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1、第四节第四节 细胞培养技术细胞培养技术一、体外细胞培养技术一、体外细胞培养技术 细胞培养（细胞培养（cell culturecell culture）：）：是指从活体中取是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。 优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变功能的改变 IN VITRO:IN VITRO:（离体的，即在玻璃容器中
2、）用培养细离体的，即在玻璃容器中）用培养细 胞进行的实验胞进行的实验IN VIVO:IN VIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验在体内的）完整机体内进行的实验 生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫IN IN VITROVITRO，在活细胞内发生的生化反应叫在活细胞内发生的生化反应叫IN VIVOIN VIVO原代培养（原代培养（primary cultureprimary culture）：）： 直接取材于有机体组织的细胞进行培养直接取材于有机体组织的细胞进行培养 传代培养（传代培养（secondary culturesecondary culture）
3、：）： 把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养细胞体外培养所需的一般条件：细胞体外培养所需的一般条件： 适宜的培养皿适宜的培养皿 血清成分血清成分 37 537 5COCO2 2 2 2 9595100100湿度湿度 抗生素抗生素细胞系（细胞系（cell linecell line）：）： 在在细胞细胞培养中产生了具有无限增殖能力的培养中产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞可被无限的传代。变种细胞，这种细胞可被无限的传代。常见的细胞系：常见的细胞系：NIH3T3NIH3T3细胞系：细胞系：19631963年取自小鼠胚胎细胞建立年取自小鼠胚胎细胞建立H
4、elaHela细胞系：细胞系：19521952年取自人宫颈癌细胞建立年取自人宫颈癌细胞建立 二、细二、细胞胞融融合合技技术术（一）、细胞融合（一）、细胞融合（cell fusioncell fusion）：）：是指是指 将两个或两个以上的细胞合并形成一个细将两个或两个以上的细胞合并形成一个细 胞的过程。胞的过程。 异核体：异核体： 将两个不同类型的细胞融合，将两个不同类型的细胞融合，可使两个不同来源的细胞核在同一可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能，这种细胞叫异核细胞中表达功能，这种细胞叫异核体。常用灭活的仙台病毒或聚乙二体。常用灭活的仙台病毒或聚乙二醇（醇（PEGPEG）人工促使融合
5、。异核体进人工促使融合。异核体进行有丝分裂则可产生杂种细胞。行有丝分裂则可产生杂种细胞。（二）、单克隆抗体技术（二）、单克隆抗体技术 B B淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变为浆细胞产生抗体。为浆细胞产生抗体。每一个每一个B B淋巴细胞只能接淋巴细胞只能接受单一的抗原刺激产生特异性抗体受单一的抗原刺激产生特异性抗体, ,从单个从单个B B淋淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫单克隆抗体单克隆抗体( (monoclonal antibody) monoclonal antibody) 。 B B淋巴细胞不能在体外无限
6、增殖淋巴细胞不能在体外无限增殖, ,故故19751975年年k kehlerehler和和MilsteinMilstein利用杂交瘤技术利用杂交瘤技术, ,使绵羊红使绵羊红细胞细胞( (SRBC)SRBC)免疫后小鼠的免疫后小鼠的B B淋巴细胞和小鼠的淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合骨髓瘤细胞融合, ,建立产生抗建立产生抗SRBCSRBC单抗的杂交单抗的杂交细胞株。它既具有细胞株。它既具有B B淋巴细胞产生特异性抗体淋巴细胞产生特异性抗体的能力的能力, ,又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点点, ,可不断在细胞培养上清液中产生单抗。可不断在细胞培养上清液中产生单抗。
7、 B B淋巴细胞可产生抗体但在体外不淋巴细胞可产生抗体但在体外不易存活，小鼠骨髓瘤细胞可在体外培易存活，小鼠骨髓瘤细胞可在体外培养生存并无限增殖。将小鼠骨髓瘤细养生存并无限增殖。将小鼠骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的胞与分泌某种抗体的B B淋巴细胞融合，淋巴细胞融合，这种融合细胞即具有肿瘤细胞无限增这种融合细胞即具有肿瘤细胞无限增殖的特性，又具有殖的特性，又具有B B淋巴细胞分泌特异淋巴细胞分泌特异抗体的能力，称为抗体的能力，称为杂交瘤细胞杂交瘤细胞。 单克隆抗体在应用上的局限原因单克隆抗体在应用上的局限原因 1 1、完整、完整IgIg分子量大分子量大, ,难以穿透肿瘤组织难以穿透肿瘤组织, ,达达
8、 不到有效剂量不到有效剂量 2 2、鼠源性抗体异质性、鼠源性抗体异质性 3 3、半衰期短、半衰期短, ,只有只有5 56 6小时小时 4 4、肿瘤细胞抗原性调变、肿瘤细胞抗原性调变, ,抗体分子不能有抗体分子不能有 效地与肿瘤抗原结合效地与肿瘤抗原结合, ,使效价下降使效价下降 第五节第五节 细胞分子生物学研究方法细胞分子生物学研究方法 一、原位分子杂交技术一、原位分子杂交技术 DNADNA变性变性: :当溶液中的当溶液中的DNADNA分子处于高温或分子处于高温或高高pHpH值值(13)(13)条件下条件下, ,维持双螺旋在一起的碱基维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏互补对就被破坏, ,DN
9、ADNA双链解离成两条单链双链解离成两条单链, ,这这一过程叫一过程叫DNADNA变性。变性。 DNADNA复性复性: :当温度降低至合适温度或恢复当温度降低至合适温度或恢复pHpH值值至中性，两条裂解的至中性，两条裂解的单链按单链按碱基互补配碱基互补配对原则对原则重新形成双链结构重新形成双链结构, ,这一过程叫这一过程叫DNADNA复复性性, ,又叫又叫DNADNA杂交。杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的不同来源的序列互补单链的DNA/DNADNA/DNA，RNA/RNARNA/RNA，RNA/DNARNA/DNA，互补
10、配对成双链杂交分互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。子，这一过程叫核酸分子杂交。原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序 在其原位进行杂交在其原位进行杂交, ,叫原位杂交。可叫原位杂交。可 用于用于DNADNA、RNARNA定位研究。定位研究。 荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISHfluorescence in situ hybridization,FISH）二、聚合酶链反应技术（二、聚合酶链反应技术（polymerase chain polymerase chain rea
11、ctionreaction，PCRPCR）又叫体外基因扩增技又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的术。利用人工合成的一对引物，在被扩增一对引物，在被扩增DNADNA模板链的两端形成模板链的两端形成双链，由双链，由DNADNA聚合酶催聚合酶催化一对引物之间的聚合化一对引物之间的聚合反应。反应。 具体过程：具体过程： 变性：将双链变性：将双链DNADNA加热（加热（9595）使）使 之变性，之变性，DNADNA双链变成单链双链变成单链 退火：降低温度至退火：降低温度至5656使引物与使引物与 模板模板DNADNA单链结合单链结合 延伸：将温度升至延伸：将温度升至7272，在，在DNADNA聚聚 合酶
12、作用下，在引物合酶作用下，在引物33端端 进行延伸，使原模板进行延伸，使原模板DNADNA的的 一条链变成两条链。一条链变成两条链。三、三、反义核酸技术反义核酸技术 主要是引入主要是引入mRNAmRNA的的反义序列或与目的基因反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，互补配对的反义基因，通过它们的杂交阻遏或通过它们的杂交阻遏或降低目的基因表达的一降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义种方法。当引入的反义核酸与相应序列配对后核酸与相应序列配对后，用于表达目的基因的，用于表达目的基因的mRNAmRNA量大大减少，使细量大大减少，使细胞中靶基因编码的蛋白胞中靶基因编码的蛋白合成量也大为减少合成量也大
13、为减少反义技术的应用：反义技术的应用： 基因功能的研究基因功能的研究 病毒基因组功能的研究病毒基因组功能的研究 作为药物作为药物 抗肿瘤作用抗肿瘤作用 四、基因转移技术四、基因转移技术 将外源基因转移到受体菌或细胞内将外源基因转移到受体菌或细胞内使之在细胞内实现转入基因的扩增或表使之在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术。它是重组达的技术。它是重组DNADNA、基因功能研究、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一。基因治疗的关键技术之一。 方式：方式： 转化转化 转染转染 转染技术转染技术是指将外源分子如是指将外源分子如DNADNA，RNARNA等等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调导入真核
14、细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具，随着功能研究控，突变分析等的常规工具，随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。的兴起，其应用越来越广泛。 常规转染技术可分为两大类，一类是常规转染技术可分为两大类，一类是瞬瞬时转染时转染，一类是，一类是稳定转染稳定转染（永久转染）。前（永久转染）。前者外源者外源DNA/RNADNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定动子和其它调控
15、元件的分析。后者也称稳定转染，外源转染，外源DNADNA既可以整合到宿主染色体中，既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（也可能作为一种游离体（episomeepisome）存在。外存在。外源源DNADNA整合到染色体中概率很小，大约整合到染色体中概率很小，大约1/1041/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 影响转染效率的主要因素有：影响转染效率的主要因素有：1 1、细胞培养物、细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。健康的细胞培养物是成功转染的基础。
16、不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前荐在转染前2424小时将细胞传代，这样可提供小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源正常细胞代谢，增加对外源DNADNA摄入的可能。摄入的可能。另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。2 2、血清、血清 大多数培养基在使用前需要加血清。血大多数培养基在使用前需要加血清。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测试出对细胞生长良好的血转染前建
17、议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源时做负对照（不加转染试剂及外源DNADNA）以以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。因此在转染前要除血清。3 3、载体构建、载体构建 转染载体的构建也影响转染结果。病毒转染载体的构建也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定病毒载体有其特定的宿
18、主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑一些安全问题的细胞周期，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如果态及大小对转染效率也有不同的影响，如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成及合适的启动子也很重要，行，因此选择组成及合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因相同载体构建的正同时做空载体及其它基因相同载体构建的正对照可排除毒性影响的干扰。对照可排除毒性影响的干扰。4 4、DNADNA质量质量 DNADNA质量对转染效率影响非常大。质量对
19、转染效率影响非常大。如果如果DNADNA不纯，带少量的盐离子、蛋不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。复合物的有效形成及转染的进行。5 5、转染技术、转染技术 转染技术的选择对转染结果影转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化响也很大，许多转染方法需要优化DNADNA与转染试剂比例，细胞数量，培与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。养及检测时间等。 五、基因敲除与敲进五、基因敲除与敲进 基因敲除基因敲除（knock out of geneknock out of gene）：）：利用利用基因打靶技
20、术，用无功能的外源基因转基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。叫基因敲除。 基因敲进基因敲进（knock in of geneknock in of gene）：）：利用利用基因同源重组，将外源有功能的基因转基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。进。 意义：意义： 研究基因功能研究基因功能 转基因动物的制备转基因动物的制备 用于药物筛选的动物模型用于药物筛选的动物模型 转基因动物可作为转基因动物可作为“生物反应器生物反应器”生产药物生产药物
