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1、肿瘤的分子分型及临床检测上海天昊遗传分析中心上海原泰医药科技有限公司 丁达 2010.4 南京目前临床检测的主要项目与化疗相关的基因与化疗相关的基因与化疗相关的基因与化疗相关的基因mRNAmRNA的表达量的表达量的表达量的表达量(ERCC1/BRCA1,TYMS(ERCC1/BRCA1,TYMS，RRM1,TUBB3,STMN1,TOP2A)RRM1,TUBB3,STMN1,TOP2A)与分子靶向相关的基因的突变与分子靶向相关的基因的突变与分子靶向相关的基因的突变与分子靶向相关的基因的突变 (EGFR,KRAS,BRAF)(EGFR,KRAS,BRAF) 基因的拷贝数异常基因的拷贝数异常基因的
2、拷贝数异常基因的拷贝数异常(her2,EGFR)(her2,EGFR) 基因的遗传多态性基因的遗传多态性基因的遗传多态性基因的遗传多态性（UGT1A1,CYP2D6UGT1A1,CYP2D6）遗传性肿瘤的分子诊断遗传性肿瘤的分子诊断遗传性肿瘤的分子诊断遗传性肿瘤的分子诊断 遗传性乳腺癌家族遗传性乳腺癌家族 10%10%的乳腺癌是家族遗传的，其中主要的原因是的乳腺癌是家族遗传的，其中主要的原因是 BRCA1BRCA1（首选（首选I,55%I,55%），）， BRCA 2BRCA 2（首选（首选II, 35%II, 35%） 遗传性非息肉性大肠癌（遗传性非息肉性大肠癌（HNPCCHNPCC） MS
3、H2(MSH2(首选首选1 1，60%)60%)， MLH1(MLH1(首选首选2, 30%) 2, 30%) ， MSH6(MSH6(次选次选,4%),4%) 家族性结直肠息肉综合症（家族性结直肠息肉综合症（FAPFAP） 首选首选 APCAPC，次选，次选 MYHMYH 使用的主要使用的主要技术方法：技术方法：定量定量PCR使用的主要使用的主要技术方法：技术方法：基因测序基因测序FISH荧光毛细管电泳荧光毛细管电泳使用的主要使用的主要技术方法：技术方法：基因测序基因测序突变筛查的关键1、必须采用同一个体正常细胞对照2、必须排除数据库中的SNP多态（大多数公司缺少）3、如何看待突变筛查的灵敏
4、度问题？4、微缺失和插入的检出（测序最佳）5、出现耐药现象后建议对后期的肿瘤组织 重新进行突变检查（取材困难）6、未知突变的筛查和确认（探针方法失效）肿瘤基因突变筛查方法优劣比较l 液相芯片：准确性差（受杂交等条件影响）液相芯片：准确性差（受杂交等条件影响） 灵敏度一般灵敏度一般 未知突变无法筛查未知突变无法筛查 可筛查已知的插入缺失突变可筛查已知的插入缺失突变l 探针类试剂盒方法：准确性高（探针类试剂盒方法：准确性高（98%98%以上）以上） 灵敏度高（探针的优势）灵敏度高（探针的优势） 未知突变无法筛查未知突变无法筛查 对插入缺失筛查的能力差对插入缺失筛查的能力差肿瘤基因突变筛查方法优劣比
5、较l 测序：测序： 准确性高（几乎准确性高（几乎100%100%） 灵敏度一般（测序的灵敏度为灵敏度一般（测序的灵敏度为10%10%） 可以筛查任何未知突变可以筛查任何未知突变 对插入缺失的判断准确对插入缺失的判断准确l 焦磷酸测序：准确性高（几乎焦磷酸测序：准确性高（几乎100%100%） 灵敏度一般（灵敏度约为灵敏度一般（灵敏度约为10%10%） 可以筛查任何未知突变可以筛查任何未知突变 对插入缺失的判断准确对插入缺失的判断准确 测序片段只有测序片段只有100-150bp100-150bp，通量太低，通量太低测序突变筛查的难点石蜡标本的PCR十分困难为了提高成功率采用多次PCR造成的引入突
6、变，造成假阳性纯化方法直接决定了测序质量，天昊平台有改进后的纯化方法，比其他测序公司纯化效果好很多测序数据的分析，需要排除“假突变”，SNP，如何判读插入缺失突变。突变样本的测序结果突变样本的测序结果 肺癌胸水标本EGFR外显子21错义突变 Leu858Arg 肺癌个体化治疗检测方案肺癌个体化治疗检测方案 卡铂（顺铂）卡铂（顺铂） ERCC1ERCC1或或BRCA1BRCA1 mRNA mRNA 紫杉醇（多西紫杉醇）紫杉醇（多西紫杉醇） 长春瑞滨（长春花碱）长春瑞滨（长春花碱） TUBB3TUBB3和和 STMNSTMN mRNA mRNA 培美曲赛培美曲赛 TYMSTYMS mRNA mRN
7、A 吉西他滨吉西他滨 RRM1RRM1 mRNA mRNA 依托泊苷依托泊苷 TOP2ATOP2A mRNA mRNA 西妥昔单抗西妥昔单抗 KRASKRAS 突变筛查突变筛查 厄洛替尼厄洛替尼 吉非替尼吉非替尼EGFREGFR KRASKRAS B-raf B-raf 突变筛查突变筛查举例说明天津肿瘤医院开始自己做测序，结果反复出现假突变，最后与我们合作。福建肿瘤医院大肠癌石蜡标本KRAS 基因PCR成功率低于50%，且不会排查SNP，后选择与我们合作。定量PCR检测的技术要点必须使用肿瘤组织作为检测对象，组织必须保存必须使用肿瘤组织作为检测对象，组织必须保存在特定的保存液中，石蜡片子中在特
8、定的保存液中，石蜡片子中mRNAmRNA降解严重，降解严重，量又少，定量量又少，定量PCRPCR成功率较低。成功率较低。对同一个样本必须使用对同一个样本必须使用GAPDHGAPDH或者或者B-actinB-actin作为对作为对照基因，校正取样细胞数的差异照基因，校正取样细胞数的差异必须进行必须进行2 2重复的定量实验，防止操作失误和随机重复的定量实验，防止操作失误和随机误差误差基因表达的高或低是一个相对值，需临床数据和基因表达的高或低是一个相对值，需临床数据和资料才能确定何种表达水平适合用何种治疗方案。资料才能确定何种表达水平适合用何种治疗方案。定量PCR检测结果石蜡标本mRNA检测作为临床
9、参考的科学性商榷 石蜡标本检测出的石蜡标本检测出的mRNAmRNA水平高低，作为临床化疗的水平高低，作为临床化疗的参考，必须十分谨慎，理由如下，请仔细考虑以下两个问参考，必须十分谨慎，理由如下，请仔细考虑以下两个问题：题： 1 1年前的石蜡标本所检测的年前的石蜡标本所检测的mRNAmRNA水平是否会因为水平是否会因为降解而低于真实值？降解而低于真实值？1 1年前病人的组织年前病人的组织mRNAmRNA水平与现在病人的组织水平与现在病人的组织mRNAmRNA水平是否会发生剧烈的变化而使检测结果失水平是否会发生剧烈的变化而使检测结果失去参考价值？去参考价值？ （就像突变也会随着时间的推移发（就像突
10、变也会随着时间的推移发生新的耐药突变一样）生新的耐药突变一样） 肿瘤治疗的分子分型和异病同治肿瘤治疗的分子分型和异病同治传统的肿瘤的形态学和组织学分类在化疗治疗方面显示出局限性大样本多中心的化疗临床研究为分子分型提供了大量的数据分子分型的结果与临床疗效的研究为肿瘤化疗的同病异治和异病同治提供了科学依据临床遗传分子诊断项目的临床遗传分子诊断项目的规范化和标准化运作规范化和标准化运作样本采集要求：实验室质控要求：仪器和试剂的选择：结果分析和解释的要求：原泰-天昊检测平台的优势测序是突变筛查的金标准！尽管灵敏度有所欠缺，测序是突变筛查的金标准！尽管灵敏度有所欠缺，但是对于未知突变的检测和准确度都是最
11、好的。但是对于未知突变的检测和准确度都是最好的。国内尚未批准任何一家临床细胞分子遗传学专业国内尚未批准任何一家临床细胞分子遗传学专业医学检验所，原泰医学检验所，原泰- -天昊已经着手向卫生部门申请天昊已经着手向卫生部门申请临床细胞分子遗传学专业医学检验所医疗机构许临床细胞分子遗传学专业医学检验所医疗机构许可可 ，其余公司也处于自行检测阶段。，其余公司也处于自行检测阶段。突变测序的数据需要详细分析，排除假阳性（例突变测序的数据需要详细分析，排除假阳性（例如如SNPSNP干扰，例如干扰，例如PCRPCR引入突变等）引入突变等）原泰-天昊检测平台的优势所有的样本都严格要求肿瘤组织，采用血清进行所有的
12、样本都严格要求肿瘤组织，采用血清进行肿瘤细胞的相关指标检测仅停留在科研，由于其肿瘤细胞的相关指标检测仅停留在科研，由于其假阴性太高，目前为止没有科学意义的。假阴性太高，目前为止没有科学意义的。定量定量PCRPCR检测必须有内参基因作为对照校正取样检测必须有内参基因作为对照校正取样细胞数差异，必须要有细胞数差异，必须要有2 2重复实验排除实验失误和重复实验排除实验失误和随机误差等，科学的数据要求至少随机误差等，科学的数据要求至少2 2重复。重复。我们提供原始数据和剩余我们提供原始数据和剩余DNADNA样本给客户，客户样本给客户，客户通过原始数据可以知道实验的准确性和可靠性，通过原始数据可以知道实
13、验的准确性和可靠性，同时积累原始数据可以发表文章同时积累原始数据可以发表文章原泰-天昊检测平台的优势采用探针方法检测突变只能检测已知突变，大大提高漏检率采用焦磷酸测序准确度和灵敏度与测序类似，但是测序片段太短我们可以对合格的穿刺标本进行肿瘤突变筛查以及定量PCR检测我们的实验结果接受第三方权威评测和单盲，双盲实验原泰-天昊遗传中心 专注于DNA分析SNP分型基因测序筛查突变、插入、缺失等STR分型（全基因组扫描，候选STR，肿瘤LOH，亲缘鉴定）CNV芯片分析的拷贝数定量分析甲基化定性和甲基化定量分析基因表达定量(Sybrgreen和Taqman方法)技术团队介绍姜正文博士：美国辛辛那提大学归
14、国博士，遗传姜正文博士：美国辛辛那提大学归国博士，遗传学专业，从事科研学专业，从事科研1010多年多年 奚慧峰博士（顾问）奚慧峰博士（顾问） ：美国辛辛那提大学博士，：美国辛辛那提大学博士，生物统计专业，特长为遗传统计分析生物统计专业，特长为遗传统计分析刘燕博士：新疆医科大学附属第一医院心内科大刘燕博士：新疆医科大学附属第一医院心内科大夫，复旦大学遗传所博士毕业，从事医学遗传学夫，复旦大学遗传所博士毕业，从事医学遗传学研究研究8 8年年丁达：复旦大学遗传所毕业，参与丁达：复旦大学遗传所毕业，参与973973肺癌关联研肺癌关联研究项目，从事遗传学研究究项目，从事遗传学研究6 6年年2008年后主
15、要合作项目复旦大学科技部复旦大学科技部973973重点项目新生儿出生缺陷突重点项目新生儿出生缺陷突变筛查项目变筛查项目山东省医科院山东省医科院骨骼发育不全的遗传学研究骨骼发育不全的遗传学研究上海市瑞金医院血液科上海市瑞金医院血液科凝血因子凝血因子8 8，9 9的常的常规筛查和中国人规筛查和中国人8 8，9 9因子遗传标记筛选因子遗传标记筛选福建省肿瘤医院福建省肿瘤医院大肠癌大肠癌KRASKRAS基因突变与靶基因突变与靶向治疗相关性的研究向治疗相关性的研究2008年后主要合作项目上海中山医院临床药理中心药物代谢酶P450系列SNP与兰索拉唑等药物的药代，药动分析（国家自然）新疆石河子大学哈萨克族
16、高血压与TGFB1,eNOS，CBS等基因25个SNP的关联 （3个国家自然基金）上海儿科医院青少年身高相关基因的7个SNP关联研究（上海市科委重点项目）天昊遗传分析平台的临床研发进展AccucopyAccucopy技术（专利提交中）进行多个基因技术（专利提交中）进行多个基因mRNAmRNA的同时定量，应用于检测和科研。的同时定量，应用于检测和科研。SnpscanSnpscan和和iMLDRiMLDR技术进行高通量低成本的技术进行高通量低成本的SNPSNP分分型，用于科研。型，用于科研。一种新的一种新的KrasKras突变检测方法和一种新的分支杆菌突变检测方法和一种新的分支杆菌鉴定方法专利已经
17、通过初审鉴定方法专利已经通过初审中国人重大遗传疾病的微卫星标记筛选项目进入中国人重大遗传疾病的微卫星标记筛选项目进入尾声（尾声（20092009年上海市科委浦江人才计划项目），年上海市科委浦江人才计划项目），预计对预计对1111种遗传病的遗传筛查微卫星标记申请专种遗传病的遗传筛查微卫星标记申请专利，包括利，包括2 2种家族性肿瘤种家族性肿瘤临床科研合作、交流其他肿瘤的靶向治疗敏感性研究胰腺癌胰腺癌 KRASKRAS与西妥昔单抗？与西妥昔单抗？胃肠间质瘤、慢粒胃肠间质瘤、慢粒 C-kitC-kit与格列卫与格列卫头颈部肿瘤头颈部肿瘤 艾必妥？艾必妥？化疗的个体化方案的研究大样本多中心的回顾性和前
18、瞻性研究大样本多中心的回顾性和前瞻性研究新的化疗药与新的化疗药与DNADNA损伤修复基因的关系损伤修复基因的关系培美曲塞培美曲塞DNA损伤修复通路所涉及的基因损伤修复通路所涉及的基因化疗化疗靶向治疗与基因：（以表皮生长因子受靶向治疗与基因：（以表皮生长因子受体酪氨酸激酶信号传导通路为例）体酪氨酸激酶信号传导通路为例） 作为作为EGFREGFR信号通路下游分子信号通路下游分子KRASKRAS因子在肺癌患因子在肺癌患者肿瘤组织中存在激活性突变者肿瘤组织中存在激活性突变KRASKRAS基因的突变是不良预后的标记之一。基因的突变是不良预后的标记之一。 EGFREGFR和和KRASKRAS的突变极少在患
19、者组织中同时存在的突变极少在患者组织中同时存在多个独立研究表明多个独立研究表明KRASKRAS突变患者对酪氨酸激酶抑突变患者对酪氨酸激酶抑制剂如制剂如Gefitinib(Gefitinib(同同IressaIressa，易瑞沙，易瑞沙) )和和ErlotinibErlotinib（同（同TarcevaTarceva，特罗凯）的治疗基本不反应，特罗凯）的治疗基本不反应 EGFR突变在4个外显子上的分布（a）以及对应的易瑞沙反应率(b)引自引自PLoS Med. 2005 Jan;2(1):e17. PLoS Med. 2005 Jan;2(1):e17. Epub 2005 Jan 25Epub 2005 Jan 25
