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1、miRNeasy Mini kit实验前注意事项:1、 这个实验方法是为了从组织(和/或)细胞中提取总 RNA,包括小分子 RNA。2、 有必要的话,可以加热使 Buffer RWT 中的沉淀溶解。3、 除了步骤 5 中的液相分离,其他操作均应该在室温下进行(15-25) ,动作要迅速。4、 Buffer RWT and Buffer RPE 原液在使用前应加入(96-100%)的乙醇(根据标签上的体积添加) 。5、 在开始第一步之前, 根据 miRNeasy Mini Kit Handbook 中的建议选择合适的打碎组织细胞的方法。实验步骤:1、 向组织或细胞中添加 700L 的 QIAzo
2、l 裂解液, (组织的话,可以称取大概50mg,加入 1ml 裂解液,最后吸取 700L)选择合适的方法裂解细胞或组织。(组织一般选用匀浆机,每一个组织大概研磨 3-4 次) 。2、 室温(15-25)下孵育匀浆 5 分钟。3、 每管中加入 140L 的氯仿(三氯甲烷) ,并盖紧盖,大力晃动 15s。4、 室温下孵育 2-3 分钟。5、 4离心 15 分钟(12000g) 。6、 将上层清液转移到一个新的 EP 管中,注意避免不要混入下层液相,加入倍体积(通常是 525L)的无水乙醇,然后混匀。7、 吸取 700L 的样本转移到 RNeasy Mini 柱内, 并放入 2ml 的收集管中。 室
3、温离心 8000g,15 秒。弃掉收集管中的液体。8、 重复步骤 7,收集将剩余的样本。9、 选做:根据手册附录 B 中的说明进行 DNA 酶消化(不需要使用 miScript PCRsystem 进行 miRNA 的鉴定) 。10、11、12、13、14、15、向离心柱内加入 700L 的 Buffer RWT,8000g 离心,15s,弃滤液。吸取 500L 的 Buffer RPE 于离心柱内,8000g 离心,15s,弃滤液。吸取 500L 的 Buffer RPE 于离心柱内,8000g 离心,2min,弃滤液。选做:将 RNeasy Mini 柱移入一个新的 2ml 收集管内,最大转速离心将 Neasy Mini 柱转移到新的的 EP 管内。 于柱内加入 30-50L 的 DEPC 水。如果期望 RNA 产量大于 30g, 可以加入额外的 30-50LDEPC 水, 或者使如果用的样本是细胞,这一步是选做的。1min。8000g 离心 1min。用第 14 步中收集到的液体 (如果需要一个较高的 RNA 浓度) , 再次进行离心,收集滤液。