《EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定课件（24页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验实验5454E.Coli 感感受受态态细细胞胞的的制制备备、质质粒粒DNADNA的转化、提取与酶切鉴定的转化、提取与酶切鉴定 1EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定一一. 实验目的和要求实验目的和要求 1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒受态细胞和质粒DNADNA转化受体菌细胞的原理与技术；转化受体菌细胞的原理与技术；2 2、了解质粒了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒细胞中分离、提取质粒DNA的方法；的方法；3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂
2、糖凝胶电泳、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；的操作方法； 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。用。2EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定二二.实验原理实验原理 1 1、感感受受态态细细胞胞制制备备: :所所谓谓感感受受态态是是指指受受体体细细胞胞处处于于容容易易吸吸收收外外源源DNADNA的的一一种种生生理理状状态态，可可以以通通过过物物理理与与化化学学方方法法诱诱导导形形成成，也也可可以以自自然然形形成成，在
3、在基基因因工工程程技技术术中中通通常常采采用用诱诱导导的的方方法法。用用于于转转化化的的受受体体菌菌细细 胞胞 一一 般般 是是 限限 制制 - -修修 饰饰 系系 统统 （ Restriction-Restriction-ModificationModification）缺缺陷陷的的变变异异株株，以以防防止止对对导导入入的的外外源源DNADNA的的切切割割，用用符符号号R R- -M M- -表表示示。其其基基本本原原理理是是：细细菌菌处处于于00的的CaClCaCl2 2低低渗渗溶溶液液中中，会会膨膨胀胀成成球球形形，细细胞胞膜膜的的通通透透性性发发生生变变化化，转转化化混混合合物物中中的
4、的质质粒粒DNADNA形形成成抗抗DNaseDNase的羟基的羟基- -钙磷酸复合物黏附于细胞表面，钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经经3EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 过过过过4242短短短短时时时时间间间间的的的的热热热热激激激激处处处处理理理理，促促促促进进进进细细细细胞胞胞胞吸吸吸吸收收收收DNADNA复复复复合合合合物物物物，在在在在丰丰丰丰富富富富的的的的培培培培养养养养基基基基上上上上生生生生长长长长数数数数小小小小时时时时后后后后，球球球球状状状状细细细细胞胞胞胞复复复复原原原原并并并并分分分分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的裂增殖，在选择培养基上可获得
5、所需的裂增殖，在选择培养基上可获得所需的裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子转化子转化子转化子。 2 2、碱碱碱碱裂裂裂裂解解解解法法法法小小小小量量量量制制制制备备备备质质质质粒粒粒粒DNADNA：碱碱碱碱裂裂裂裂解解解解法法法法是是是是基基基基于于于于线线线线性性性性大大大大分分分分子子子子染染染染色色色色体体体体DNADNA与与与与小小小小分分分分子子子子环环环环形形形形质质质质粒粒粒粒DNADNA的的的的变变变变性性性性复复复复性性性性的的的的差差差差异异异异达达达达到到到到分分分分离离离离目目目目的的的的的的的的，在在在在pH12.0pH12.012.612.6的的的的碱碱碱碱性
6、性性性环环环环境境境境中中中中，线线线线型型型型染染染染色色色色体体体体DNADNA和和和和环环环环型型型型质质质质粒粒粒粒DNADNA氢氢氢氢键键键键会会会会发发发发生生生生断断断断裂裂裂裂，双双双双链链链链解解解解开开开开而而而而变变变变性性性性，但但但但质质质质粒粒粒粒DNADNA由由由由于于于于其其其其闭闭闭闭合合合合环环环环型型型型结结结结构构构构，氢氢氢氢键键键键仅仅仅仅发发发发生生生生部部部部分分分分断断断断裂裂裂裂，而而而而且且且且其其其其互互互互补补补补链链链链不不不不完完完完全全全全分分分分离离离离；当当当当将将将将pHpH值值值值调调调调节节节节到到到到中中中中性性性性并
7、并并并在在在在高高高高盐盐盐盐浓浓浓浓度度度度下下下下，已已已已分分分分开开开开的的的的染染染染色色色色体体体体DNADNA互互互互补补补补链链链链不不不不能能能能复复复复性性性性而而而而交交交交联联联联形形形形成成成成不不不不溶溶溶溶的的的的网网网网状状状状结结结结构，通过离心，大部分染色体构，通过离心，大部分染色体构，通过离心，大部分染色体构，通过离心，大部分染色体DNADNA、不稳定的大分子、不稳定的大分子、不稳定的大分子、不稳定的大分子4EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 RNARNA和蛋白质和蛋白质和蛋白质和蛋白质-SDS-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，复
8、合物等一起沉淀下来而被除去，复合物等一起沉淀下来而被除去，复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒而部分变性的闭合环状的质粒而部分变性的闭合环状的质粒而部分变性的闭合环状的质粒DNADNA在中性条件下很快复在中性条件下很快复在中性条件下很快复在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒离心后上清中便含有所需要的质粒离心后上清中便含有所需要的质粒离心后上清中便含有所需要的质粒DNADNA
9、。 3 3、限制性内切酶：、限制性内切酶：、限制性内切酶：、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一又称为内切酶或限制酶，是一又称为内切酶或限制酶，是一又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链类能识别双链类能识别双链类能识别双链DNADNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNADNA水解酶，水解酶，水解酶，水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性，中。根据限制酶的
10、识别切割特性，中。根据限制酶的识别切割特性，中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具催化条件及是否具催化条件及是否具催化条件及是否具有修饰酶活性可分为有修饰酶活性可分为有修饰酶活性可分为有修饰酶活性可分为 、IIIIII型三大类，型三大类，型三大类，型三大类， 类和类和类和类和IIIIII类限类限类限类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用甲基化作用甲基化作用甲基化作用及依赖及依赖及依赖及依赖ATPATP的限制性内切酶活性的限制性内切酶活性的限制性内切酶活性的限制性内切酶活性。 类限制
11、性内切酶结合于特类限制性内切酶结合于特类限制性内切酶结合于特类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合定识别位点，但却随机地切割回转到被结合定识别位点，但却随机地切割回转到被结合定识别位点，但却随机地切割回转到被结合5EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 处的处的处的处的DNADNA。类限制性内切酶在识别位点上切割，然类限制性内切酶在识别位点上切割，然类限制性内切酶在识别位点上切割，然类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故后从底物上解离下来。故后从底物上解离下来。故后从底物上解离下来。故 类和类和类和类和限制酶在基因工程中限制酶在基因工程
12、中限制酶在基因工程中限制酶在基因工程中基本不用，基本不用，基本不用，基本不用，IIII类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下：如下：如下：如下： (1) (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR IEcoR I识别与切割序列为识别与切割序列为识别与切割序列为识别与切割序列为5GAATTC35GAATTC3 3CTTAAG5 3CTTAAG5 (2) (2
13、) 、识别的核苷酸数目大多数为、识别的核苷酸数目大多数为、识别的核苷酸数目大多数为、识别的核苷酸数目大多数为4 46 6个，少数识别个，少数识别个，少数识别个，少数识别8 81313个；个；个；个； (3) (3)、识别序列大多数为、识别序列大多数为、识别序列大多数为、识别序列大多数为二重对称（回文序列）二重对称（回文序列）二重对称（回文序列）二重对称（回文序列），大，大，大，大多数酶产生的是具有凸出的多数酶产生的是具有凸出的多数酶产生的是具有凸出的多数酶产生的是具有凸出的粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端：6EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 (4) (4)、有不同来源的
14、限制性内切酶可以识别相同的序列，、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为甚至切割的位点也相同，称为同裂酶同裂酶或或异源同工酶异源同工酶，如，如Hpa IIHpa II与与Msp IMsp I；有的识别位点不同，但对；有的识别位点不同，但对DNADNA切割后可产切割后可产生相同的粘性末端，称为生相同的粘性末端，称为同尾酶同尾酶，如，如BamHBamH I I与与BglBgl IIII。7EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素：
15、 DNADNADNADNA的纯度；的纯度；的纯度；的纯度； DNA DNA DNA DNA的甲基化程度；的甲基化程度；的甲基化程度；的甲基化程度； 酶切消化反酶切消化反酶切消化反酶切消化反应的温度；应的温度；应的温度；应的温度； DNA DNA DNA DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类；的分子结构；溶液中离子浓度及种类；的分子结构；溶液中离子浓度及种类；的分子结构；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的缓冲液的缓冲液的缓冲液的 pH pH pH pH值。值。值。值。 4 4、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳: : 琼脂糖溶化再凝固后能形成琼脂糖溶化再凝固后能形成琼
16、脂糖溶化再凝固后能形成琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 ( (密度与密度与密度与密度与琼脂糖浓度相关琼脂糖浓度相关琼脂糖浓度相关琼脂糖浓度相关) )；而生理条件下，核酸分子的糖；而生理条件下，核酸分子的糖；而生理条件下，核酸分子的糖；而生理条件下，核酸分子的糖- -磷磷磷磷酸骨架中磷酸基团呈酸骨架中磷酸基团呈酸骨架中磷酸基团呈酸骨架中磷酸基团呈离子化离子化离子化离子化状态，因此将核酸分子置状态，因此将核酸分子置状态，因此将核酸分子置状态，因此将核酸分子
17、置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖- -磷酸骨架在磷酸骨架在磷酸骨架在磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链结构上的重复性，相同数量的双链结构上的重复性，相同数量的双链结构上的重复性，相同数量的双链DNADNA几乎具有等量几乎具有等量几乎具有等量几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，在一定的电场强度
18、下，在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的迁移率取决于核酸分子的迁移率取决于核酸分子的迁移率取决于核酸分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子本身的大小和构象。分子本身的大小和构象。分子本身的大小和构象。分子量较小的分子量较小的分子量较小的分子量较小的DNADNA分子，比分子，比分子，比分子，比分子量较大的分子量较大的分子量较大的分子量较大的DNADNA分子，具有较紧密的构型，所以分子，具有较紧密的构型，所以分子，具有较紧密的构型，所以分子，具有较紧密的构型，所以其其其其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环电泳迁移速率
19、也就比同等分子量的松散型的开环电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNADNA分子或线性分子或线性分子或线性分子或线性DNADNA分子要快分子要快分子要快分子要快。直接用低浓度的。直接用低浓度的。直接用低浓度的。直接用低浓度的EBEB进行染进行染进行染进行染8EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定色，可确定色，可确定DNA在胶中的位置。在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳影响琼脂糖凝胶电泳DNADNA迁移率的因素：迁移率的因素： DNADNA的分子大小；的分子大小； 琼脂糖浓度；琼脂糖浓度； DNA DNA构象；构象； 电场强电场强度；度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在
20、；电泳缓冲液的组成。碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。 三实验材料与设备：三实验材料与设备：1 1、用品与与仪器：、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 1.5mL 与与0.5mL Eppendorf 0.5mL Eppendorf 管、管、tip
21、tip头头 、烧杯、量筒、烧杯、量筒9EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等；吸水纸，一次性塑料手套等；吸水纸，一次性塑料手套等；吸水纸，一次性塑料手套等； E.coliE.coli DH5 DH5受体菌受体菌受体菌受体菌(R(R- -MM- -) )， pGEX-PDIP-r pGEX-PDIP-r质粒质粒质粒质粒(AmpR)(AmpR)2 2、试剂：、试剂： LB
22、 LB LB LB培养基培养基培养基培养基: : : :蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g/L 10g/L 10g/L 10g/L，酵母提取物，酵母提取物，酵母提取物，酵母提取物 5g/L 5g/L 5g/L 5g/L， NaCl 10g/LNaCl 10g/LNaCl 10g/LNaCl 10g/L，琼脂粉，琼脂粉，琼脂粉，琼脂粉 15g/L 15g/L 15g/L 15g/L（固体培养基），用（固体培养基），用（固体培养基），用（固体培养基），用10 10 10 10 mol/Lmol/Lmol/Lmol/L的的的的NaOHNaOHNaOHNaOH调节调节调节调节pHpHpHpH为为为为7.
23、07.07.07.0，高压灭菌；，高压灭菌；，高压灭菌；，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度氨苄青霉素贮存液：浓度氨苄青霉素贮存液：浓度氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg50-100mg50-100mg50-100mgmLmLmLmL； 含有抗菌素的含有抗菌素的含有抗菌素的含有抗菌素的LBLBLBLB平板培养基：将配置好的平板培养基：将配置好的平板培养基：将配置好的平板培养基：将配置好的LBLBLBLB固体培固体培固体培固体培养基高压灭菌后，冷却到养基高压灭菌后，冷却到养基高压灭菌后，冷却到养基高压灭菌后，冷却到60606060度左右，加入氨苄青霉素度左右，加入氨苄青霉素度左右，加入氨苄青
24、霉素度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为（终浓度为（终浓度为（终浓度为50g50g50g50gmLmLmLmL浓度浓度浓度浓度50-100g50-100g50-100g50-100gmLmLmLmL）；）；）；）；10EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl2 2 2 2：称取：称取：称取：称取1.1g1.1g1.1g1.1g进口无水进口无水进口无水进口无水CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2，溶于，溶于，溶于，溶于70mL70mL70mL70mL双蒸水中，定容到双蒸水中，定
25、容到双蒸水中，定容到双蒸水中，定容到100mL100mL100mL100mL，过滤后灭菌；，过滤后灭菌；，过滤后灭菌；，过滤后灭菌； 0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl2 2 2 2 15151515甘油：甘油：甘油：甘油：100ml 0.1mol/L 100ml 0.1mol/L 100ml 0.1mol/L 100ml 0.1mol/L CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2 溶液内含有溶液内含有溶液内含有溶液内含有15ml15ml15ml15ml甘油，高压灭菌；甘油，高压灭菌；甘油，高压灭菌；甘油，高压灭菌； 溶液溶液
26、溶液溶液I: 50mmol/LI: 50mmol/LI: 50mmol/LI: 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA 10mmol/L EDTA 10mmol/L EDTA 10mmol/L EDTA (pH8.0)(pH8.0)(pH8.0)(pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液溶液溶液溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS II: 0.2mol/L
27、 NaOH, 1%SDS II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS ( ( ( (现配现用现配现用现配现用现配现用) ) ) )； 溶液溶液溶液溶液III: III: III: III: 乙酸钾溶液乙酸钾溶液乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL(3M, pH=4.8)( 60mL(3M, pH=4.8)( 60mL(3M, pH=4.8)( 60mL的的的的5mol/L KAc, 11.5ml 5mol/L KAc, 11.5ml 5mol/L KAc, 11.5ml 5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，冰
28、醋酸，冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H2O)28.5mL H2O)28.5mL H2O)28.5mL H2O)； RNase A RNase A RNase A RNase A： 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml； TE TE TE TE缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液: 10mmol/L: 10mmol/L: 10mmol/L: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/LTris-HCl, 1mmol/LTris-HCl, 1mmol/LTris-HCl, 1mmol/L，EDTAEDTAEDTAEDTA，pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0； 11ECo
29、li感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 5TBE 5TBE缓冲液：缓冲液：缓冲液：缓冲液：0.45mol/L Tris0.45mol/L Tris硼酸，硼酸，硼酸，硼酸，0.01 mol/L 0.01 mol/L EDTA, pH 8.0EDTA, pH 8.0； 10Loading buffer 10Loading buffer：1% SDS, 0.05%1% SDS, 0.05%溴酚兰，溴酚兰，溴酚兰，溴酚兰，5050的甘油；的甘油；的甘油；的甘油； 无水乙醇；无水乙醇；无水乙醇；无水乙醇； 70 70 70 70乙醇；乙醇；乙醇；乙醇； 标准分子量片段；标准分子量片段；标准分
30、子量片段；标准分子量片段； 核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa) EcoR I (TaKaRa)； EcoR I EcoR I酶解缓冲液酶解缓冲液酶解缓冲液酶解缓冲液(10 buffer H)(10 buffer H)； 琼脂糖；琼脂糖；琼脂糖；琼脂糖； 溴化乙啶（溴化乙啶（溴化乙啶（溴化乙啶（EBEB）染色液）染色液）染色液）染色液(10mg/ml)(10mg/ml)。12EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定四操作步骤四操作步骤: ( (一一) ) 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备： 1 1、从从新新活活化化的的E.coliE.col
31、i DH5DH5平平板板上上挑挑取取一一单单菌菌落落，接接种种于于3 35ml 5ml LBLB液液体体培培养养中中，3737振振荡荡培培养养至至对对数数生生长长期期( (12h左右左右) )； 2 2、将将该该菌菌悬悬液液以以1:1001:1001:501:50转转接接于于100ml 100ml LBLB液液体体培培养养基基中中，3737振振荡荡扩扩大大培培养养，当当培培养养液液开开始始出出现现混混浊浊后后，每每隔隔202030min30min测测一一次次ODOD600600，至至ODOD600600为为0.30.30.50.5时时停停止培养，并转装到止培养，并转装到1.5 mL1.5 mL
32、离心管中；离心管中； 3 3、培养物于冰上放置、培养物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g离心离心10min10min，弃去上清液，加入，弃去上清液，加入1 1 mLmL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，小心悬浮细胞溶液，小心悬浮细胞, , 冰浴冰浴2020分钟；分钟；13EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定CaClCaCl2 2纯度至关重要，不同厂家，纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5、04， 4000g离
33、离心心10min，倒倒净净上上清清培培养养液液，再再用用1.0 1.0 mLmL冰冰冷冷的的0.1mo10.1mo1L L CaClCaCl2 2溶溶液液轻轻轻轻悬悬浮浮细细胞胞，冰浴冰浴20min20min； 6 6、 04， 4000g离心离心10min，弃去上清液，加入弃去上清液，加入100 L100 L冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，溶液，小心悬浮细胞小心悬浮细胞，冰，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 8 8、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在
34、如果在4 4放置放置1224h，其转化效率可以增高，其转化效率可以增高46倍倍；也可加入占总体积也可加入占总体积1515左右高压灭菌过的甘油，混匀后左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于分装于1.5ml1.5ml离心管中，置于离心管中，置于-70-70条件下，可保存半年条件下，可保存半年至一年。至一年。14EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定（二）质粒（二）质粒DNADNA的转化：的转化： 1 1、每、每100L100L感受态细胞悬液中加入感受态细胞悬液中加入1L1L质粒质粒DNA,DNA,轻轻摇轻轻摇匀，同时设置三组对照：匀，同时设置三组对照：( (1)1)不加质粒，不加质粒
35、，(2)不加受体菌，不加受体菌， (3)加已知具有转化活性的质粒加已知具有转化活性的质粒DNA，具体操作按下表具体操作按下表进行：进行：*阳性对照，用已知具有转化活性的pGEX-PDIP-r质粒DNA进行转化 编号编号编号编号组组组组 别别别别质粒质粒质粒质粒DNA/DNA/DNA/DNA/ L L L LTE buf / TE buf / TE buf / TE buf / L L L L0.1mol/L CaCl0.1mol/L CaCl0.1mol/L CaCl0.1mol/L CaCl2 2 2 2 / / / / L L L L受体菌受体菌受体菌受体菌/ / / / L L L L1
36、 1受体菌对照受体菌对照受体菌对照受体菌对照1 11001002 2质粒对照质粒对照质粒对照质粒对照1 1 1 1（ g g g g）1001003 3转化组转化组转化组转化组I I1 1 1 1（ g g g g）1001004 4转化组转化组转化组转化组II *II *1 1 1 1（ g g g g）10010015EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 2 2、冰上放置、冰上放置、冰上放置、冰上放置202030min30min，然后，然后，然后，然后4242水浴热激水浴热激水浴热激水浴热激9090120 Sec120 Sec，迅速冰上冷却迅速冰上冷却迅速冰上冷却迅速冰
37、上冷却2min2min； 3 3、 立即向上述立即向上述立即向上述立即向上述EpEp管中加入管中加入管中加入管中加入0.8mL LB0.8mL LB液体培养基，液体培养基，液体培养基，液体培养基，摇匀后于摇匀后于摇匀后于摇匀后于3737振荡培养约振荡培养约振荡培养约振荡培养约151530min30min ，使受体菌恢复正，使受体菌恢复正，使受体菌恢复正，使受体菌恢复正常生长状态及表达抗性基因；常生长状态及表达抗性基因；常生长状态及表达抗性基因；常生长状态及表达抗性基因； 4 4、取培养液、取培养液、取培养液、取培养液50L50L接种于含抗菌素的接种于含抗菌素的接种于含抗菌素的接种于含抗菌素的L
38、BLB平板培养平板培养平板培养平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；基上，用玻璃涂棒涂匀；基上，用玻璃涂棒涂匀；基上，用玻璃涂棒涂匀； 5 5、将培养皿放在、将培养皿放在、将培养皿放在、将培养皿放在3737恒温培养箱培养恒温培养箱培养恒温培养箱培养恒温培养箱培养30 min,30 min,待菌待菌待菌待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于3737恒温培养恒温培养恒温培养恒温培养箱内培养过夜箱内培养过夜箱内培养过夜箱内培养过夜(14-16h) (14-16h) ；（三）碱裂解法小量制备质粒（三）
39、碱裂解法小量制备质粒DNA:DNA:16EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 1 1 1 1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，种到液体培养基中，种到液体培养基中，种到液体培养基中，37373737震荡培养震荡培养震荡培养震荡培养1212121216161616小时；小时；小时；小时； 2 2 2 2、将、将、将、将1.5mL1.5mL1.5mL1.5mL菌液加入菌液加入菌液加入菌液加入EpEpEpEp离心管中，离心管中，离心管中，离
40、心管中，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心30 Sec30 Sec30 Sec30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干；，弃上清液，在吸水纸上扣干；，弃上清液，在吸水纸上扣干；，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3 3 3 3、加入、加入、加入、加入100100100100 L L L L预冷的溶液预冷的溶液预冷的溶液预冷的溶液I I I I ，于涡旋振荡器上，于涡旋振荡器上，于涡旋振荡器上，于涡
41、旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液溶液溶液溶液I I I I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取少提取少提取少提取 过程中的机械剪切力，防止染色体过程中的机械剪切力，防止染色体过程中的机械剪切力，防止染色体过程中的机械剪切力，防止染色体DNA DNA DNA DNA 的断裂；的断裂；的断裂；的断裂；EDTAEDTAEDTAEDTA的作的作的作的作用是与二价离
42、子（用是与二价离子（用是与二价离子（用是与二价离子（CaCaCaCa2 2 2 2）结合，降低）结合，降低）结合，降低）结合，降低DNaseDNaseDNaseDNase对对对对DNADNADNADNA的降解。的降解。的降解。的降解。 4 4 4 4、加入、加入、加入、加入200200200200 L L L L新配制的溶液新配制的溶液新配制的溶液新配制的溶液II, II, II, II, 盖紧管口盖紧管口盖紧管口盖紧管口, , , ,快速快速快速快速颠倒离心管颠倒离心管颠倒离心管颠倒离心管, , , ,以混匀内容物以混匀内容物以混匀内容物以混匀内容物, , , ,冰上放置冰上放置冰上放置冰上
43、放置3 3 3 35min;5min;5min;5min; 溶液溶液溶液溶液IIIIIIII中的中的中的中的NaOHNaOHNaOHNaOH与与与与SDSSDSSDSSDS可裂解细胞，使可裂解细胞，使可裂解细胞，使可裂解细胞，使DNADNADNADNA变变变变 性以及性以及性以及性以及SDSSDSSDSSDS使蛋白变性并形成交联的网状结构使蛋白变性并形成交联的网状结构使蛋白变性并形成交联的网状结构使蛋白变性并形成交联的网状结构 17EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 5 5 5 5、加入、加入、加入、加入150150150150 l l l l溶液溶液溶液溶液III, I
44、II, III, III, 加盖后颠倒加盖后颠倒加盖后颠倒加盖后颠倒6-76-76-76-7次混匀，冰次混匀，冰次混匀，冰次混匀，冰上放置上放置上放置上放置2 2 2 23min3min3min3min； 溶液溶液溶液溶液IIIIIIIIIIII为低为低为低为低pHpHpHpH的醋酸钾缓冲液，中和的醋酸钾缓冲液，中和的醋酸钾缓冲液，中和的醋酸钾缓冲液，中和NaOHNaOHNaOHNaOH，以便使部，以便使部，以便使部，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNADNADNADNA不能正确
45、复性不能正确复性不能正确复性不能正确复性 6 6、12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心6 min6 min6 min6 min，将上清移入另一干净的，将上清移入另一干净的，将上清移入另一干净的，将上清移入另一干净的EpEp管中；管中；管中；管中； 7 7 7 7、加、加、加、加2 2 2 2倍上清体积倍上清体积倍上清体积倍上清体积( ( ( (约约约约1mL)1mL)1mL)1mL)的无水乙醇的无水乙醇的无水乙醇的无水乙醇, , , , 振荡混匀，振荡混匀，振荡混匀，振荡混匀，室温放置室温放置室温放置室温放置2min.2min.2min.2min. 8 8、
46、 12000g 12000g离心离心离心离心10min10min，弃上清液，再用，弃上清液，再用，弃上清液，再用，弃上清液，再用7070的乙醇的乙醇的乙醇的乙醇洗涤一次，洗涤一次，洗涤一次，洗涤一次， 12000g 12000g离心离心离心离心1min1min，离心管倒置于吸水纸上，离心管倒置于吸水纸上，离心管倒置于吸水纸上，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9 9、加入、加入、加入、加入4040 L L含含含含20 20 g/mL RNase Ag/mL RNa
47、se A的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或TE TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解( (约约约约8min)8min)，存于，存于，存于，存于2020或直接用于酶切或直接用于酶切或直接用于酶切或直接用于酶切。18EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定质粒图谱质粒图谱: :19EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 ( ( ( (四四四四) ) ) )提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳：提取质粒的酶切鉴
48、定与琼脂糖凝胶电泳：提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳：提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳： 1 1、在、在、在、在0.5mL Ep0.5mL Ep管中依次加入下列溶液于管中依次加入下列溶液于管中依次加入下列溶液于管中依次加入下列溶液于0.5ml0.5ml离离离离心管中心管中心管中心管中 提取质粒提取质粒提取质粒提取质粒DNA 3.0 DNA 3.0 L L 10 buffer H 1.0 10 buffer H 1.0 l l EcoR I 2.0 EcoR I 2.0 U U dd H2O 5.8 dd H2O 5.8 L L 10 10 L L 1U: 11U: 11U: 11U: 1单
49、位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下， 在在在在20 20 20 20 L L L L 反应液中反应反应液中反应反应液中反应反应液中反应1h1h1h1h，使，使，使，使1 1 1 1 g DNAg DNAg DNAg DNA完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量. . . . 2 2、 轻轻混匀轻轻混匀轻轻混匀轻轻混匀, 4000g, 4000g离心离心离心离心1010秒秒秒秒 ，置于，置于，置于，置于3737水浴中水浴中水浴中水浴中酶解酶解
50、酶解酶解1.5h1.5h。 3 3、酶解完成后，加入、酶解完成后，加入、酶解完成后，加入、酶解完成后，加入1.2 1.2 l l 10 10上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液( (或或或或2 2 l l 6 6上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液), ), 混匀混匀混匀混匀. . 4 4、称取、称取、称取、称取1g1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入琼脂糖，置于三角瓶中，加入琼脂糖，置于三角瓶中，加入琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mL 100mL 0.5TBE0.5TBE或或或或1TAE1TAE缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将缓冲
51、液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。 20EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定 5 5、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至6060左右的左右的左右的左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴琼脂糖凝胶液加入一小滴琼脂糖凝胶液加入一小滴琼脂糖凝胶液加入一小滴EBEB，小心混匀小心混匀小心混匀小心混匀，倒到制胶槽，倒到制胶槽，倒到制胶槽，倒到制胶槽上，直到在整个
52、有机玻璃板表面形成均匀的胶层，上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不不不不要产生气泡（厚度约为要产生气泡（厚度约为要产生气泡（厚度约为要产生气泡（厚度约为3 34mm4mm）； 6 6、 室温下静置室温下静置室温下静置室温下静置30min30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，轻轻轻轻轻轻轻轻拔出梳子拔出梳子拔出梳子拔出梳子。 7 7、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有、制好胶后将凝胶连同内
53、槽放在含有0.5TBE0.5TBE或或或或1TAE1TAE缓冲液的电泳槽中使用缓冲液的电泳槽中使用缓冲液的电泳槽中使用缓冲液的电泳槽中使用( (注意注意注意注意: : : :电泳槽中的缓冲电泳槽中的缓冲电泳槽中的缓冲电泳槽中的缓冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致) )。 8 8、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（加完样后的凝胶板
54、即可通电进行电泳（加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（8080100V100V的电的电的电的电压下电泳，一般情况下，压下电泳，一般情况下，压下电泳，一般情况下，压下电泳，一般情况下，电压电压电压电压/ / / /电极间距离应小于电极间距离应小于电极间距离应小于电极间距离应小于5V/cm5V/cm5V/cm5V/cm），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm1cm处停止处停止处停止处停止电泳。电泳。电泳。电泳。 21EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定
55、9 9、在紫外灯、在紫外灯、在紫外灯、在紫外灯(310nm(310nm波长波长波长波长) )下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。DNADNA存在存在存在存在处显示出红色的荧光条带处显示出红色的荧光条带处显示出红色的荧光条带处显示出红色的荧光条带( (在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤，
56、拍照电泳，拍照电泳，拍照电泳，拍照电泳图谱时，可采用凝胶成象系统图谱时，可采用凝胶成象系统图谱时，可采用凝胶成象系统图谱时，可采用凝胶成象系统) )。22EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定五五. 实验结果报告：实验结果报告： 1 1、转化效率的计算、转化效率的计算 ： 转化子总数菌落数转化子总数菌落数 （转化反应原液总体积（转化反应原液总体积/ /涂涂板菌液体积）板菌液体积） 转化效率转化效率（每微克质粒每微克质粒DNADNA的转化子数的转化子数） 转化转化子总数（个转化子）子总数（个转化子）/ /加入质粒加入质粒DNADNA的量（的量（ g g） 2 2、质粒提取与酶切
57、鉴定结果，贴上打印实验照、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片并标明照片上各片并标明照片上各DNADNA条带的含义。条带的含义。23EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定六、思考题：六、思考题： 1 1 1 1、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据是什么？是什么？是什么？是什么？ 2 2 2 2、为什么通常使用、为什么通常使用、为什么通常使用、为什么通常使用R R R R- - - -M M M M- - - -菌作为基因工程受体菌？菌作为基因
58、工程受体菌？菌作为基因工程受体菌？菌作为基因工程受体菌？ 3 3 3 3、简述、简述、简述、简述CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2制备细菌感受态细胞及其转化的基本制备细菌感受态细胞及其转化的基本制备细菌感受态细胞及其转化的基本制备细菌感受态细胞及其转化的基本原理。原理。原理。原理。 4 4 4 4、根据、根据、根据、根据DNADNADNADNA限制酶的识别切割特性，限制酶的识别切割特性，限制酶的识别切割特性，限制酶的识别切割特性， 催化条件及催化条件及催化条件及催化条件及是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其
59、中是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中IIIIIIII类限制性类限制性类限制性类限制性内切酶有何特性？内切酶有何特性？内切酶有何特性？内切酶有何特性？ 5 5 5 5、在用碱裂解法小量制备质粒过程中、在用碱裂解法小量制备质粒过程中、在用碱裂解法小量制备质粒过程中、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I I I I液、液、液、液、IIIIIIII液与液与液与液与IIIIIIIIIIII液的作用机理是什么？液的作用机理是什么？液的作用机理是什么？液的作用机理是什么？ 6 6 6 6、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。24EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定
