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1、第四讲第四讲 杂交瘤细胞和单克隆抗体技术杂交瘤细胞和单克隆抗体技术第一节、免疫的基本知识第一节、免疫的基本知识一、免疫系统：分非适应性免疫和适应性免疫两类。一、免疫系统：分非适应性免疫和适应性免疫两类。 1、非适应性免疫是由非特异性反应的细胞介导的。如：巨、非适应性免疫是由非特异性反应的细胞介导的。如：巨噬细胞的吞噬作用，泌细胞分泌的溶菌酶，以及中性细胞造噬细胞的吞噬作用，泌细胞分泌的溶菌酶，以及中性细胞造成的细胞裂解机制。成的细胞裂解机制。 2、适应性免疫：是针对特定分子，而且可经反复暴露于外、适应性免疫：是针对特定分子，而且可经反复暴露于外源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性
2、蛋源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性蛋白结合外源分子。这些分泌的蛋白称为抗体；可与抗体结合白结合外源分子。这些分泌的蛋白称为抗体；可与抗体结合的分子被称为抗原。当一个分子被用于诱导适应性反应时，的分子被称为抗原。当一个分子被用于诱导适应性反应时，这个分子就被叫做免疫原。这个分子就被叫做免疫原。13、免疫系统含有、免疫系统含有109以上淋巴细胞遍布全身，保证了它们在以上淋巴细胞遍布全身，保证了它们在任何部位都能迅速反应。淋巴细胞由骨髓中的原始干细胞不任何部位都能迅速反应。淋巴细胞由骨髓中的原始干细胞不断产生，经血液及淋巴系统循环，暂时停顿并积聚于称作淋断产生，经血液及淋巴系统循环
3、，暂时停顿并积聚于称作淋巴器官的特异化的结构中，在哺乳动物中就是淋巴结和肝脏。巴器官的特异化的结构中，在哺乳动物中就是淋巴结和肝脏。在免疫反应过程中，免疫原积聚于一个淋巴器官中，这个淋在免疫反应过程中，免疫原积聚于一个淋巴器官中，这个淋巴器官就变成了免疫反应的焦点。巴器官就变成了免疫反应的焦点。 B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体的修饰型，细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体的修饰型，功能相当于受体。功能相当于受体。 毒性毒性T细胞：携带结合抗原的细胞表面受体。细胞：携带结合抗原的细胞表面受体。 辅助辅助T细胞：在控制细胞：在控制B细胞和细胞毒性细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关细胞
4、反应方面起关键的调节作用。键的调节作用。2 体液介导的适应性免疫反应：体液反应引发产生可结合外体液介导的适应性免疫反应：体液反应引发产生可结合外来抗原的循环抗体，由来抗原的循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞淋巴细胞介导是抗体技术的基础。介导是抗体技术的基础。 细胞介导的适应性免疫反应：毒性细胞介导的适应性免疫反应：毒性T淋巴细胞结合于外来淋巴细胞结合于外来或感染的细胞，随后将这些细胞裂解，辅助或感染的细胞，随后将这些细胞裂解，辅助T细胞参与该反细胞参与该反应。应。二、免疫系统能特异性地对无数种分子反应。二、免疫系统能特异性地对无数种分子反应。 免疫系统持续地受无数
5、抗原刺激。免疫系统的一个主要形免疫系统持续地受无数抗原刺激。免疫系统的一个主要形式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗原结合位点的抗体和原结合位点的抗体和T细胞受体与外来分子的结合提供了免细胞受体与外来分子的结合提供了免疫反应特异性的基础。疫反应特异性的基础。3三、个别淋巴细胞识别个别抗原三、个别淋巴细胞识别个别抗原一一个个细细胞胞识识别别一一个个抗抗原原，因因为为单单一一淋淋巴巴细细胞胞上上的的所所有有抗抗原受体是相同的。原受体是相同的。在在成成熟熟淋淋巴巴细细胞胞表表面面的的所所有有受受体体都都是是糖糖蛋蛋白白，体体细细胞胞
6、基基因因重重组组、突突变变及及基基因因转转录录后后加加工工等等使使受受体体产产生生107个个以以上上的的结结合合位位点点。抗抗原原特特异异性性通通过过确确保保只只有有一一个个类类型型的的受受体体在在一一个细胞内被合成的过程来维持。个细胞内被合成的过程来维持。虽虽然然B细细胞胞表表面面抗抗体体和和T细细胞胞表表面面受受体体都都具具有有类类似似的的结结构构，但但它它们们是是由由不不同同的的基基因因家家族族编编码码的的，其其表表达达具具有有细细胞胞型型的的特特异异性性。B细细胞胞上上的的表表面面抗抗体体能能结结合合可可溶溶性性抗抗原原，而而T细细胞胞受体仅仅识别在其它细胞表面展示的抗原受体仅仅识别在
7、其它细胞表面展示的抗原4四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇 免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免疫记忆可以延续动物终生。疫记忆可以延续动物终生。六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的 一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合抗原时，抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急淋巴细胞就被
8、活化，分泌抗体被刺激而增殖（急剧分裂克隆）。剧分裂克隆）。七、一个有效免疫系统的成熟是由广泛的细胞间信息交换来七、一个有效免疫系统的成熟是由广泛的细胞间信息交换来调节的。调节的。5第二节、抗体分子第二节、抗体分子抗抗体体是是具具有有共共同同结结构构和和功功能能形形式式的的一一大大类类糖糖蛋蛋白白。抗抗体体分分成五类：成五类：IgG、IgM、IgA、IgE和和IgD（见表（见表2-1）。）。一、一、IgG类抗体有两个相同的抗原结合位点类抗体有两个相同的抗原结合位点含含有有抗抗原原结结合合位位点点的的两两个个区区域域被被称称作作Fab片片段段，涉涉及及到到免免疫疫调调节节的的蛋蛋白白区区称称作作F
9、c片片段段，在在Fab和和Fc片片段段之之间间的的部部分分称称作铰链区。作铰链区。重链分子量为重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为；轻链分子量为2.5kDlt。二、不同类型抗体的区别二、不同类型抗体的区别IgG、IgM、IgA、IgE和和IgD因因重重链链形形式式不不同同而而有有所所区区别别。它们的重链分别称作它们的重链分别称作、和和。重重链链的的不不同同使使这这些些蛋蛋白白具具有有不不同同形形式式的的免免疫疫功功能能，并并且且在在完完成成反反应应成成熟熟的的不不同同阶阶段段发发挥挥作作用用。这这些些差差异异主主要要是是由由于于Fc片段上的蛋白序列不同所致。片段上的蛋白序列不同所致。轻链只
10、有两种：轻链只有两种：、。 6三、抗体轻链的分子结构三、抗体轻链的分子结构比比较较轻轻链链的的氨氨基基酸酸结结构构发发现现，轻轻链链有有一一个个恒恒定定区区和和一一个个可可变变区区。轻轻链链由由220个个氨氨基基酸酸组组成成，分分为为两两个个区区，每每个个区区由由大大约约110个个氨氨基基酸酸组组成成。-NH2末末端端那那半半部部分分是是异异源源性性的的，称称为为可变区（可变区（V）；羧基末端那部分称为恒定区（）；羧基末端那部分称为恒定区（C）。）。恒恒定定区区有有两两种种类类型型：一一种种是是决决定定轻轻链链的的，另另一一种种是是决决定定轻轻链链的的。轻轻链链基基因因位位于于第第6染染色色体
11、体上上，而而轻轻链链的的基基因因则则位位于第于第16染色体上。染色体上。四、抗体重链的分子结构四、抗体重链的分子结构重重链链的的序序列列也也存存在在可可变变区区和和恒恒定定区区（图图2-1）。IgG重重链链含含有有一一个个可可变变区区和和三三个个恒恒定定区区，每每区区含含110个个氨氨基基酸酸，其其它它重重链含有附加的恒定区。链含有附加的恒定区。IgG重链序列也显示重链序列也显示链有四种亚类，即：链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、IgG2b和和IgG3。鼠重链多肽编码区在第。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。染色体上。 789五、重链和轻链的可变区形成抗原结合位点五、重链和轻链的可变区形
12、成抗原结合位点一一个个重重链链的的可可变变区区和和一一个个轻轻链链的的可可变变区区结结合合形形成成一一个个抗抗原原结结合合位位点点。可可变变区区的的异异质质性性提提供供了了动动物物有有效效进进行行免免疫疫反反应应所所需需的的无无数数结结合合位位点点的的基基础础。序序列列异异质质性性并并不不是是由由整整个个可可变变区区的的每每一一部部分分决决定定的的，而而是是集集中中在在与与抗抗原原接接触触的的位位点点上上。多多数数可可变变性性决决定定于于每每一一个个链链的的三三个个短短区区，它它们们形形成成轻轻链链的的三三个个超超变变区区和和重重链链的的三三个个超超变变区区。这这些些超超变变区区形形成成抗抗原
13、原抗抗体体结结合合的的接接触触残残基基的的主主体体，同同时时这这些些超超变变区区位位于于扩扩展展进进入入抗抗原原反反应应区区的的短短环环上上。由由于于它它们们是是实实际际的的抗抗原原结结合合位位点点，故故被被认认为为是是互互补决定区。补决定区。六六、功功能能性性、轻轻链链和和重重链链基基因因的的一一个个明明显显特特征征是是在在所所有有细细胞胞中中这这些些基基因因转转录录后后的的选选择择性性剪剪接接是是不不同同的的（见见图图2）。200个个V区，区，4个功能性个功能性J区。区。七七、形形成成轻轻链链pre-mRNA外外显显子子也也要要重重排排（图图3）。V-J-C-J-C。八八、形形成成功功能能
14、性性重重链链基基因因需需要要pre-mRNA外外显显子子的的重重排排（图（图4）。）。50100种可变区，种可变区，12个个D区，区，4个个J区。区。101112131415九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。十十、等等位位基基因因排排斥斥确确保保在在任任一一B细细胞胞中中只只有有重重新新排排列列的的一一个个轻轻链链和和一一个个重重链链被被表表达达。产产生生不不同同重重链链和和轻轻链链的的基基因因重重组组不不总总是是产产生生一一个个功功能能基基因因，在在B细细胞胞分分化化过过程程中中，轻轻链链重重排排开开始始于于区区内内。然然后后，若
15、若二二倍倍体体基基因因中中的的一一个个首首先先重重排排，产产生生一一个个功功能能性性等等位位基基因因，另另一一个个拷拷贝贝则则进进行行重重组组。若若二二个个重重组组都都产产生生非非功功能能性性等等位位基基因因，那那么么重重组组就就要要位位点点开开始始，以以同同样样的的机机制制产产生生功功能能性性重重链链。一一旦旦重重组组产产生生一一个个功功能能性性抗抗体体，一一个个未未知知的的机机制制就就制制止止进进一一步步重重组组。将将抗抗原原性性结结合合位位点点固固定定，直直到到细细胞胞死死亡亡。这这个个机机制制叫叫等等位位基基因因排排斥斥。它它可可以以解解释释为为什什么么B淋淋巴巴细细胞胞分分泌泌的的只
16、只有有一一种种抗抗原原结结合合位位点点的的抗抗体体和和抗抗体体只只有一种类型的轻链。有一种类型的轻链。十一、其它：重组被用于生产各种类和亚类的抗体。十一、其它：重组被用于生产各种类和亚类的抗体。 16淋巴细胞杂交瘤淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体技术与单克隆抗体技术 1960年，法国的年，法国的Barski等首先发现，两种不同类型的细胞等首先发现，两种不同类型的细胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。与此同时，在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。与此同时，日本的日本的Okada也发现紫外线灭活的仙台病毒也发现紫外线灭活的仙台病毒(Sandai virus)可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合，
17、在此基础上用灭活的可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合，在此基础上用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。 1976年年Kohler和和Milstein创建了一个方法，他们将分泌一创建了一个方法，他们将分泌一种特异性抗体的种特异性抗体的B细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合，产细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合，产生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常B细胞和浆细胞瘤细胞和浆细胞瘤细胞的免疫球蛋白基因，同时也具有在体外无限增殖的能细胞的免疫球蛋白基因，同时也具有在体外无限增殖的能力。为此创造了杂交瘤力。为此创造了杂交瘤(hy
18、bridoma)这个名词，以描述一个这个名词，以描述一个正常抗体生成细胞和一个浆细胞瘤细胞的融合产物。由于正常抗体生成细胞和一个浆细胞瘤细胞的融合产物。由于他们的重要科学贡献，他们的重要科学贡献，Kohler和和Milstein在在1984年荣获了诺年荣获了诺贝尔医学生理奖。贝尔医学生理奖。 1718一、免疫原性一、免疫原性 许多外源分子、病毒或细胞单纯注射在实验动物体内能许多外源分子、病毒或细胞单纯注射在实验动物体内能引起强的抗体反应，而一些物质却不能，对于这些情况，引起强的抗体反应，而一些物质却不能，对于这些情况，常可通过修饰抗原或改变宿主而使免疫系统反应增加。常可通过修饰抗原或改变宿主而
19、使免疫系统反应增加。 好的免疫原分子必须具备以下条件：好的免疫原分子必须具备以下条件： 1、抗原结合于原始、抗原结合于原始B细胞表面抗体分子对于抗体反应是细胞表面抗体分子对于抗体反应是绝对必要的。这个结合决定了产生抗体的特异性。因为表绝对必要的。这个结合决定了产生抗体的特异性。因为表面抗体分子上的抗原决定位点与分泌抗体的结合位点是一面抗体分子上的抗原决定位点与分泌抗体的结合位点是一致的。致的。 2、它必须能促进、它必须能促进B细胞与辅助细胞与辅助T细胞间的信息交换。这细胞间的信息交换。这要求在两个细胞间有物理连接。即有一个位点被要求在两个细胞间有物理连接。即有一个位点被II级蛋白级蛋白及及T细
20、胞受体所识别。细胞受体所识别。 3、通常它必须可被降解。、通常它必须可被降解。19二、抗原来源二、抗原来源 开始一个免疫程序之前，对制备抗原的考虑主要于抗原开始一个免疫程序之前，对制备抗原的考虑主要于抗原所需的剂量和纯度。这应基于预计产生抗体的用途。如果所需的剂量和纯度。这应基于预计产生抗体的用途。如果仅仅需要识别相应抗原的高特异性抗体，那么抗原必须要仅仅需要识别相应抗原的高特异性抗体，那么抗原必须要相当纯，或抗原制备物用于制备单克隆抗体。相当纯，或抗原制备物用于制备单克隆抗体。 1、纯抗原、纯抗原 2、从聚丙烯酰胺凝胶中纯化抗原。、从聚丙烯酰胺凝胶中纯化抗原。 3、半抗原：半抗原若被偶联于大
21、的蛋白分子上就能被、半抗原：半抗原若被偶联于大的蛋白分子上就能被用于诱发抗体。半抗原起抗原决定簇作用，与用于诱发抗体。半抗原起抗原决定簇作用，与B细胞表面细胞表面抗体结合，载体提供抗体结合，载体提供II级级T细胞受体结合位点。总之，半细胞受体结合位点。总之，半抗原应被偶联于可溶性载体上，如抗原应被偶联于可溶性载体上，如BSA。 4、合成多肽也要连接到载体上。、合成多肽也要连接到载体上。20三、动物免疫三、动物免疫1、动物选择、动物选择 Balb/c小鼠，小鼠，68周龄；兔子生后约周龄；兔子生后约12周。周。 动物数：小鼠动物数：小鼠46只；兔子只；兔子24只。只。2、佐剂、佐剂 免疫反应的非特
22、异性刺激物叫做佐剂，诱导对可溶性抗原免疫反应的非特异性刺激物叫做佐剂，诱导对可溶性抗原的抗体反应必须使用佐剂。但对颗粒性抗原或全细胞抗原则的抗体反应必须使用佐剂。但对颗粒性抗原或全细胞抗原则不是必须的。不是必须的。 佐剂包含两种因素：一是佐剂是储备性物质以防止抗原迅佐剂包含两种因素：一是佐剂是储备性物质以防止抗原迅速代谢；二是佐剂必须是可以非特异性地刺激免疫反应的物速代谢；二是佐剂必须是可以非特异性地刺激免疫反应的物质。实验时一般是将水溶液注入到佐剂中。质。实验时一般是将水溶液注入到佐剂中。3、抗原剂量、抗原剂量 对于兔，若有大量可溶的纯抗原可用，一般认为每次免疫对于兔，若有大量可溶的纯抗原可
23、用，一般认为每次免疫于佐剂中有于佐剂中有0.51.0mg剂量是可取的；对于小鼠来讲，剂量剂量是可取的；对于小鼠来讲，剂量则降则降10倍，为倍，为50100g。214、抗原的形式、抗原的形式5、注射途径：需考虑三个问题。、注射途径：需考虑三个问题。 1）要注射多大剂量；）要注射多大剂量； 2）与免疫原同注的是什么缓冲液，还有其它什么成分；）与免疫原同注的是什么缓冲液，还有其它什么成分； 3）免疫原释放入淋巴系统及循环系统的速度如何？）免疫原释放入淋巴系统及循环系统的速度如何？ 对于兔，大体积注射常采用皮下多点注射。对于兔，大体积注射常采用皮下多点注射。 对于鼠，大体积注射常采用腹腔注射，若需缓慢
24、释放则对于鼠，大体积注射常采用腹腔注射，若需缓慢释放则采用肌注或皮下注射，若需立即释放宜采用静脉注射。采用肌注或皮下注射，若需立即释放宜采用静脉注射。 对于鼠来说，第二次和第三次免疫应间隔至少对于鼠来说，第二次和第三次免疫应间隔至少3周。周。 对于兔来说，每对于兔来说，每36周注射一次。周注射一次。 超免疫化动物血清主要含超免疫化动物血清主要含IgG抗体。其实质部分为特异性抗体。其实质部分为特异性抗体。抗原特异的抗体。抗原特异的IgG水平可达水平可达1mg/ml，这几乎等于血清中，这几乎等于血清中总总IgG水平的水平的10%。22DNA合成合成 氨基酸、氨基酸、核苷酸库核苷酸库 dGTP、dT
25、TP次黄嘌呤次黄嘌呤H H 肌苷酸肌苷酸 胸腺嘧胸腺嘧啶核苷啶核苷T T脱氧核苷酸脱氧核苷酸次黄嘌呤磷酸核糖次黄嘌呤磷酸核糖转移酶转移酶(HGPRT) 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷激酶激酶（TK）氨基氨基蝶呤蝶呤A A23 杂种细胞的筛选：细胞融合带有一定的随机性，杂种细胞的筛选：细胞融合带有一定的随机性，除不同亲本细胞间的融合外，还伴有各亲本细胞的除不同亲本细胞间的融合外，还伴有各亲本细胞的自身融合。因此，在紧随细胞融合之后，必须设法自身融合。因此，在紧随细胞融合之后，必须设法把含有两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出把含有两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出来。最简便的办法无疑是应用选择培
26、养基，使亲本来。最简便的办法无疑是应用选择培养基，使亲本细胞死亡，而仅让杂种细胞存活下来。为此，已先细胞死亡，而仅让杂种细胞存活下来。为此，已先后利用亲本细胞的药物抗性、营养缺陷型和温度敏后利用亲本细胞的药物抗性、营养缺陷型和温度敏感性等遗传标记，建立了多种选择系统，并已成功感性等遗传标记，建立了多种选择系统，并已成功地用于杂种细胞的筛选。地用于杂种细胞的筛选。 24由抗药性细胞组成的杂种的筛选：由抗药性细胞组成的杂种的筛选： Szybslski等（等（1962）在研究抗药性时发现，抗嘌）在研究抗药性时发现，抗嘌呤类似物呤类似物8-氮鸟嘌呤或氮鸟嘌呤或6-巯基鸟嘌呤突变型细胞缺乏巯基鸟嘌呤突变
27、型细胞缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），而抗嘧啶类），而抗嘧啶类似物似物5-溴脱氧尿嘧啶突变型细胞缺乏胸腺嘧啶核苷激溴脱氧尿嘧啶突变型细胞缺乏胸腺嘧啶核苷激酶酶TK），它们均可为），它们均可为HAT培养基所杀死。在此基培养基所杀死。在此基础上，础上，Littlefield（1964）进一步应用）进一步应用HAT培养基来培养基来筛选筛选HGPRT细胞与细胞与TK细胞的余种细胞，获得成细胞的余种细胞，获得成功。从此，根据抗药性这一遗传标记设计选择系统功。从此，根据抗药性这一遗传标记设计选择系统即日益增多，而发展成为迄今使用最为普遍的一种即日益增多，而发展成为迄今使用
28、最为普遍的一种筛选方法。其代表性的选择系统有下列几种。筛选方法。其代表性的选择系统有下列几种。 25HAT选择培养基：选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄培养基是指在细胞培养基中加有次黄嘌呤（嘌呤（H）、氨基喋呤（）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核）和胸腺嘧啶核苷（苷（T）的培养基。细胞为合成）的培养基。细胞为合成DNA所需要的嘌呤和嘧啶，可所需要的嘌呤和嘧啶，可由两条途径获得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸由两条途径获得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸（PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧），进而转变
29、为脱氧鸟苷三磷酸（鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧）合成脱氧胸苷酸（胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这）。这一合成途径，可为加入的会抑制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基的一合成途径，可为加入的会抑制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基的二氢叶酸还原酶的叶酸类似物二氢叶酸还原酶的叶酸类似物A所阻断。此时，只有所阻断。此时，只有HGPRT+和和TK+细胞才能通过另一条应急途径，利用外加的核苷酸的细胞才能通过另一条应急途径，利用外加的核苷酸的“前体前体”H来合成来合成IMP和利用和利用T来合成来合成dTMP，而得以有活下来。，而得以有活下来。相反，相反，HGPRT和和TK细胞则将因无法利用细胞则将因无法利用H和和T来合成来合成DNA而死亡。因此，在而死亡。因此，在HGPRT和和TK细胞融合后，应用细胞融合后，应用HAT培培养基即可将通过基因互补而同时获得养基即可将通过基因互补而同时获得HGPRT和和TK酶的杂种细酶的杂种细胞筛选出来。胞筛选出来。 26
