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1、常规常规PCR技术技术和和琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室u掌握：掌握：1、PCR的基本操作方法。的基本操作方法。2、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理和方法。的基本原理和方法。u理解：理解：1、PCR仪的使用方法。仪的使用方法。u了解：了解：1、PCR体外扩增的原理及其引物设计原则。体外扩增的原理及其引物设计原则。2、扩增过程中各因素对扩增结果的影响。、扩增过程中各因素对扩增结果的影响。教学目的：教学目的：1 1、PCRPCR反应体系的建立。反应体系的建立。2 2、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测PCRPCR产物。产物
2、。教学重点：教学重点：教学难点：教学难点： 1 1、PCRPCR反应程序的设计方法。反应程序的设计方法。一、基本原理一、基本原理聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：）：体外体外DNA酶促扩增技术，能特异高效地在体外扩增目酶促扩增技术，能特异高效地在体外扩增目的的DNA片段。片段。PCR反应的基本步骤反应的基本步骤变性变性9494C C双链双链DNADNA模板模板被加热变性成被加热变性成两条单链两条单链退火退火4560 C（Tm-5C）寡聚核苷酸引物按寡聚核苷酸引物按碱基互补配对原则碱基互补配对原则与单链模板与单链模板DNADNA特特异结
3、合异结合延伸延伸72CDNADNA聚合酶作用下，聚合酶作用下，以引物为起始，以引物为起始，合成与模板合成与模板DNADNA互互补的新链补的新链Cycle 25 5 5 5 5 Primer 15 Primer 2Cycle 1 5 5 Template DNAPCRPCR技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳原理把把把把DNADNADNADNA样品加入到琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于
4、静样品加入到琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静样品加入到琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静样品加入到琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静电场上。由于电场上。由于电场上。由于电场上。由于DNADNADNADNA分子的双螺旋骨架两侧带有含分子的双螺旋骨架两侧带有含分子的双螺旋骨架两侧带有含分子的双螺旋骨架两侧带有含负电负电负电负电荷的磷酸根残基荷的磷酸根残基荷的磷酸根残基荷的磷酸根残基，因此，因此，因此，因此在电场中向正极移动在电场中向正极移动在电场中向正极移动在电场中向正极移动。具有。具有。具有。具有不同的相对分子质量的不同的相对分子质量的不同的相对分子质量的不同的相对分子质量的DNADNADNADNA片段泳
5、动速度不一样，因片段泳动速度不一样，因片段泳动速度不一样，因片段泳动速度不一样，因而可依据而可依据而可依据而可依据DNADNADNADNA分子的大小来使其分离。分子的大小来使其分离。分子的大小来使其分离。分子的大小来使其分离。在电泳前向凝胶或样品中预加在电泳前向凝胶或样品中预加在电泳前向凝胶或样品中预加在电泳前向凝胶或样品中预加示踪染料示踪染料示踪染料示踪染料，电泳过程，电泳过程，电泳过程，电泳过程中染料同中染料同中染料同中染料同DNADNADNADNA结合，电泳后在紫外光照射下，可观察结合，电泳后在紫外光照射下，可观察结合，电泳后在紫外光照射下，可观察结合，电泳后在紫外光照射下，可观察到荧光
6、，从而对分离的到荧光，从而对分离的到荧光，从而对分离的到荧光，从而对分离的DNADNADNADNA进行检测。进行检测。进行检测。进行检测。二、操作步骤二、操作步骤模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶(如如Taq酶酶)dNTPs反应缓冲液（含反应缓冲液（含Mg2+） PCR反应的基本组分反应的基本组分10PCR缓冲液（缓冲液（Mg2+Plus）5ldNTP混合物（混合物（2.5mM）4l上游引物（上游引物（10M）2l下游引物（下游引物（10M）2lDNA模板模板4lTaqDNA聚合酶（聚合酶（2.5U/l）1l去离子水去离子水32l实验步骤一：实验步骤一：PCRPCR反
7、应体系的建立（重点）反应体系的建立（重点）50 l2345671加样顺序加样顺序PCRPCR反应程序的设计反应程序的设计（难点）（难点） 预变性：预变性： 94 5 min94 5 min 变性：变性： 94 30 sec94 30 sec 退火：退火： 55 30 sec55 30 sec 延伸：延伸： 72 40 sec(60 sec)72 40 sec(60 sec) 最终延伸：最终延伸： 72 5 min72 5 min 保存：保存： 4 for ever4 for ever25cycles25cycles实验步骤二：实验步骤二：PCR反应程序的设计反应程序的设计PCR程序设计的主要因
8、素程序设计的主要因素循环温度和时间循环温度和时间Tm的概念：的概念： 在双链在双链DNA解链过程中，紫外吸光度的变化解链过程中，紫外吸光度的变化A260达到最大变化值的一般时所对应的温度。达到最大变化值的一般时所对应的温度。Tm计算方法计算方法碱基数小于碱基数小于20： Tm=4(GC%)+2(AT%)碱基数大于碱基数大于20： Tm=81.5+0.41(GC%) (675/引物长度引物长度)主要实验仪器主要实验仪器PCR仪仪主要实验仪器PCR仪仪实验步骤三：结果检测实验步骤三：结果检测琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测PCRPCR产物产物1. 1. 试剂：试剂：5050TAETAE电泳缓冲液：电泳
9、缓冲液：Tris 242 gTris 242 g，乙酸，乙酸57.1 ml57.1 ml， 0.5 0.5 mol/L EDTAmol/L EDTA（pH 8.0pH 8.0）100 ml100 ml，定容至，定容至1 L1 L，高压灭菌后备，高压灭菌后备用。用。1 1TAETAE电泳缓冲液：电泳缓冲液：20 ml 5020 ml 50TAETAE电泳缓冲液加入双蒸水，电泳缓冲液加入双蒸水，定容至定容至1 L1 L。2. 12. 1琼脂糖凝胶的配制：琼脂糖凝胶的配制： 100 ml TAE100 ml TAE电泳缓冲液中加入电泳缓冲液中加入1 g1 g琼脂糖，摇匀后放入微波琼脂糖，摇匀后放入微
10、波炉中，小火加热几分钟至溶液透明位置，取出后冷却至炉中，小火加热几分钟至溶液透明位置，取出后冷却至5656左右时，加入微量（左右时，加入微量（3.5 L）的）的EBEB（溴化乙锭溴化乙锭），混，混匀后倒入槽中，冷却后待用。匀后倒入槽中，冷却后待用。不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围片段大小的范围琼脂糖/标准高强度低熔点0.30.5700bp25kb0.8500bp15kb 800bp10kb 800bp10kb1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb3
11、. 3. 上样上样反应结束后取反应结束后取5L5L反应产物，加入反应产物，加入1L1L上样缓冲液上样缓冲液（6 6loading bufferloading buffer），用），用1%1%琼脂糖凝胶电泳检琼脂糖凝胶电泳检测。测。 指示剂：溴酚蓝指示剂：溴酚蓝MarkerMarker：DL2000DL2000。注意：注意： 加样孔位于负极，加样孔位于负极，DNADNA由负极向正极泳动由负极向正极泳动40604. 4. 电泳电泳 电泳电泳100 V100 V，10 min10 min左右左右。5. 5. 观察观察 凝胶成像系统或紫外灯下观察结果凝胶成像系统或紫外灯下观察结果 （手套拿取凝胶）（手
12、套拿取凝胶）三、注意事项三、注意事项 1 1、注意移液枪的正确使用方法。、注意移液枪的正确使用方法。 2 2、按顺序逐一加入、按顺序逐一加入PCRPCR反应体系各组分，切勿遗漏。反应体系各组分，切勿遗漏。 3 3、取用各组分时，应避免污染和贴枪头壁损失。、取用各组分时，应避免污染和贴枪头壁损失。 4 4、按操作步骤正确设置使用、按操作步骤正确设置使用PCRPCR仪。仪。 5 5、带手套操作实验。、带手套操作实验。四、影响四、影响PCR反应的因素反应的因素1 1、模板、模板 任何任何来源的来源的各种构型的含量极低的各种构型的含量极低的DNA样品都样品都可作可作PCR的模板。的模板。 轻微的污染轻
13、微的污染都会影响都会影响PCR的最终结果。的最终结果。2 2、脱氧核苷三磷酸（、脱氧核苷三磷酸（dNTPsdNTPs） 4 4种种dNTPdNTP在反应中浓度应相等，过高会抑制在反应中浓度应相等，过高会抑制TaqTaq酶活性，增加错配的几率。酶活性，增加错配的几率。 3 3、引物、引物( (引物的好坏是整个引物的好坏是整个PCRPCR反应的关键反应的关键) ) 引物浓度一般为引物浓度一般为0.10.10.5mmol/L0.5mmol/L，浓度太高，会增加非特，浓度太高，会增加非特异性扩增，形成引物二聚体；浓度太低，影响扩增异性扩增，形成引物二聚体；浓度太低，影响扩增效率效率和产率。和产率。*
14、*引物设计的原则引物设计的原则长度长度1515 30bp30bpGCGC含量含量4545 55%55%两条引物退火温度一致或接近，两条引物退火温度一致或接近，TmTm差值小于差值小于55无连续核苷酸无连续核苷酸引物内部及引物间无互补，以免形成发夹结构和引物引物内部及引物间无互补，以免形成发夹结构和引物二聚体二聚体特特异异性性的的引引物物：特特异异性性的的产产物物4 4、MgMg2+2+浓度浓度MgMg2+2+是是DNADNA聚合酶发挥聚合酶发挥作用的必须成分；作用的必须成分；最适浓度一般为最适浓度一般为0.5-0.5-2.5mmol/L,2.5mmol/L,浓度过低浓度过低则无法启动反应，过则
15、无法启动反应，过高则影响产物特异性。高则影响产物特异性。5 5、Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 具有具有5 533DNADNA聚合活性外，还具有聚合活性外，还具有5 533DNADNA外切活性。因此，在某些时候可选外切活性。因此，在某些时候可选择具有校读活性的聚合酶例如择具有校读活性的聚合酶例如PfuPfu；可以根据需要选择扩增长片段的可以根据需要选择扩增长片段的TaqTaq酶，高速扩酶，高速扩增的增的TaqTaq酶等酶等 反应终浓度以反应终浓度以2 22.5 U/1002.5 U/100l l为最佳为最佳 五、问题分析五、问题分析问题问题1 1：无扩增产物：无扩增产物现象：正对照有
16、条带，而样品则无现象：正对照有条带，而样品则无M样品样品A 样品样品B 正对照正对照1.1.纯度：含有抑制物纯度：含有抑制物2.2.浓度：含量低浓度：含量低3.3.质量：全长质量：全长4.4.结构：二级结构结构：二级结构 原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用优质纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板试剂盒提取模板DNADNA2.2.加大模板的用量加大模板的用量3.3.用好的反转录酶用好的反转录酶4.4.用温度高的反转录酶用温度高的反转录酶(1)(1)无扩增产物之无扩增产物之模板原因模板原因1.引物错误引物错误2.引物设计不好引物设计不好3.引物降解引物降解4.引物合成、纯化不好引物合成、纯化不
17、好 原原因因对对策策1.1.合成前检查合成前检查2.2.评价、重新设计引物评价、重新设计引物3.3.换一管新引物换一管新引物4.4.免费重新合成免费重新合成(2)无扩增产物之引物原因1.退火温度退火温度2.延伸时间延伸时间3.循环次数循环次数 原原因因对对策策1.1.递度递度PCRPCR2.2.聚合酶的延伸速度聚合酶的延伸速度3.3.适当增加循环数适当增加循环数(3)(3)无扩增产物之无扩增产物之PCRPCR条件原因条件原因 现象：现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题问题2 2：非特异性扩增：非特异性扩增 M 1 21.1.引物特异性差引物
18、特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增非特异性扩增靶序列或扩增产靶序列或扩增产物的交叉污染。物的交叉污染。 原原因因1.1.开开管管轻轻柔柔，防防止止形形成成气气溶溶胶胶；防防止止靶靶序序列列吸吸入入加加样样枪枪内内或或溅溅出离心管外。出离心管外。2.2.更换试剂、耗材。更换试剂、耗材。3.3.试剂分装，贮存适当。试剂分装，贮存适当。4.4.更换实验室和所有试剂耗材。更换实验室和所有试剂耗材。问题问题3 3：假阳性：假阳性现象：现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物对策对策Thanks your attention！
