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1、微生物遗传-结合转移Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望实验原理：实验原理：1 1、质粒的转移性、质粒的转移性 细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。 接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNADNA从从供体向受体转移的过程。供体向受体转移的过程。 质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整的编码转移酶
2、的完整的编码转移酶的 tra tra 基因基因, ,质粒能自主地从一个细胞质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞转移到另一个细胞, ,甚至还能带动供体细胞的染色体甚至还能带动供体细胞的染色体 DNA DNA 向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大肠杆菌的肠杆菌的 F F 质粒。质粒。 有些质粒不含有些质粒不含 tra tra 基因基因, ,但含有质粒转移起始位点但含有质粒转移起始位点oriToriT，虽不能自主转移，但能被其他一些含完整虽不能自主转移，但能被其他一些含完整 tra tra 基因的质基因的质粒所诱动粒所诱动, ,这类质
3、粒又被叫做可诱动质粒。这类质粒又被叫做可诱动质粒。 实验原理：实验原理：2 2、本实验所用供体质粒、本实验所用供体质粒 本实验中要转移的质粒是本实验中要转移的质粒是pHN102pHN102，它是在广宿主范围的稳定载体，它是在广宿主范围的稳定载体pTR102pTR102 中插入生物发光酶基因生物发光酶基因luxABluxAB 构建而成。 pTR102pTR102中带有含中带有含 par par 基因的稳定性片段（基因的稳定性片段（stabilltystabillty）, ,它能在较多革兰它能在较多革兰氏阴性细菌中稳定存在，它含有质粒转移起始位点氏阴性细菌中稳定存在，它含有质粒转移起始位点oriT
4、oriT，不含完整的转不含完整的转移基因移基因 tratra，必须在含有，必须在含有 tra tra 基因的辅助菌株诱动下，基因的辅助菌株诱动下， pTR102 pTR102 才能从供体菌向受体菌转移。 为有效筛选转移接合子为有效筛选转移接合子 (transconjugant), pHN102 (transconjugant), pHN102 质粒上带有质粒上带有 Tc Tc 抗性和生物抗性和生物 发光酶基因发光酶基因( ( lux lux ABAB）两个）两个 标记。加入标记。加入lux lux ABAB的底物癸醛的底物癸醛 （DecanalDecanal）后，菌体可发出）后，菌体可发出 微
5、弱荧光。微弱荧光。实验原理：实验原理：3 3、三亲本杂交、三亲本杂交 本实验中的辅助菌株是本实验中的辅助菌株是E. coli (pPK2073） ， pPK2073中带完整的 tra tra 基因，基因，将已活化的供体菌、协助菌与受体将已活化的供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体菌中的质粒（菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体菌中的质粒（ pHN102pHN102 ）可以在协助菌的帮助下通过接合转移方式导）可以在协助菌的帮助下通过接合转移方式导入受体菌（入受体菌（费氏中华根瘤菌费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii ）中。）中。因此该接合转移过程称为三亲本杂
6、交。因此该接合转移过程称为三亲本杂交。 实验菌株供体菌：E.coli DH5(pTR102-luxAB) (TcR、luxAB) 受体菌: Sinorhizobium fredii ( Tc S)辅助菌: E. coli MM294 (pRK2073)（SpecR） 实验产物转移接合子: S. fredii (pTR102-luxAB), (TcR，luxAB)实验准备实验准备菌株活化（教师做）： 将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期： E. coli (pTR102-luxAB): 液体LB + Tc 20g/ml, 37OC震荡培养1夜； S. fredii : TY液体, 28OC震荡培
7、养2天 ； E. coli (pPK2073) : 液体LB + Spe 50g/ml ,37OC震荡培养1夜倒平板（学生做）：第1、2组：倒不加Tc的SM（平皿上标记“纯SM” ）： 融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml（装在1.5ml离心管中，标记“维”)，混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室（4OC）备用。第3、4组：倒TY平板： 融化1瓶TY固体, 倒平板12-13个, 凝固后分发到4个超净台使用。第5、6组：倒SMTc平板（平皿上标记“SMTc” ） ： 融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml和四环素0.5ml （Tc,10mg/ml,装
8、在1.5ml离心管中，标记“Tc” ），混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室(4OC) 备用。 操作步骤：三菌混合培养（第操作步骤：三菌混合培养（第1 1天）天）(1)吸取供体菌、辅助菌各 0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加入同一个1.5ml离心管内（每个同学做1管），8000转/min 离心1分钟。 (2) 倒上清，向沉淀加 1ml 的 TY液体，用 tip上下抽吸，洗涤菌体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。 (3) 用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上（每个同学1片，3片/平板，平皿背面标记姓名），用200l的 tip 抽
9、吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外） (4) 加好菌液后，静置510分钟，待滤纸上的培养基液体被平板吸收后，倒置放培养箱，28OC培养1天。操作步骤：操作步骤：洗菌涂平板（第洗菌涂平板（第2 2天）天）（1）灭菌小PA瓶中加5ml无菌水(1瓶/人), 镊子揭下TY平板上的滤纸片，放入瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌体。（2）向1.5ml管加0.9ml无菌水,加0.1ml已打散的菌液,混匀。（3）吸已稀释的菌液分别涂布于昨日倒的 SM+Tc 平板和不加 Tc的纯SM上（每个同学各涂1板， 200l / 板）（4）放28 OC培养6-7天，下周看结果： 在暗室内向培养皿中加10L癸醛，35分钟后即可看到转移接合子的luxAB基因发出的微弱荧光 SM+Tc平板的单菌落数 质粒转移频率 纯SM平板的单菌落数
