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1、1 1、制、制备型液相色型液相色谱 preparative liquid chromatographypreparative liquid chromatography 获得高得高纯物物质（色（色谱纯）的有效方法。）的有效方法。 半制半制备柱（内径柱（内径8 8mmmm，长度度15 15 30 30cmcm），），一次制一次制备量量.1.1mgmg；8/12/20242.2.制制备HPLCHPLC概述概述主要主要结构构单元元输液部液部: :输液液泵 shimadzu LC-6AD(shimadzu LC-6AD(适用于分析适用于分析- -半制半制备, ,再循再循环半制半制备) )分离部分离部:
2、 :制制备柱柱内径内径202050mm50mm，柱，柱长50cm50cm。检测部部: :检测器器 shimadzu SPD-M10Avpshimadzu SPD-M10Avp馏分部分部: :馏分收集器分收集器 shimadzu FRC-10Ashimadzu FRC-10A色色谱柱的柱容量（柱柱的柱容量（柱负荷）荷） 对分析柱：不影响分析柱：不影响柱效柱效时的最大的最大进样量；量； 对制制备柱：不影响柱：不影响收集物收集物纯度度时的的最大最大 进样量；量； 超超载：进样量超量超过柱容量。柱效迅柱容量。柱效迅速下降，峰速下降，峰变宽。 超超载可提高制可提高制备效率，以柱效下降效率，以柱效下降一半
3、或容量因子一半或容量因子k k降低降低10%10%为宜。宜。制制备HPLCHPLC概述概述柱容量柱容量制制备HPLCHPLC概述概述制制备HPLCHPLC与与 分析分析HPLHPL比比较目的目的 填料填料流量流量流通池流通池 联系系 制制备HPLCHPLC样品中特定品中特定成分的高成分的高纯度度获取，大取，大量、廉价的量、廉价的制制备 2020以上以上为佳佳 0.1-0.1-150ml/min 150ml/min 最大允最大允许流流速可速可为150mL/min150mL/min在在进行制行制备HPLCHPLC之之前，常先前，常先进行分析行分析HPLCHPLC实验，对分析方分析方法法进行行优化、
4、放大化、放大应用到制用到制备HPLCHPLC中。中。 分析分析HPLC HPLC 定性分析：定性分析：检测的灵敏的灵敏度度定量分析：定量分析：分离度、再分离度、再现性性 3-5 3-5 0.001-0.001-9.999ml/m9.999ml/minin一般的分析一般的分析池的最大允池的最大允许流速流速仅为5 mL/min5 mL/min，或者或者10mL/min10mL/min3. 3. 制制备型液相色型液相色谱仪 制制备型液相色型液相色谱：结构与分析型一构与分析型一样，但，但泵流量大、流量大、进样量大、采用制量大、采用制备柱；柱后柱；柱后馏分收集器。分收集器。 制制备柱：内径柱：内径202
5、05050mmmm，柱柱长5050cmcm。8/12/2024基本概念基本概念Cs=KCmCs=KCm线性色性色谱: :流流动相中的相中的样品品浓度度(Cm)(Cm)与固定相与固定相中的中的样品品浓度度(Cs)(Cs)呈呈线性关系性关系. .非非线性色性色谱: :CmCm与与CsCs不不存在存在线性关系的色性关系的色谱. .分析色分析色谱大多属于大多属于线性性色色谱;制制备色色谱大多属大多属于非于非线性色性色谱固固定定相相流流定定相相对应塔塔板界面板界面VsCsVmCm非非线性色性色谱的特点的特点1.1.样品的保留品的保留值可可变: :非非线性色性色谱的保留的保留值随随样品及其品及其浓度的不同
6、而度的不同而变化化; ;2.2.峰形的不峰形的不对称性称性: :不是高斯正不是高斯正态分布分布; ;3.3.色色谱峰的峰高与峰的峰高与浓度不是度不是线性关系性关系: :峰高峰高增加的速率随增加的速率随浓度的增加而下降度的增加而下降. .非非线性色性色谱理理论基基础研究研究对象：象：样品在固定相和流品在固定相和流动相中的相中的浓度度处于非于非线性关系下，各种性关系下，各种实验参数参数对色色谱分离分离过程的影响，建立起柱参数、溶程的影响，建立起柱参数、溶质性性质及操作条件之及操作条件之间的定量关系。的定量关系。首先要了解首先要了解CsCs与与CmCm之之间的函数关系，也的函数关系，也即要研究即要研
7、究吸附等温吸附等温线及相及相应的吸附模型的吸附模型吸附等温吸附等温线：一定温度下物一定温度下物质分子在分子在两相界面上两相界面上进行的吸附行的吸附过程达到平衡程达到平衡时它它们在两相中在两相中浓度之度之间的关系。的关系。分分类：凸形、凹形、：凸形、凹形、S S形、形、H H形、形、阶梯形梯形凹形凹形凸形凸形凸形凸形C Cmm线形形CsSigtR峰形tRm图8. 8. 分布等温分布等温线类型及型及对色色谱峰形和保留峰形和保留时间的影响的影响 通常出通常出现于大多数小分子化合物于大多数小分子化合物它反映了溶它反映了溶质分子在固体表面达到分子在固体表面达到饱和和时生成了生成了单分子吸附分子吸附层，随
8、着溶，随着溶质浓度的增加，吸附等温度的增加，吸附等温线的曲率逐的曲率逐渐减小，最后减小，最后为零即达到零即达到饱和和态。“拖尾拖尾”H H型等温型等温线是凸形等温是凸形等温线的特殊状的特殊状态，它代表了一，它代表了一类很容易在固体表面吸附的物很容易在固体表面吸附的物质，而且很容，而且很容易达到易达到饱和，和，这类吸附主要是一些分子量吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙、聚苯乙烯凹形吸附等温凹形吸附等温线是适用于在低是适用于在低浓度下已吸附度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，从的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，从而生成多分子吸附而生成多分子吸附层的那些物
9、的那些物质，所以，所以这种种吸附等温吸附等温线的曲率随的曲率随浓度的增加而增加。度的增加而增加。S S形等温形等温线实际上是凸形与凹形两种等温上是凸形与凹形两种等温线叠叠加的加的产物，它代表了被吸附的分子之物，它代表了被吸附的分子之间具有很具有很强的作用力，能的作用力，能进一步吸附其他分子，而溶一步吸附其他分子，而溶质分子与固相表面的作用力相分子与固相表面的作用力相对较弱，或者与表弱，或者与表面覆盖率无关。面覆盖率无关。？问题：各种各种类型等温型等温线代表的溶代表的溶质在在两相两相间具哪些分配特性？具哪些分配特性？问题：从吸附等温从吸附等温线能提供哪些非能提供哪些非线性色性色谱性性质的信息？的
10、信息？吸附等温吸附等温线可以提供以下信息：可以提供以下信息：1.1.预测代表代表该吸附等温吸附等温线的的组分在非分在非线性性色色谱中中色色谱峰的形状峰的形状；2.2.为非非线性色性色谱分离与分离与纯化物化物质选择最佳最佳条件；条件；3.3.反映反映被分离物被分离物质分子与固定相表面的作分子与固定相表面的作用，从而用，从而研究分子的构型及吸附状研究分子的构型及吸附状态。4.4.建立建立分子分子结构构- -吸附之吸附之间的定量关系的定量关系，从而由分子从而由分子结构构预测吸附性能。吸附性能。吸附等温吸附等温线的的测定定A A、静、静态测量法量法q q与与C C之之间的关系（的关系（q q：溶：溶质
11、在吸附在吸附剂上的上的浓度；度；C C：溶液：溶液浓度）：度）：q=q=C.V/GC.V/G（V V为溶液体溶液体积，G G为吸附吸附剂量）量）优点：方便点：方便简单，不需要特殊的，不需要特殊的仪器器缺点：缺点：测量量缓慢，平衡慢，平衡时间长，平衡点不，平衡点不容易判断，数据不易容易判断，数据不易测准，准，对比比较昂昂贵的的生物生物样品不合适。品不合适。B B、动态法法常用的有常用的有4 4种方法种方法: :前沿分析法前沿分析法(FA)(FA)特征点前沿分析特征点前沿分析(FACP)(FACP)特征点洗脱特征点洗脱(ECP)(ECP)平台洗脱平台洗脱(EP)(EP)非非线性色性色谱基本理基本理
12、论（P146P146147147）吸附平衡吸附平衡热力学；力学；吸附平衡吸附平衡动力学力学; ;色色谱基本物料平衡方程。基本物料平衡方程。色色谱基本物料平衡方程可以解基本物料平衡方程可以解释为何不同的何不同的吸附等温吸附等温线会会产生不同形状的非生不同形状的非线性色性色谱峰峰非非线性色性色谱固定相固定相非非线性色性色谱中中粗和粗和细的的颗粒都在使用粒都在使用，原原则上上细颗粒填料的柱效高，价格比粒填料的柱效高，价格比较贵。粗粗颗粒填料柱效低，但价格便宜，而且柱粒填料柱效低，但价格便宜，而且柱压低适合制低适合制备柱。柱。从材料看从材料看目前有：硅胶目前有：硅胶类和有机和有机树脂脂类。孔径大小：孔
13、径大小：对不同生物大分子分离有各自不同生物大分子分离有各自不同的合适孔径大小不同的合适孔径大小色色谱柱及填充技柱及填充技术最最长柱柱长！原因：！原因：1.1.超超过-无法得到均匀填充床；无法得到均匀填充床；2.2.柱效不是与柱柱效不是与柱长永永远成比例增成比例增长；3.3.高高压泵的容量的限制。的容量的限制。色色谱柱及填充技柱及填充技术填充方式：填充方式：干法干法：适用于直径：适用于直径30um30um的的颗粒；粒；湿法湿法：适用于直径：适用于直径20um20um的的颗粒。粒。 在用溶在用溶剂平衡平衡时，先使，先使材料沉淀，用材料沉淀，用倾泻法除去泻法除去悬浮的浮的细颗粒，粒，否否则由于由于细
14、颗粒的堵塞，溶粒的堵塞，溶剂的流速将的流速将显著降低。著降低。 为防止出防止出现死空死空间而降低柱效，可而降低柱效，可对制制备柱采用柱采用压缩技技术样品溶解与品溶解与进样技技术增加溶增加溶质的溶解度：的溶解度：溶溶剂的性的性质必必须适适应于所用的固定相；于所用的固定相；使大量的使大量的样品溶液品溶液导入色入色谱柱后不柱后不马上上扩散散在反相色在反相色谱中，溶解中，溶解样品的溶品的溶剂极性必极性必须大大吸附色吸附色谱中恰恰相反，溶中恰恰相反，溶剂的极性必的极性必须小于流小于流动相相疏水作用色疏水作用色谱中，溶中，溶剂的离子的离子强度不能小于流度不能小于流动相相的离子的离子强度度进样：必：必须保保
15、证大量大量样品溶液能品溶液能均匀分布在柱的截面上，使均匀分布在柱的截面上，使轴向向扩散及局部超散及局部超载降至最低。降至最低。（1 1）采用）采用带样品管的六通品管的六通进样阀；（2 2）用高）用高压泵直接直接输送送样品品非非线性色性色谱的的3 3种展开方式种展开方式1.1.超超载洗脱：洗脱：与与传统的洗脱方法差的洗脱方法差别不大。不大。但但样品在固定相上的品在固定相上的负载超超过了了线性洗脱性洗脱色色谱的容量，展开的容量，展开时浓度逐度逐渐稀稀释，形成，形成较宽而平坦的峰。而平坦的峰。优点：点：产率高，省率高，省时，节省溶省溶剂缺点：柱效不如缺点：柱效不如线性洗脱高，溶性洗脱高，溶剂不断不断
16、稀稀释，后期，后期纯化麻化麻烦。非非线性色性色谱的的3 3种展开方式种展开方式2.2.前沿分析：前沿分析：样品溶液不是作品溶液不是作为一部分一部分进入入色色谱柱，而是柱，而是连续不断地不断地输入色入色谱柱，即柱，即它本身起了流它本身起了流动相的作用。洗脱展开峰是相的作用。洗脱展开峰是以一个个台以一个个台阶的方式展示的。的方式展示的。适合适合浓缩痕量痕量组分分; ;适合适合产品精制品精制, ,除去痕量除去痕量组分分; ;不会被稀不会被稀释非非线性色性色谱的的3 3种展开方式种展开方式3.3.置置换展开：在展开：在样品品输入色入色谱柱后，用一种柱后，用一种与固定相作用力极与固定相作用力极强的流的流动相通入色相通入色谱柱，柱，去替代去替代结合在固定相表面的溶合在固定相表面的溶质分子。分子。优点：溶点：溶质浓度不降低，度不降低，还可以起可以起浓缩作作用。用。缺点：置缺点：置换剂不好找；合适的固定相和流不好找；合适的固定相和流动相的取得不容易。相的取得不容易。
