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1、(新)医学微生物学（实验二实验二）主讲人：岳启安实验内容实验内容 一、细菌的分布一、细菌的分布 二、消毒与灭菌二、消毒与灭菌 三、细菌的遗传变异三、细菌的遗传变异 四、细菌的生化反应四、细菌的生化反应 五、球菌五、球菌一、细菌的分布一、细菌的分布 1.空气空气 2.手指（自做）手指（自做） 3. 齿垢涂片（自做）齿垢涂片（自做） 4. 泥土（示教）泥土（示教）1.To examine bacteria in air of laboratory10min37 24hcoverTo observe the result2.To examine bacteria on finger Press as
2、 fingerprintbeforesterilizationaftersterilizationAYour sign3.齿齿 垢垢 涂涂 片片NSStep of Gram stainPurple(G+)Red(G- )Smear Smear crystal violet Lugols iodine 95% ethyl alcohol safranin +washwashwash1min2min3 0 seconds washBlot dry with bibulous paperthe oil-immersion objective (fixed) 1min 齿垢涂片齿垢涂片二、消毒与灭菌二
3、、消毒与灭菌 1.紫外线杀菌试验紫外线杀菌试验 2.药敏试验药敏试验 抑菌圈抑菌圈 抗生素滤纸片抗生素滤纸片3.化学消毒剂的杀菌试验（自做）化学消毒剂的杀菌试验（自做）三、细菌的遗传变异三、细菌的遗传变异 细菌的变异现象细菌的变异现象 1.HO变异变异 2.L型变异型变异 3.耐药性变异耐药性变异变形杆菌迁徙生长现象变形杆菌迁徙生长现象1.HO变异变异形态结构变异 青霉素、溶菌酶青霉素、溶菌酶正常形态细菌正常形态细菌 L型变异型变异 抗体或补体抗体或补体 (部分或完全失去胞壁)葡萄球菌葡萄球菌葡萄球菌葡萄球菌L L型型2.L型变异型变异 3. 耐药性变异耐药性变异四、细菌的生化反应四、细菌的生
4、化反应根据细菌含有不相同的酶系统，可分解不根据细菌含有不相同的酶系统，可分解不同的营养物质，用生化方法来鉴定细菌同的营养物质，用生化方法来鉴定细菌,称细菌的生化反应称细菌的生化反应1、细菌的分解代谢、细菌的分解代谢（1）糖发酵试验）糖发酵试验(Fermentation of sugars) 细菌分解糖时，则细菌分解糖时，则产酸产酸，使指示剂，使指示剂变为黄色变为黄色( “”)；有些细菌在分；有些细菌在分解糖解糖产酸产酸的同时还的同时还产生气体产生气体，在管，在管中有气泡出现中有气泡出现( )；如细菌；如细菌不分不分解解该糖时，指示剂不变色该糖时，指示剂不变色 ()。五糖生化反应：五糖生化反应：
5、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖（指示剂（指示剂-溴甲酚紫）溴甲酚紫）（对应发酵管颜色：红、黄、蓝、白、黑）（对应发酵管颜色：红、黄、蓝、白、黑）大肠杆菌：大肠杆菌： 伤寒杆菌：伤寒杆菌： 伤寒杆菌伤寒杆菌 大肠杆菌大肠杆菌 （2）吲哚试验）吲哚试验 有些细菌如大肠杆菌等能分解蛋白胨有些细菌如大肠杆菌等能分解蛋白胨水中的水中的色氨酸色氨酸生成吲哚（靛基质），与生成吲哚（靛基质），与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛相互作用，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛相互作用，形成形成玫瑰红色化合物玫瑰红色化合物，为吲哚试验阳性。，为吲哚试验阳性。五、球五、球 菌菌 1.球菌形态观察
6、球菌形态观察 2.球菌培养物观察球菌培养物观察 3.血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 4.抗抗O试验试验 Staphylococcus(Gram stain)1.球菌形态观察球菌形态观察 Streptococcus （Gram stain）pneumococcusMeningococcus淋球菌（gonococcus）金黄色葡萄球菌菌落金黄色葡萄球菌菌落2.球菌培养物观察球菌培养物观察乙型溶血性链球菌菌落乙型溶血性链球菌菌落3.血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 血浆凝固酶能使含有枸橼酸钠或肝素抗血浆凝固酶能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。
7、凝固酶有两种：一种是分泌至菌体外的凝固酶有两种：一种是分泌至菌体外的蛋白质称为游离凝固酶；另一种结合于蛋白质称为游离凝固酶；另一种结合于菌体表面并不释放的凝固酶，称结合凝菌体表面并不释放的凝固酶，称结合凝固酶或凝聚因子。固酶或凝聚因子。 凝凝 固固 酶酶游离游离 凝凝 固固 酶酶结合结合 凝凝 固固 酶酶协同因子凝血酶样物质凝血酶样物质纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白原( (液态）液态）液态）液态）纤维蛋白（固态）纤维蛋白（固态）纤维蛋白（固态）纤维蛋白（固态）血浆凝固血浆凝固 （试管法试管法）（纤维蛋白原受体）（纤维蛋白原受体）血浆纤维蛋白原血浆纤维蛋白原 +细菌凝聚细菌凝聚（玻片法玻
8、片法）（1）试管法）试管法 取两支灭菌小试管，每管加入取两支灭菌小试管，每管加入1：4稀释稀释的兔血浆的兔血浆0.5ml，用灭菌接种环沾取金黄色用灭菌接种环沾取金黄色葡萄球菌培养物，在一小试管内壁研磨使葡萄球菌培养物，在一小试管内壁研磨使成均匀的混悬液；另一试管用表皮葡萄球成均匀的混悬液；另一试管用表皮葡萄球菌做为对照。将两试管放在菌做为对照。将两试管放在37水浴箱或水浴箱或温箱中温箱中24h 观察结果观察结果。观察结果时使试观察结果时使试管倾斜，凡血浆呈现胶胨样凝集者即为阳管倾斜，凡血浆呈现胶胨样凝集者即为阳性，仍呈液状者为阴性。性，仍呈液状者为阴性。沾菌的接种环在此处沾菌的接种环在此处管内
9、壁上轻轻研磨管内壁上轻轻研磨 （2）玻片法）玻片法 在载玻片上各滴兔血浆、盐水一滴，在载玻片上各滴兔血浆、盐水一滴，取金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌平取金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌平板培养物加入其中混匀，立即观察结板培养物加入其中混匀，立即观察结果。有明显小凝块出现为阳性，无此果。有明显小凝块出现为阳性，无此现象者时为阴性。此法较简便，但不现象者时为阴性。此法较简便，但不如试管法锐敏、准确。如试管法锐敏、准确。Procedures:Rabbit plasmaNSS.aureus S. epidermidisAfter mixing4.抗抗 O 试试 验验 原理：原理：乙型溶血性链球菌乙型溶血性链
10、球菌产生溶血毒素产生溶血毒素“O” （SLO ），具有很强的抗原性，可刺激机体产生抗），具有很强的抗原性，可刺激机体产生抗体，于感染后体，于感染后23周至病愈后数月到一年可检出周至病愈后数月到一年可检出SLO抗体，风湿热病人血清中抗体，风湿热病人血清中SLO抗体显著升高，抗体显著升高，一般其效价在一般其效价在1：400以上以上。因此，测定。因此，测定SLO抗体含抗体含量，可了解近期内有无链球菌感染的病史，作为风量，可了解近期内有无链球菌感染的病史，作为风湿病辅助诊断的指标。湿病辅助诊断的指标。SLO胶乳试剂测定抗胶乳试剂测定抗O试验（反应板法）试验（反应板法） 血清中血清中ASLO的测定可用于
11、链球菌感染的的测定可用于链球菌感染的诊断，诊断，ASLO高滴度的病人血清被适量的高滴度的病人血清被适量的SLO中和后还有多余的中和后还有多余的ASLO，这些多余的，这些多余的抗体即与抗体即与SLO胶乳试剂反应，出现清晰、均胶乳试剂反应，出现清晰、均匀的凝集颗粒。匀的凝集颗粒。SLO胶乳试剂是根据免疫学胶乳试剂是根据免疫学原理将羟化聚苯乙烯胶乳与原理将羟化聚苯乙烯胶乳与SLO共价交联作共价交联作为抗原，用于测定受链球菌感染病人血清中为抗原，用于测定受链球菌感染病人血清中的的ASLO。2. Soluble streptolysin O，shake up 13 minute; 3. Soluble
12、streptolysin O combine with latex beads ， shake up 58 minuteNegative controlPositive control 1. Patient Serum Negative controlPositive control Patient Serum ASO ASO test: test: ASO ASO titer titer 1: 1: 400 400 units, units, help help to diagnose rheumatic fever.to diagnose rheumatic fever.Uniformity turbidityWhite granule agglutination + -.实验报告一、球菌形态绘图（葡萄球菌、链球菌、（葡萄球菌、链球菌、 脑膜炎双球菌、肺炎双球菌）脑膜炎双球菌、肺炎双球菌）二、记录并分析血浆凝固酶试验结果三、记录并分析抗“O”试验结果
