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1、n坎坎坷坷细胞生物学实验细胞生物学实验 生命科学学院生命科学学院 实验一实验一 细胞形态、细胞形态、细胞器的显微结构的观察细胞器的显微结构的观察一、实验目的一、实验目的1.1.了解普通光学显微镜的工作了解普通光学显微镜的工作原理，掌握光学显微镜的使原理，掌握光学显微镜的使用方法。用方法。2.2.熟悉光学显微镜下细胞的基熟悉光学显微镜下细胞的基本形态与结构。本形态与结构。二、实验原理二、实验原理 细胞是生物体的基本结构单位。构成生细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构人手。所以，要研究，首先要从其形态
2、结构人手。所以，要借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。才能观察到细胞的基本形态结构。n经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。n显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力分辨力有关。有关。n制作光学镜头所用的玻璃折射率为制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.651.781.78，所用介质的折射率越，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.050.050.9
3、50.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.51.5。n普通光线的波长为普通光线的波长为400400700nm700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2m0.2m，人眼的分辨力是，人眼的分辨力是0.2mm0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为数通常为1000X1000X。 显微镜的分辨率显微镜的分辨率: : 也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离， 分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨分辨距离越大，则分辨率越
4、低。所以，分辨率是以分辨 距离来表示的。距离来表示的。 其计算公式为其计算公式为: D=0.61: D=0.61/N/NA NA NA A=n=nsina/2sina/2 式式中中D D为为分分辨辨率率，A A为为光光波波波波长长， n=介介质质折折射射率率；=镜镜口口角角（标标本本对对物物镜镜镜镜口口的的张张角角）， N NA A为为物物镜镜的的数数值值孔孔径径( (镜镜口口率率) )。镜镜口口角角总总是是要要小小于于180，所以，所以sina/2的最大值必然小于的最大值必然小于1。 在在物物镜镜上上，有有镜镜口口率率(N.A.)(N.A.)的的标标志志，它它反反应应该该镜镜头头分分辨辨力力
5、的的大大小小，其其数数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 物镜物镜 镜口率镜口率(N.A.) (N.A.) 工作距离工作距离(mm) (mm) 10 10 0.25 5.40 0.25 5.40 40 40 0.65 0.39 0.65 0.39 100 100 1.30 0.11 1.30 0.11显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积，显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积， 公式为公式为: M = K1xK2: M = K1xK2焦点深度焦点深度: : 显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的显微镜调
6、焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的 上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全 厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。厚标本和薄标本厚标本和薄标本厚标本和薄标本厚标本和薄标本4 - 5 um4 - 5 um2um2um基础知识基础知识基础知识基础知识三、显微镜概述三、显微镜概述 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外
7、线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。1.1.光学显微镜光学显微镜 普通生物显微镜由普通生物显微镜由3 3部分构成：部分构成：照明系统：包括光源和聚光器。照明系统：包括光源和聚光器。光学放大系统：由物镜和目镜组成，光学放大系统：由物镜和目镜组成， 是显微镜的主体。是显微镜的主体。机械装置：用于固定材料和观察方便，机械装置：用于固定材料和观察方便， 包括镜台包括镜台( (载物台载物台) ) 、调节器和、调节器和、 物镜转换器物镜转换器( (旋转器旋转器) )等。等。 尼康E-600显微镜 数码互动显微镜数码互动显微镜2.体视显微镜体视显微镜n
8、可直接进行解剖及可直接进行解剖及观察并具有正像立观察并具有正像立体感体感3.荧光显微镜荧光显微镜 尼康E800荧光DIC显微镜 荧光显微镜照片（微管呈绿荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）色、微丝红色、核蓝色） 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：n1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上。n2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。n3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。4. 4. 激光共聚激光共聚焦扫描显微镜焦扫描显微镜（具有高分辨具有高分辨率可进行显微率可进行显微断层扫描）断层扫描） LCSM照片照片蓝
9、色为细胞核，蓝色为细胞核，绿色为微管绿色为微管 （能观察活细胞）（能观察活细胞）5.暗视野显微镜暗视野显微镜 暗视野显微镜（暗视野显微镜（dark field microscopedark field microscope）的聚光镜中央有当）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至种显微镜能见到小至 4-200nm4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高的微粒子，分
10、辨率可比普通显微镜高5050倍。倍。6.6.相差显微镜相差显微镜 一种介壳虫的染色体 7. 偏光显微镜偏光显微镜（对于双折射物质进行结构研究）对于双折射物质进行结构研究） 偏光显微镜（偏光显微镜（polarizing microscopepolarizing microscope）用于检测具有双折射性的物用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。8.8.微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜（图像具有浮雕感）（图像具有浮雕感） DICDIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与
11、相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 DIC显微镜下的硅藻（伪彩色） 9. 9. 倒置显微镜（倒置显微镜（组织培养中长工作距离的）组织培养中长工作距离的）n组成和普通显微镜一样，组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上（右图）后者在载物台之上（右图），用于观察培养的活细胞，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。具有相差物镜。10. 10. 显微操作技术显微操作技术 尼康尼康NT-88NENT-88NE显微操作显微操作
12、/ /注射仪注射仪 四、实验用品四、实验用品n各种组织切片各种组织切片五、五、 实验步骤实验步骤 (一一)显微镜的使用显微镜的使用1. 1. 观察前的准备工作观察前的准备工作 (1)(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双 眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。 (2)(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。 (3)(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整 和正常，并对载物台、目镜、物
13、镜以及聚光器上端透和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透 镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。 学生操作规程及注意事项学生操作规程及注意事项一、观察前准备一、观察前准备检查：检查：底座右侧的光源亮度旋钮是否在底座右侧的光源亮度旋钮是否在“1 1”位置，即顺位置，即顺时针选到最底位。时针选到最底位。开机：开机：1.1.打开后座主电源开关打开后座主电源开关绿色按钮绿色按钮 2.2.打开后座打开后座CCDCCD电源开关电源开关红色按钮红色按钮白平衡调整：白平衡调整：不放切片，在不放切片，在1010倍物镜下将电源调整到最倍物镜下将电源调整到最亮，然后
14、按底座右方的白平衡按钮（红色）亮，然后按底座右方的白平衡按钮（红色）3 35 5秒之后秒之后将光源亮度调回到适中状态。将光源亮度调回到适中状态。n二、观察操作二、观察操作n放上切片，将光源调到自己习惯的亮度。放上切片，将光源调到自己习惯的亮度。n视度补偿视度补偿：调节目镜双筒找到自己的瞳距，此：调节目镜双筒找到自己的瞳距，此时两眼镜下的图时两眼镜下的图象重合在一起，横拉板上的数象重合在一起，横拉板上的数字（例如：字（例如：6464）就是自己的瞳距，然后将两只）就是自己的瞳距，然后将两只目镜外侧的刻度线调到瞳距的数字的位置。目镜外侧的刻度线调到瞳距的数字的位置。n调焦调焦：将绿色光标移至视野中央
15、，开始观察，：将绿色光标移至视野中央，开始观察，如需提问，按呼叫按钮。如需提问，按呼叫按钮。三、下课时的操作三、下课时的操作1.1.将光源亮度调到最低将光源亮度调到最低“1 1”刻度。刻度。2.2.关掉红色关掉红色CCDCCD电源开关，再关绿色主电源开电源开关，再关绿色主电源开关。关。3.3.套上显微镜套。套上显微镜套。4.4.耳机及凳放整齐。耳机及凳放整齐。瞳瞳 距距 调调 节节2. 2. 显微镜的调节显微镜的调节屈屈 光光 度度 调调 节节调节调节粗粗 调调 松松 紧紧 调调 节节 旋旋 钮钮聚聚 光光 镜镜 中中 心心 调调 节节 光轴中心调节光轴中心调节光轴中心调节光轴中心调节螺钉螺钉
16、螺钉螺钉 视场视场视场视场光栏光栏光栏光栏 孔径孔径孔径孔径光栏光栏光栏光栏10X10X10X10X物物物物镜镜镜镜 标标标标本本本本 聚光镜升降聚光镜升降聚光镜升降聚光镜升降旋钮旋钮旋钮旋钮孔径光栏调节孔径光栏调节N.A聚= =(0 0.6-06-0.8 8)N.A物孔径光栏开度与图象孔径光栏开度与图象100%70%30%六、注意事项六、注意事项1.1.低、高倍镜的使用。低、高倍镜的使用。七、实验报告七、实验报告1.1.描绘一个所观察细胞的基本形态结构。描绘一个所观察细胞的基本形态结构。2.2.绘图比较所观察到的不同的细胞形态与结构。绘图比较所观察到的不同的细胞形态与结构。3.3.比较真核细胞和原核细胞的形态结构及其区别。比较真核细胞和原核细胞的形态结构及其区别。4.4.简述显微镜的主要结构和操作要领。简述显微镜的主要结构和操作要领。5.5.熟练显微镜的调节。熟练显微镜的调节。
