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1、细胞培养技术细胞培养技术(jsh)(jsh)第一页,共五十五页。细胞培养技术p细胞培养也叫细胞克隆技术。p通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品(chnpn)都是从细胞得来,所以细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。最核心、最基础的技术。什么什么(shn me)(shn me)是细胞培养?是细胞培养?第二页,共五十五页。细胞培养技术主要主要(zhyo)内容内容o实验设备实验设备o试剂及耗材试剂及耗材o清洗及灭菌清洗及灭菌(mi jn)(mi jn)o细胞培养细胞培养 (细胞生长过程,细胞来源,细胞复苏、传代及冻存,细胞计数,活力测定,细胞污染)第三页,共五十五页。细胞培养
2、技术一实验一实验(shyn)设备设备o超净工作台,生物安全柜oCO2培养箱o倒置显微镜o离心机o电热恒温(hngwn)水槽o液氮罐o纯水仪o压力蒸汽消毒器o电热干燥箱第四页,共五十五页。细胞培养技术 超净台超净台 生物生物(shngw)安全柜安全柜 酒精灯(酒精灯(),),离开离开(l ki)(l ki)要熄灭要熄灭 ! 酒精灯(酒精灯()第五页,共五十五页。细胞培养技术CO2培养箱培养箱nCO2培养箱设定(shdn)的条件为37,5CO2。倒置倒置(dozh)(dozh)显微镜显微镜第六页,共五十五页。细胞培养技术离心机离心机电热电热(dinr)恒温水槽恒温水槽 液氮:-196 液氮罐液氮罐
3、配平第七页,共五十五页。细胞培养技术纯水仪纯水仪 压力蒸汽压力蒸汽(zhn q)灭菌器灭菌器 电热干燥箱电热干燥箱由工作人员操作由工作人员操作(cozu),注意安全!,注意安全!第八页,共五十五页。细胞培养技术小结一实验设备小结一实验设备(shbi)及功能及功能o超净工作台,生物安全柜-操作平台oCO2培养箱-细胞生长的空间o倒置(dozh)显微镜-观察细胞o离心机-离心收集细胞o电热恒温水槽-加热o液氮罐-冻存细胞o纯水仪-制备一级水o压力蒸汽消毒器-灭菌o电热干燥箱-烘干器皿(酒精灯安全(酒精灯安全(nqun))第九页,共五十五页。细胞培养技术二试剂二试剂(shj)及耗材及耗材o培养基培养
4、基 o缓冲液缓冲液 o消化液消化液o血清血清(xuqng)(xuqng)o其他其他o耗材耗材 第十页,共五十五页。细胞培养技术培养基培养基 供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质,也是培养细胞生长(shngzhng)和繁殖的生存环境。成分及作用:成分及作用:氨基酸:组成蛋白质的基本单位碳水化合物:能量来源无机盐:帮助细胞维持渗透压平衡维生素:维持细胞生长的生物活性物质,在细胞代谢中起调节及控制作用第十一页,共五十五页。细胞培养技术培养基分类培养基分类(fn li) DMEM(高糖高糖,葡萄糖4500mg/L):成纤维、上皮细胞(293),一些实体瘤(Panc-1),原代神经元 DMEM(低糖低糖
5、,葡萄糖1000mg/L):间充质干细胞,单抗细胞融合RPMI 1640:血液(xuy)细胞(HL60)、一些实体瘤细胞(BT474)酚红:酚红:PH指示剂(黄色过酸、紫色过碱);酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素),涉及(shj)到激素和诱导的实验,建议选用无酚红培养基。ATCC美国模式培养物集存库第十二页,共五十五页。细胞培养技术缓冲液(洗涤缓冲液(洗涤(xd)细胞)细胞) PBS:磷酸缓冲盐溶液具有(jyu)pH缓冲作用的等渗盐溶液(常规实验皆可用)。(Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl)D-PBS:杜氏磷酸缓冲液,磷酸盐含量稍低,含有钙镁离子,用于胚胎学方面的研究。
6、Hanks:平衡盐溶液无机盐和葡萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平,可作为动植物细胞短期培养(几个小时)。D-Hanks:不含钙离子、镁离子、葡萄糖(使用消化液时)。第十三页,共五十五页。细胞培养技术消化液消化液o胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清(对胰酶产生抑制作用)的平衡盐溶液(如PBS、D-Hanks)。oEDTA溶液溶液一般用其钠盐,可溶性较好。有些组织需要Ca2+、Mg2+来保持其完整性,EDTA可以螯合这些离子(lz),可使细胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%,以无钙、镁的平衡盐溶液
7、配制。o胶原酶溶液胶原酶溶液主要水解结缔组织中胶原蛋白成分(用胰蛋白酶效果较差),使用Hanks溶液配置,常用剂量为最终浓度200U/ml(约为1mg/mL)。第十四页,共五十五页。细胞培养技术 提提供供基基本本营营养养物物质质、激激素素和和各各种种生生长长因因子子、提提供供结结合合蛋蛋白白、提提供供促促接接触触(jich)和和伸伸展展因因子子使使细细胞胞贴贴壁壁免免受受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。o保存血清最好的方法?保存血清最好的方法?建议血清保存在-20。解冻后存放于4时,请勿超过一个月。(分装)o如何解冻血清才不会使产品质量受
8、损如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议从冷冻箱取出后,置于28冰箱使之缓缓慢慢解解冻冻、融融解解。使用时,必须将解冻的血清充充分分混混匀匀,并且勿将血清置于37太久。 血清血清(xuqng)第十五页,共五十五页。细胞培养技术青霉素青霉素- -链霉素溶液链霉素溶液(rngy)(rngy) 青霉素的工作浓度为100U/ml,链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成,达到抑制细菌生长的作用,防止(fngzh)污染,对真菌和支原体无效。其他实验所需的试剂其他实验所需的试剂:药物(如ATRA)、检测试剂(如MTT)、细胞因子(如SCF)等第十六页,共五十五页。细胞培
9、养技术试剂标注试剂标注(bio zh)规范规范o试剂名称 NaClo配制浓度 0.5 mMo配制人 张三(zhn sn)o配制日期 2016.10.21第十七页,共五十五页。细胞培养技术耗材耗材o培养皿、瓶、孔板o离心管、移液管o枪尖o其他(qt)第十八页,共五十五页。细胞培养技术小结二试剂及耗材的分类小结二试剂及耗材的分类(fn li)及用途及用途o培养基(成分、分类) o缓冲液 (PBS、Hanks等)o消化液(分类及应用)o血清(xuqng)(作用、存储及解冻方法)o试剂标签要规范o耗材(分类(fn li)、用途) 第十九页,共五十五页。细胞培养技术o在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害
10、物质都非常敏感在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影均能影响培养细胞的生长响培养细胞的生长n微生物产品附带杂物n上次细胞残留物n非营养成分的化学物质o需要清洗需要清洗(qngx)的培养用品的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。(包括:浸泡(洁消精)、超声波清洗、冲洗、烘干四个步骤)三清洗三清洗(qngx)及灭菌及灭菌第二十页,共五十五页。细胞培养技术消毒灭菌消毒灭菌(mi jn)(mi jn)方法方法o物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法nCo60辐射(辐射(射线)射线):破坏生物大分子(塑料制品)n紫紫外外线线(200-300 nm):30min,阻阻止止细细菌菌、病病毒
11、毒核核酸酸合合成。(成。(细胞室:细胞室:用于空气,操作台表面等用于空气,操作台表面等)n湿湿热热(高高压压蒸蒸气气灭灭菌菌法法):121,20min,破破坏坏微微生生物物孢孢子子、蛋蛋白白变变性性。(用用于于大大量量液液体体、玻玻璃璃器器皿皿、部部分分塑塑料料耗耗材材、手术器械等,由工作人员操作)手术器械等,由工作人员操作)n干干热热:160,2小时,高热作用下的氧化作用破坏微生物(耐高温的玻璃和金属制品)n过滤过滤(gul):0.22m滤膜过滤除菌(少量试剂)第二十一页,共五十五页。细胞培养技术消毒灭菌消毒灭菌(mi jn)(mi jn)方法方法o化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法n75%酒精o
12、主要用于操作者的皮肤,操作台表面及无菌室内的壁面处理(蛋白凝固)(不能擦拭有机玻璃(yujbl))n1新洁尔灭o主要用于器械的浸泡,皮肤和操作室壁面的擦试消毒(阳离子表面活性剂,能破坏细胞膜,改变其通透性而起杀菌作用)第二十二页,共五十五页。细胞培养技术o需要清洗的物品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。o清洗的步骤o灭菌的方法:-紫外线(超净台、生物安全柜)-高压蒸汽灭菌(准备好放在准备室502)-75%酒精(表面(biomin)消毒,小心酒精灯明火)小结小结(xioji)三清洗及灭菌三清洗及灭菌第二十三页,共五十五页。细胞培养技术四细胞培养四细胞培养o生长类型(lixng)o细胞来源o细胞
13、复苏 o细胞传代o细胞冻存o细胞计数(j sh)o活力测定o污染种类第二十四页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)(xbo)的生长类型的生长类型 n 粘粘附附型型细细胞胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。(绝大多数正常细胞及实体瘤细胞)n 悬悬浮浮型型细细胞胞:不必(bb)附着于固相支持物表面,而在悬浮状态下即可生长的细胞。(主要是白血病细胞等)小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(xbo)第二十五页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)(xbo)贴壁过程贴壁过程第二十六页,共五十五页。细胞培养技术每代贴壁细胞的生长每代贴壁细胞的生长(shngzhng)过程过程o游离期游离期(接种
14、后在培养液中呈悬浮状态(接种后在培养液中呈悬浮状态(zhungti),细胞质回缩,细,细胞质回缩,细胞体圆球形)胞体圆球形)o贴壁期贴壁期(细胞平均在(细胞平均在10分钟分钟4小时贴壁小时贴壁,底物:胶原、玻璃、塑,底物:胶原、玻璃、塑料、其它细胞等)料、其它细胞等)o潜伏期潜伏期(有生长活动,而无细胞分裂,一般为(有生长活动,而无细胞分裂,一般为624小时小时o对数生长期对数生长期(细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳。(细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳。 最适合进行实验研究最适合进行实验研究)o停止期(平台期)(停止期(平台期)(细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂。机细胞长满瓶壁后,细
15、胞虽有活力但不再分裂。机制:接触抑制、密度依赖性)制:接触抑制、密度依赖性)(悬浮细胞没有贴壁过程)(悬浮细胞没有贴壁过程)第二十七页,共五十五页。细胞培养技术o国内可以买到细胞株的地方有哪些?国内可以买到细胞株的地方有哪些?oATCC(美国模式培养物集存库)国内代理oECACC(欧洲细胞株、微生物保藏中心)国内代理、sigmao中国科学院细胞研究所o中国医学科学院(协和(xih)医科大学)基础医学部o武汉大学冷藏中心等细胞细胞(xbo)来源来源第二十八页,共五十五页。细胞培养技术 o确定细胞株的培养确定细胞株的培养(piyng)信息(信息(ATCC)o配制培养基(基础培养基配制培养基(基础培
16、养基+10%胎牛血清胎牛血清+双抗)、双抗)、胰酶、胰酶、PBSo无菌培养瓶、吸管、离心管的准备无菌培养瓶、吸管、离心管的准备准备准备(zhnbi)工作工作第二十九页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)复苏(快融)复苏(快融)(l)从液氮中取出冷冻管,迅速投入37水浴中,使其融化(1分钟左右)。并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染(wrn)情形。(2)用培养液稀释后低速离心10分钟。(3)去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。(4)隔天换液,但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成(xngchng)大冰晶而损伤细胞。第三十页,共五十五页。细胞培养技术细
17、胞细胞(xbo)传代传代 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去(xi q)的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。第三十一页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)传代传代1 悬浮细胞悬浮细胞(xbo)传代传代o离离心心法法传传代代:离心(1000转/分)去上清,沉淀物加新培养液后再混匀传代。o直直接接传传代代法法:悬浮细胞沉淀在瓶底时,将上清培养液去除l2一23,然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半贴壁细胞传代半贴壁细胞传代(Hela细胞)o此类细胞部分呈现贴壁
18、生长现象,但贴壁不牢,可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来,进行传代。离心新鲜培养基悬浮铺板第三十二页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)传代传代 3 贴壁细胞传代贴壁细胞传代o采用酶消化法传代。常用的0.25的胰酶。吸掉上清,加入(jir)PBS缓冲液洗涤,弃掉洗液,加入适量胰酶消化液,37消化1分钟左右,加入含血清的培养基终止消化,并离心去上清,重新稀释后接种。注意:开放式操作,小心谨慎、谨防污染!开放式操作,小心谨慎、谨防污染!第三十三页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)冻存(慢冻)冻存(慢冻)1 细胞冻存液(细胞冻存液(1ml/管)管)o基础培养基70o胎牛血清20oD
19、MSO10(二甲基亚砜,一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶对细胞的损伤(snshng)。)2 细胞欲冷冻保存时,细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?o冷冻管内细胞数目一般为1-8x106cells/ml缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致(bzh)产生大的冰晶。第三十四页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)冻存冻存3 慢冻程序慢冻程序o传统方法:410分钟-2030分钟-801618小时(或过夜)液氮长期保存。o程序降温盒:利用异丙醇
20、实现梯度降温(易挥发,并且易吸收空气中的水分(shufn),冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温,每十分钟降一度)。第三十五页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)冻存冻存第三十六页,共五十五页。细胞培养技术小结小结(xioji)四四 细胞培养过程细胞培养过程o细胞生长类型及传代方法(fngf)o细胞培养过程培养过程o注意无菌操作无菌操作(全程)准备工作准备工作准备工作准备工作复苏(快)复苏(快)复苏(快)复苏(快)传代(无菌)传代(无菌)传代(无菌)传代(无菌)冻存(慢)冻存(慢)冻存(慢)冻存(慢)实验实验 细胞信息细胞信息(xnx)、 方法方法 冻存液成分、冻存液成分、 培养基、耗材培养
21、基、耗材 程序程序第三十七页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)计数计数o血细胞计数器:手工血细胞计数器:手工(shugng)计数细胞计数细胞第三十八页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)计数计数计算公式:细胞(xbo)数/ml4大格细胞总数/4稀释倍数104第三十九页,共五十五页。细胞培养技术细胞细胞(xbo)计数计数注意事项注意事项o记上不记下,记左不记右。o吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡。o镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散(fnsn)不好,需重新制备细胞悬液。第四十页,共五十五
22、页。细胞培养技术培养细胞培养细胞(xbo)活力测定活力测定o细胞活力测定是体外实验研究(ynji)中应用最广的技术手段之一。o任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成,从形态上区别死、活细胞是困难的。第四十一页,共五十五页。细胞培养技术培养培养(piyng)细胞活力测定细胞活力测定1 细胞克隆形成率实验细胞克隆形成率实验(shyn)单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。o克隆形成率(克隆形成数接种细胞数)100%o优点:精确、可靠,适于贴壁细胞第四十二页,共五十五页。细胞培养技术培养细胞培养细胞(xbo)活力测定活力测定2
23、台盼蓝法(台盼蓝法(0.4%)o细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色(zhus)。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故活细胞不被染色,死细胞染成蓝色。o用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活性。第四十三页,共五十五页。细胞培养技术培养细胞活力培养细胞活力(hul)测定测定3 四唑盐(四唑盐(MTT)比色法)比色法o四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝。o原理:活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标
24、仪测定OD值。oMTT法简单快速、准确,广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤(zhngli)放射敏感性实验等。第四十四页,共五十五页。细胞培养技术细胞培养的污染细胞培养的污染(wrn)(wrn)类型类型 o细菌细菌(xjn)(xjn)污染污染o真菌污染真菌污染o支原体污染支原体污染o病毒污染病毒污染o非同种细胞污染非同种细胞污染o化学污染化学污染第四十五页,共五十五页。细胞培养技术细菌(xjn)污染小鼠胃癌(wi i)细胞的球菌感染 第四十六页,共五十五页。细胞培养技术念珠菌污染(wrn)真菌(zhnjn)污染丝状菌污染(wrn)第四十七页,共五十五页。细胞培养技术真菌(zhnjn)污染典型
25、的霉菌污染,肉眼(ruyn)看到白色的团块或白点,镜下呈丝状。400倍图片第四十八页,共五十五页。细胞培养技术支原体污染(wrn)支原体污染(wrn)电镜照片(X30k),煎蛋状和其他形状第四十九页,共五十五页。细胞培养技术 细菌和真菌污染多发生在传代、换液、加样等细菌和真菌污染多发生在传代、换液、加样等开放性操作开放性操作之后。之后。原代操作原代操作尤其注意!因此,细胞培养切记:尤其注意!因此,细胞培养切记: “无菌无菌”理念贯穿始终理念贯穿始终(shzhng),包括:器皿、器械、耗材、培养基、,包括:器皿、器械、耗材、培养基、试剂、操作习惯。(试剂、操作习惯。(一旦污染、立即弃用!一旦污染
26、、立即弃用!) 如何避免如何避免(bmin)污染?污染?细节决定成败细节决定成败(chngbi)!第五十页,共五十五页。细胞培养技术小结五小结五 实验实验(shyn)方法方法o细胞计数的方法o细胞活力测定的方法分类、原理及应用o注意防止(fngzh)细胞污染第五十一页,共五十五页。细胞培养技术总结总结(zngji)o细胞实验所需设备的类型及功能细胞实验所需设备的类型及功能o试剂及耗材的分类及各自用途试剂及耗材的分类及各自用途o清洗物品的过程及灭菌的方法清洗物品的过程及灭菌的方法o细胞培养细胞培养o细胞生长过程,细胞来源o细胞培养过程(复苏、传代(chun di)及冻存)o细胞计数及活力测定方法
27、o注意无菌操作,防止细胞污染注意无菌操作,防止细胞污染 第五十二页,共五十五页。细胞培养技术实验中心实验中心(zhngxn)细胞培养室规章制度细胞培养室规章制度o细胞实验室是进行各种细胞培养的净化实验室,研究人员经申请准入、培训合格后方可进入细胞室;所有人员必须遵守实验室规章制度,接受工作人员的管理。o进入细胞室前必须穿工作服、换鞋,非实验物品不得带入室内。严禁带入易燃、易爆及其他有毒、有害或有刺激气味的物品。注意消防安全,杜绝一切可能导致火灾的行为。o不得在细胞室内进行病原性微生物等易传染物的操作;进行病毒感染细胞的操作须报管理人员备案,在指定的生物安全柜内(8室)进行,使用一次性耗材,并遵
28、守生物安全操作规范。o实验室公用物品在使用后必须放回原处,不得外借或带到其它实验室;不得擅自更改仪器程序;仪器发生(fshng)异常时,应立即向管理人员报告。若因不按操作规程使用造成仪器损坏,使用者应酌情赔偿。o配制试剂应数量适当,标注规范,按规定妥善存放。无菌试剂专人专用,防止交叉污染。未经允许,不得使用他人物品及翻看他人细胞。o若发现细胞被污染,应立即弃用,禁止继续培养和冻存。进入细胞实验室的所有新细胞株,由管理人员建立细胞株库。其他细胞的冻存,由实验者标记明确后存入指定位置。o实验结束后,应及时清理桌面和地面,整理实验器材。观察培养箱,待温度及CO2浓度正常后方可离开。废弃物品应及时带出
29、操作间,进行相应处理。o遵守生物垃圾、利器和生活垃圾分类存放规定,禁止向水槽内倒入杂物、腐蚀性液体和有毒试剂等。第五十三页,共五十五页。细胞培养技术THANKS!第五十四页,共五十五页。细胞培养技术内容(nirng)总结细胞培养技术。CO2培养箱设定的条件为37,5CO2。PBS:磷酸缓冲盐溶液具有pH缓冲作用的等渗盐溶液(常规实验皆可用)。复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。离心法传代:离心(1000转/分)去上清,沉淀物加新培养液后再混匀传代。记上不记下,记左不记右。克隆形成率(克隆形成数接种细胞数)100%。实验室公用物品在使用后必须放回原处,不得(bude)外借或带到其它实验室。THANKS第五十五页,共五十五页。细胞培养技术