法: : 受常用标记酶的限制受常用标记酶的限制, 实际上只能实际上只能直接用直接用2 2个不同酶标记的一抗个不同酶标记的一抗 显示相应的显示相应的2 2个抗原。个抗原。2)2)间接法间接法: : 由于需用三套或三套以上抗体系统，抗体间存在交叉反应的可由于需用三套或三套以上抗体系统，抗体间存在交叉反应的可 能性大，非特异性反应强，因此最好的方法是在完成每套抗体能性大，非特异性反应强，因此最好的方法是在完成每套抗体 显示各自抗原后，用微波处理灭活各套抗体显示各自抗原后，用微波处理灭活各套抗体, ,再进行后续不同套再进行后续不同套 抗体显示后

51、续的各个抗原。抗体显示后续的各个抗原。 此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。三）三）免疫酶及免疫荧光双重及多重染色免疫酶及免疫荧光双重及多重染色 一般先进行免疫酶染色，再进行免疫荧光染色。一般先进行免疫酶染色，再进行免疫荧光染色。由于通常只有由于通常只有 红、绿、棕、蓝（或紫）红、绿、棕、蓝（或紫）4 4种颜色可用，故至多只能进行种颜色可用，故至多只能进行1-21-2种种 免疫组化染色和免疫组化染色和2-32-3种免疫荧光染色的组合。种免疫荧光染色的组合。 原位杂交原位杂交 也被称作原位杂交组织化学也被称作原位杂交组织化学(In si

52、tu hybridization histo-(In situ hybridization histo-chemistrychemistry），简称），简称原位杂交原位杂交(in situ hybridization,ISH)(in situ hybridization,ISH)和荧光和荧光原位杂交原位杂交(fluorescein in situ hybridization,FISH)(fluorescein in situ hybridization,FISH) 一、基本原理一、基本原理 ： 利用两条互补的单核苷酸链，在适当的温度和离子浓度下，通过利用两条互补的单核苷酸链，在适当的温度和离子

53、浓度下，通过 互补互补碱基对之间的氢键紧密结合，形成稳定的杂交双链的特性，碱基对之间的氢键紧密结合，形成稳定的杂交双链的特性， 将带有标记物的已知将带有标记物的已知核酸某段核酸某段碱基序列做为探针，与标本中的相碱基序列做为探针，与标本中的相 应核酸进行特异性结合，再应用与标记物相应的检测系统，通过应核酸进行特异性结合，再应用与标记物相应的检测系统，通过 荧光荧光、免疫酶染色或放射性核素显示杂交信号，进行免疫酶染色或放射性核素显示杂交信号，进行相应相应核酸在核酸在 细胞内的定位及定量。细胞内的定位及定量。 二二、探针的制备：、探针的制备： 一）探针的种类一）探针的种类1.1.基因组基因组DNAD

54、NA探针：探针： 是使用最广泛的探针是使用最广泛的探针, ,可通过限制性内切酶酶切和可通过限制性内切酶酶切和PCRPCR方法获得。方法获得。 由于此类探针是双链由于此类探针是双链DNA,DNA,使用前必须进行变性处理。使用前必须进行变性处理。2.cDNA2.cDNA探针：探针： cDNA cDNA是互补于是互补于mRNAmRNA的的DNADNA分子分子, ,可从可从cDNAcDNA文库中克隆获得文库中克隆获得, ,也可通也可通 过过RT-PCRRT-PCR方法获得，由于此类探针也是双链方法获得，由于此类探针也是双链DNA,DNA,使用前也必须使用前也必须 进行变性处理。进行变性处理。3.3.寡

55、核苷酸探针：寡核苷酸探针： 通过化学合成技术合成的单链通过化学合成技术合成的单链DNADNA，一般长度为，一般长度为20-50bp20-50bp。 以上都是以上都是DNADNA探针，由于探针，由于DNADNA与与DNADNA或或RNARNA的结合效率低，故敏感性的结合效率低，故敏感性 低，且无法做正义低，且无法做正义(sense)(sense)和反义和反义(antisense)(antisense)探针的对照实验，探针的对照实验， 一般用于一般用于DNADNA的杂交检测。的杂交检测。 4.cRNA 4.cRNA探针：探针： cRNA cRNA探针是以探针是以cDNAcDNA为模板在体外转录而成

56、的单链为模板在体外转录而成的单链RNARNA探针。由于探针。由于 它是它是RNARNA，与，与DNADNA或或RNARNA的结合效率高，故敏感性高，并可做的结合效率高，故敏感性高，并可做sensesense 和和antisenseantisense探针的对照实验，常用于探针的对照实验，常用于mRNAmRNA的杂交检测的杂交检测, ,也可用于也可用于 DNA DNA的杂交检测。的杂交检测。二）探针的标记二）探针的标记1.1.探针的标记物：探针的标记物： 标记物被标记在核酸标记物被标记在核酸(NTP)(NTP)或脱氧核酸或脱氧核酸(dNTP)(dNTP)上，随上，随RNARNA或或DNADNA的的

57、 合成而掺入。合成而掺入。1 1）放射性标记物：）放射性标记物： 常用的放射性标记物是常用的放射性标记物是3232P(P(磷磷) )、3 3H(H(氚氚) )和和3535S(S(硫硫) )。2 2）非放射性标记物：）非放射性标记物： 常用的非放射性标记物是常用的非放射性标记物是digoxigenin(digoxigenin(地高辛地高辛) )、fluoresceinfluorescein isothiocyanate isothiocyanate（FITCFITC，异硫氰酸荧光素）和，异硫氰酸荧光素）和biotin(biotin(生物素生物素) )。2.2.探针的标记方法：探针的标记方法：1)

58、DNA1)DNA探针的标记方法探针的标记方法: :缺口平移法缺口平移法(nick translation)(nick translation)随机引物法随机引物法(random primer)(random primer)末端标记法末端标记法(end-(end-labelling)labelling)B)T4B)T4聚合酶替代法聚合酶替代法A)3A)3末端标记法末端标记法PCRPCR扩增标记法扩增标记法2)RNA2)RNA探针的标记方法探针的标记方法: :55末端标记法末端标记法RNARNA体外转录法体外转录法三、三、mRNAmRNA原位杂交原位杂交( (非放射性探针非放射性探针) )基本程序

59、基本程序一）标本的制备一）标本的制备1.1.组织标本的取材组织标本的取材 取材原则取材原则: :尽可能快的切取所需组织浸入固定液尽可能快的切取所需组织浸入固定液, ,保持组织的新保持组织的新 鲜以最大限度地防止细胞内鲜以最大限度地防止细胞内mRNAmRNA或或DNADNA的降解的降解, , 有条有条 件的最好在冷库取材。件的最好在冷库取材。2.2.固定固定 固定液用量应是标本的固定液用量应是标本的4040倍。倍。1)1)常用的固定剂常用的固定剂 单纯固定剂单纯固定剂 4% 4%多聚甲醛多聚甲醛: :常用常用 缓冲中性福马林缓冲中性福马林: :常用常用 福马林福马林(10%(10%甲醛水溶液甲醛

60、水溶液) ) 中性福马林中性福马林 复合固定剂复合固定剂 Bouin Bouin氏液：常用氏液：常用 Zamboni Zamboni氏液：常用氏液：常用2)2)固定方法：固定方法：必须用预冷（必须用预冷（4 4）的固定液固定，并保持低温持）的固定液固定，并保持低温持 续固定至所需时间续固定至所需时间。 1)1)灌注固定：最好的固定方法，尤其适用于神经组织如脑、脊髓灌注固定：最好的固定方法，尤其适用于神经组织如脑、脊髓 和视网膜。灌注固定后应迅速切取所需组织，在预和视网膜。灌注固定后应迅速切取所需组织，在预 冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。2)2)浸泡固定

61、：最普通和常用的固定方法，适用于除神经组织外的浸泡固定：最普通和常用的固定方法，适用于除神经组织外的 各种组织。各种组织。3.3.包埋和切片包埋和切片: :采用石蜡包埋和切片，切片厚度应为采用石蜡包埋和切片，切片厚度应为4-6um4-6um。一般。一般 不用冰冻切片，因为容易脱片。不用冰冻切片，因为容易脱片。4.4.切片的杂交前处理：切片的杂交前处理：1)1)石蜡切片的回水：经二甲苯、逐级酒精等脱蜡回水。石蜡切片的回水：经二甲苯、逐级酒精等脱蜡回水。2)2)去除内源性碱性磷酸酶或过氧化物酶活性：切片在去除内源性碱性磷酸酶或过氧化物酶活性：切片在0.2N 0.2N 盐酸盐酸 0.3% Trito

62、nX-100 0.3% TritonX-100水溶液中浸泡水溶液中浸泡4040分钟以灭活内源性碱性磷分钟以灭活内源性碱性磷 酸酶，或用酸酶，或用0.3% H2O20.3% H2O2孵育孵育4040分钟以消耗内源性过氧化物酶活分钟以消耗内源性过氧化物酶活 性。如果是做性。如果是做FISH,FISH,则可省略此步骤。则可省略此步骤。 3)3)暴露暴露mRNAmRNA或或DNA: DNA: 加加proteinase K proteinase K 溶液置溶液置37203720分钟以暴露细分钟以暴露细 胞的胞的mRNAmRNA，或微波加热以暴露细胞的，或微波加热以暴露细胞的DNADNA。4)4)预杂交处

63、理：加无探针的杂交液预处理预杂交处理：加无探针的杂交液预处理切片。此切片。此步骤无必要，步骤无必要， 可以省略。可以省略。5)5)探针杂交探针杂交: :加含探针的杂交液置加含探针的杂交液置4646过夜（放在摇床上更好），过夜（放在摇床上更好）， 以以sensesense和和antisenseantisense探针互为对照。探针互为对照。6)6)杂交后的洗涤：置杂交后的洗涤：置4646去离子水洗切片去离子水洗切片3 3次，每次次，每次1515分钟（放在分钟（放在 摇床上洗更好摇床上洗更好），以除去未杂交的），以除去未杂交的探针。探针。7)7)杂交信号的检测：加碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的羊抗地高

64、辛杂交信号的检测：加碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的羊抗地高辛 抗体室温孵育抗体室温孵育2 2小时，加酶底物小时，加酶底物NBT/BCIPNBT/BCIP或或DABDAB显色。如做显色。如做FISHFISH 则可省略此步骤。则可省略此步骤。8)8)封片及杂交结果检查：一般用水溶性封片剂封片，封片及杂交结果检查：一般用水溶性封片剂封片，酶底物显色的酶底物显色的 标本在普通显微镜下标本在普通显微镜下检查检查，FISHFISH在荧光下在荧光下检查。检查。附附1 1：mRNAmRNA原位杂交程序原位杂交程序1.1.石蜡切片经二甲苯、逐级酒精等脱蜡回水。石蜡切片经二甲苯、逐级酒精等脱蜡回水。2.2.切片在切

65、片在0.2N 0.2N 盐酸盐酸0.3%TritonX-1000.3%TritonX-100水溶液中浸泡水溶液中浸泡4040分钟以灭活内分钟以灭活内 源性碱性磷酸酶。与此同时配制源性碱性磷酸酶。与此同时配制10ug/ml10ug/ml的的Proteinase KProteinase K溶液溶液 （10ug Proteinase K10ug Proteinase K在在1 ml Proteinase K1 ml Proteinase K激活液中）。激活液中）。3.3.用去离子水洗切片用去离子水洗切片4 4次，加次，加Proteinase KProteinase K溶液置溶液置3715-20371

66、5-20分钟，分钟， 无无RNaseRNase水（水（DEPCDEPC处理）水洗切片处理）水洗切片4 4次。次。4.4.加杂交液置加杂交液置4646过夜（放在摇床上更好）。过夜（放在摇床上更好）。5.465.46去离子水洗切片去离子水洗切片3 3次，每次次，每次1515分钟（放在摇床上洗更好）。分钟（放在摇床上洗更好）。6.6.加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体（加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体（1 1：200200，用，用1%BSA PBS1%BSA PBS配配 制）室温孵育制）室温孵育2 2小时。小时。7.PBS7.PBS洗洗3 3次，加次，加NBT/BCIPNBT/BCIP显色显色3 3分

67、钟至分钟至3030分钟。分钟。8.8.水溶性封片剂封片。水溶性封片剂封片。附附2 2：溶液配方：溶液配方 1.1.Proteinase KProteinase K激活液激活液 (PH7.4)(PH7.4)： 50mM Tris-HCl (PH7.4) 50mM Tris-HCl (PH7.4) 5mM CaCl2 5mM CaCl22.2.杂交液杂交液(10ml(10ml，-20-20保存，临用前加入保存，临用前加入1-2ug/ml1-2ug/ml的的cRNAcRNA探针探针) )： 100% 100%去离子甲酰胺去离子甲酰胺5ml5ml 50% 50%葡聚糖硫酸酯葡聚糖硫酸酯（dextran

68、 sulfate, sigma D8906dextran sulfate, sigma D8906）2ml2ml 40x Denhardts 40x Denhardts液液 50ul 50ul 1M Tris-HCl 1M Tris-HCl （PH8.0PH8.0）100ul100ul 5M NaCl 600ul 5M NaCl 600ul 0.5M EDTA (PH8.0) 20ul 0.5M EDTA (PH8.0) 20ul 1M DTT 100ul 1M DTT 100ul 无无RNaseRNase水水2.130ml 2.130ml 1)40x Denhardts1)40x Denha

69、rdts液液(40ml, (40ml, 过滤除菌过滤除菌):): 聚蔗糖（聚蔗糖（polysucrose400, sigmaP7798polysucrose400, sigmaP7798）0.4g0.4g 聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone40000, sigmaPVP-40polyvinylpyrrolidone40000, sigmaPVP-40 or P0930 or P0930）0.4g0.4g 牛血清白蛋白牛血清白蛋白0.4g0.4g2)50%2)50%葡聚糖硫酸酯（葡聚糖硫酸酯（10ml, 10ml, 高压灭菌，高压灭菌，-20-20保存）：保

70、存）： 葡聚糖硫酸酯葡聚糖硫酸酯5g5g 无无RNaseRNase水水10ml10ml3)1M DTT:3)1M DTT:（过滤除菌过滤除菌，-20-20保存）保存） DTT 1g DTT 1g 加无加无R,NaseR,Nase水溶解至水溶解至6ml6ml。 附附3 3：注意事项注意事项1.1.用于配制溶液的水应是用于配制溶液的水应是无无RNaseRNase水。水。2.cRNA2.cRNA探针的浓度通过点在尼龙膜上的探针标记效率来推测，以探针的浓度通过点在尼龙膜上的探针标记效率来推测，以 1:10000 1:10000的标记效率为准，为的标记效率为准，为1ug/ul1ug/ul。3.3.无需预

71、杂交，因为有或无此步骤结果无差别。无需预杂交，因为有或无此步骤结果无差别。4.4.加抗体之前无需加封闭液，因为封闭液无任何效果。加抗体之前无需加封闭液，因为封闭液无任何效果。 四四.mRNA.mRNA原位双杂交原位双杂交（Double in situ hybridization for mRNA)Double in situ hybridization for mRNA)一）方法一）方法 与普通与普通mRNAmRNA原位杂交方法相同，只是在杂交液中加入了两种不原位杂交方法相同，只是在杂交液中加入了两种不 同标记物的探针同标记物的探针, ,如如digoxigenindigoxigenin标记的探

72、针和标记的探针和FITCFITC标记的探针。标记的探针。 可以在同一个标本上检测两种可以在同一个标本上检测两种mRNAmRNA的表达。的表达。二）注意事项二）注意事项 1.1.进行进行mRNAmRNA原位双杂交时，应先封片检测原位双杂交时，应先封片检测FISHFISH信号并保存所需图信号并保存所需图 像，之后再加抗像，之后再加抗digoxigenindigoxigenin抗体及相应底物显色。抗体及相应底物显色。2.2.不建议使用不建议使用biotin(biotin(生物素生物素) )标记探针，因为目前还无方法可去标记探针，因为目前还无方法可去 除内源性生物素的影响。除内源性生物素的影响。五五.

73、 .顺序免疫组化和原位杂交多种染色顺序免疫组化和原位杂交多种染色( (Sequential staining of immunohistochemistry and Sequential staining of immunohistochemistry and in situ hybridizationin situ hybridization) )一）基本原理一）基本原理 醛类固定的组织蛋白质发生变性及交联，醛类固定的组织蛋白质发生变性及交联，mRNAmRNA被包裹在其中。只被包裹在其中。只 要不被暴露，要不被暴露，mRNAmRNA就不会降解。就不会降解。二）方法二）方法 一般先进行免疫组化染色后再进行原位杂交。选择对比度大颜色一般先进行免疫组化染色后再进行原位杂交。选择对比度大颜色 搭配。搭配。