蛋白质电泳与操作

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1、蛋白质电泳与操作蛋白质电泳与操作QuestionsQuestions： 什么是氨基酸？什么是氨基酸？ 氨基酸有何结构特点？氨基酸有何结构特点？ 什么是肽？什么是肽？ 肽是如何形成的？肽是如何形成的？ 形成肽的化学键是什么？形成肽的化学键是什么？ 什么是蛋白质？什么是蛋白质？ 蛋白质的结构特点是什么？蛋白质的结构特点是什么？蛋白质特性 氨基酸（氨基酸（amino acidamino acid） 含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。是蛋白质的基本组成单位。物。是蛋白质的基本组成单位。 氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质 氨氨基基酸酸在在水水溶溶液液或或

2、结结晶晶内内基基本本上上均均以以兼兼性性离离子子或偶极离子的形式存在。或偶极离子的形式存在。 兼兼性性离离子子：又又称称为为两两性性离离子子是是指指在在同同一一个个氨氨基基酸酸分分子子上上带带有有能能释释放放出出质质子子的的NH3+NH3+正正离离子子和和能能接接受受质质子子的的COO-COO-负负离离子子，因因此此氨氨基基酸酸是是两两性性电电解质。解质。 氨氨基基酸酸的的等等电电点点：氨氨基基酸酸的的带带电电状状况况取取决决于于所所处处环环境境的的PHPH值值，改改变变PHPH值值可可以以使使氨氨基基酸酸带带正正电电荷荷或或负负电电荷荷，也也可可使使它它处处于于正正负负电电荷荷数数相相等等，

3、即即净净电电荷荷为为零零的的两两性性离离子子状状态态。使使氨氨基基酸酸所所带带正正负负电电荷荷数数相相等等即即净净电电荷荷为为零零时时的的溶溶液液pHpH值值称称为该氨基酸的等电点为该氨基酸的等电点（isoelectric pointisoelectric point）。）。 多肽多肽（polypeptidepolypeptide） 一一个个氨氨基基酸酸的的羟羟基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的羧羧基基脱脱水水缩缩合合形形成成肽肽键键（peptide peptide bondbond）。）。 通通常常由由10-10010-100个个氨氨基基酸酸分分子子脱脱水水缩缩合合而而成成的的化化合合物物

4、叫叫多多多多肽肽肽肽，它它们们的的分分子子量量低低于于10,000Da10,000Da（DaltonDalton）. .也也有有文文献献把把由由2-102-10个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为寡寡肽肽（小小分分子子肽肽）；10-5010-50个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为多多肽肽；由由5050个个以以上上的的氨氨基基酸酸组成的肽就称为蛋白质。组成的肽就称为蛋白质。 蛋白质特性蛋白质特性蛋白质结构蛋白质结构一级结构一级结构（primary structureprimary structure）氨基酸之间以肽键形成的肽链中氨氨基酸之间以肽键形成的肽链中氨基酸的排列顺序。基酸的排列

5、顺序。二级结构二级结构（secondary structuresecondary structure）蛋白质分子中多肽链沿一定方向盘蛋白质分子中多肽链沿一定方向盘绕和折叠的方式。绕和折叠的方式。 三级结构三级结构（tertiary structuretertiary structure） 蛋白质的二级结构基础上借助各种蛋白质的二级结构基础上借助各种次级键卷曲折叠成特定的球状分子次级键卷曲折叠成特定的球状分子结构的空间构象。结构的空间构象。 四级结构四级结构（quaternary structurequaternary structure ）多亚基蛋白质分子中各个具有三级多亚基蛋白质分子中各个具

6、有三级结构的多肽链，以适当的方式聚合结构的多肽链，以适当的方式聚合所形成的蛋白质的三维结构。所形成的蛋白质的三维结构。关于电泳关于电泳 电泳（电泳（ElectrophoresisElectrophoresis）：）：是指带是指带电荷的粒子或分子在电场中移动电荷的粒子或分子在电场中移动的现象。的现象。 电泳技术：电泳技术：利用带电粒子或者分利用带电粒子或者分子在电场中移动速度不同而达到子在电场中移动速度不同而达到对粒子或分子进行分离的技术。对粒子或分子进行分离的技术。电泳的相关参数电泳的相关参数 电荷：电荷：粒子或分子的电荷性质决定其在电场中的迁移方向。粒子或分子的电荷性质决定其在电场中的迁移方

7、向。 分子大小：分子大小：分子大小决定了在特定电场强度下一定时间内分子大小决定了在特定电场强度下一定时间内分子在介质中的迁移距离。分子在介质中的迁移距离。 电场强度：电场强度：电场强度决定了带电粒子或分子在电场中的迁电场强度决定了带电粒子或分子在电场中的迁移速度。移速度。 介质密度：介质密度：介质密度决定了特定分子在其中的迁移距离，介质密度决定了特定分子在其中的迁移距离，因此决定其对不同分子的分辨能力。因此决定其对不同分子的分辨能力。聚丙烯凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG） 丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵，TEMED等)

8、作用下形成的凝胶。凝胶孔径大小可以通过制备时所使用的浓度和交联度控制。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 利用聚丙烯酰胺形成的凝胶对大分子生物物质（如核酸、蛋白质）通过附加电场使分子不同的按照分子量大小在凝胶中得到分离。 蛋白质的聚丙烯凝胶电泳类型： 按蛋白质变性与否分为变性电泳和非变性电泳； 按凝胶浓度梯度分为不连续电泳与连续电泳； 按电泳的向性分为单向电泳与双向电泳。蛋白质变性电泳 蛋蛋白白质质变变性性：蛋蛋白白质质的的三三级级结结构构和和四四级级结结构构的的结结合合力力主主要要是是半半胱胱氨氨酸酸之之间间形形成成的的二二

9、硫硫键键（Disulfide Disulfide bondbond）。而而蛋蛋白白质质三三级级结结构构和和四四级级结结构构是是蛋蛋白白质质的的功功能能基基础础。蛋蛋白白质质变变性性就就是是使使二二硫硫键键打打开开，从从而而使使蛋蛋白白质质亚亚基基解解离离和和三三级级结结构构打打开开，使使蛋蛋白白质质失失去去生生物物活活性性，故故称称变变性性（denaturedenature）。）。 蛋蛋白白质质变变性性的的方方法法：9595加加热热5 5分分钟钟足足以以破破坏坏蛋蛋白白质质中中的的二二硫硫键键，但但是是当当温温度度降降至至常常温温后后，二二硫硫键键能能够够重重新新形形成成，这这个个过过程程称称

10、为为复复性性（renaturerenature）。为为了了使使变变性性后后的的蛋蛋白白不不再再复复性性通通常常使使用用-巯巯基基乙乙醇醇（2-Mercaptoethanol 2-Mercaptoethanol ）或或二二硫硫苏苏糖糖醇醇 （Dithiothreitol Dithiothreitol ，DTTDTT）保保护护自自由由的的半半胱胱氨氨酸酸巯巯基基。另另外外，为为了了避避免免复复性性，通通常常在在加加热热后后立立即即放放入入冰冰浴以减少蛋白质复性的机会。浴以减少蛋白质复性的机会。 蛋蛋白白质质变变性性电电泳泳的的方方法法：十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳

11、泳（ sodium sodium dodecyl dodecyl sulfate sulfate polyacrylamide polyacrylamide gel gel electrophoresiselectrophoresis， SDS-SDS-PAGEPAGE） SDS-PAGESDS-PAGE原理：原理： 蛋蛋白白质质在在凝凝胶胶中中的的迁迁移移率率主主要要取取决决于于分分子子大大小小、形状以及所带电荷多少。形状以及所带电荷多少。 SDSSDS是是一一种种阴阴离离子子表表面面活活性性剂剂，在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶系系统统中中，加加入入一一定定量量的的SDSSDS能能使使蛋蛋

12、白白质质的的氢氢键键和和疏疏水水键键打打开开，并并结结合合到到蛋蛋白白质质分分子子上上（达达到到饱饱和和的的状状态态下下，每每克克多多肽肽可可结结合合1.4g 1.4g SDSSDS），使使各各种种蛋蛋白白质质SDSSDS复复合合物物都都带带上上相相同同密密度度的的负负电电荷荷，其其数数量量远远远远超超过过了了蛋蛋白白质质分分子子原原有有的的电电荷荷量量，从从而而掩掩盖盖了了不不同同种种类类蛋蛋白白质质间间原原有有的的电电荷荷差差别别。此此时时，蛋蛋白白质质分分子子的的电电泳泳迁迁移移率率主主要要取取决决于于它它的的分分子子量量大大小小，而而其其它它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。因素

13、对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 当当分分子子量量在在15KD15KD到到200KD200KD之之间间时时，蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率 和和 分分 子子 量量 的的 对对 数数 呈呈 线线 性性 关关 系系 ， 符符 合合 公公 式式 ：logMW=K-bXlogMW=K-bX，式式中中：MWMW为为分分子子量量，X X为为迁迁移移率率，k k、b b均均为为常常数数，若若将将已已知知分分子子量量的的标标准准蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率对对分分子子量量对对数数作作图图，可可获获得得一一条条标标准准曲曲线线，未未知知蛋蛋白白质质在在相相同同条条件件下下进进行行电电泳泳，根根据据它它的的电电

14、泳泳迁迁移移率率即可在标准曲线上求得分子量。即可在标准曲线上求得分子量。SDS-PAGE操作程序蛋白质样品制备凝胶制备样品上样电泳凝胶染色电泳结果分析来自培养细胞的样品：来自培养细胞的样品：1.1.悬浮培养细胞：悬浮培养细胞：2.2. 细细胞胞清清洗洗：对对培培养养基基中中的的悬悬浮浮细细胞胞吹吹打打混混匀匀后后移移至至15mlV15mlV型型底底离离心心管管，台台式式冷冷冻冻离离心心机机1000rpm1000rpm（300G300G）4 4离离心心5min5min使使细细胞胞沉沉积积在在离离心心管管底底部部，弃弃去去培培养养液液。加加10ml10ml冰冰浴浴预预冷冷的的PBSPBS重重新新吹

15、吹打打混混匀匀细细胞胞后后1000rpm1000rpm（300G300G）离离心心5min5min，弃弃去去PBSPBS。重重复复此此步步骤骤三三次次。在在最最后后一一次次清清洗洗前前对对充充分分吹打混匀的细胞进行计数。吹打混匀的细胞进行计数。2.2.贴壁培养细胞：贴壁培养细胞：1.1. 细细胞胞消消化化：吸吸弃弃细细胞胞培培养养瓶瓶中中的的培培养养液液，并并用用适适量量预预冷冷PBSPBS漂漂洗洗一一次次，加加适适量量（足足以以覆覆盖盖细细胞胞）胰胰酶酶细细胞胞消消化化液液( (TrypsinTrypsin-EDTA -EDTA SolutionSolution，0.25% 0.25% Tr

16、ypsinTrypsin和和0.02% 0.02% EDTA EDTA ) )，室室温温消消化化1 15min5min。加加5ml5ml含含5%5%血血清清的的培培养养基基停停止止消消化化，吹吹打打使使细细胞胞成成为为单单细细胞胞悬悬液液。移移至至15ml 15ml V V型型底底离离心心管管，台台式式冷冷冻冻离离心心机机1000rpm1000rpm（300G300G）4 4离离心心5min5min使使细细胞胞沉沉积积在在离离心心管管底底部部，弃弃去去培培养液。执行细胞清洗程序（见上）养液。执行细胞清洗程序（见上）蛋白质样品制备蛋白质样品制备3.3.细细胞胞裂裂解解：按按照照每每10106 6

17、细细胞胞加加7575100100 l l细细胞胞裂裂解解液液（RIPARIPA，含含蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂），强强烈烈震震荡荡30s30s后后置置冰冰浴浴30min30min，期期间间每每5 5分分钟钟震震荡荡10s10s。台台式式冷冷冻冻高高速速离离心心机机12000 12000 rpmrpm，4 4离离心心5min5min。将将上上清清移移入入另另一一干干净净EppendorfEppendorf管管，样样品品可可立立即即保保存存于于-20 -20 。如如有有必必要要，取取5 5 l l上上清清，ddHddH2 2OO稀稀释释4X4X后后用用BradfordBradford法检测蛋白质含量

18、。法检测蛋白质含量。4.4.蛋白质变性蛋白质变性1.1. 根根据据需需要要取取一一定定量量裂裂解解细细胞胞样样品品，加加4X4X蛋蛋白白质质电电泳泳上上样样液液（含含5%5%巯巯基乙醇）使终浓度为基乙醇）使终浓度为1X1X，混匀。，混匀。95 95 加热加热5min5min，立即置冰上，等待电泳。，立即置冰上，等待电泳。1.1.试剂：试剂：2.2. ddHddH2 2OO 30%Acr-Bis(29:1)30%Acr-Bis(29:1) 10X 10X Tris/Glycine/SDSTris/Glycine/SDS buffer, pH8.8 buffer, pH8.8 10X 10X Tr

19、is/Glycine/SDSTris/Glycine/SDS buffer, pH6.8 buffer, pH6.8 10% 10%过硫酸铵（过硫酸铵（Ammonium Ammonium persulfatepersulfate ，APAP） TEMEDTEMED（TetramethylethylenediamineTetramethylethylenediamine，四甲基乙二胺），四甲基乙二胺） * *TEMEDTEMED可以催化可以催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。的聚合。2.2.装置：装置： 凝胶制备凝胶制备3.3.凝胶分离范围

20、：凝胶分离范围： SDS-PAGE分离分离胶浓度胶浓度最佳分离范最佳分离范 围围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kDSDS-PAGE凝胶的结构 浓缩胶（Stacking gel）： 浓缩胶通常为5%聚丙烯酰胺凝胶,目的是使蛋白质样品集聚。分离胶（Resolving gel）： 分离胶浓度为6%20%，能够是不同的蛋白质按分子量大小分离。加样孔（well）： 由加样梳形成的孔，相互之间有凝胶隔离，蛋白质样品加入孔内，并在电泳中互不干扰。每一个加样孔相对应的凝胶又称泳道。玻璃板（Glass plates）： 构成凝胶的模板。隔

21、条（spacer）: 垫于玻璃板之间，使两块玻璃板之间形成灌胶的空间。SDS-PAGE凝胶的工作原理 在在SDSSDSPAGEPAGE不不连连续续电电泳泳中中，制制胶胶缓缓冲冲液液使使用用的的是是TrisTrisHCLHCL缓缓冲冲系系统统，浓浓缩缩胶胶是是pH6.8pH6.8，分分离离胶胶pH8.8pH8.8；而而电电泳泳缓缓冲冲液液使使用用TrisTris甘氨酸缓冲系统。甘氨酸缓冲系统。 在在浓浓缩缩胶胶中中，其其pHpH环环境境呈呈弱弱酸酸性性，因因此此甘甘氨氨酸酸解解离离很很少少，其其在在电电场场的的作作用用下下，泳泳动动效效率率低低；而而CLCL离离子子却却很很高高，两两者者之之间间

22、形形成成导导电电性性较较低低的的区区带带，蛋蛋白白分分子子就就介介于于二二者者之之间间泳泳动动。由由于于导导电电性性与与电电场场强强度度成成反反比比，这这一一区区带带便便形形成成了了较较高高的的电电压压剃剃度度，压压着着蛋蛋白白质质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。 当当样样品品进进入入分分离离胶胶后后，由由于于胶胶中中pHpH的的增增加加，呈呈碱碱性性，甘甘氨氨酸酸大大量量解解离离，泳泳动动速速率率增增加加，直直接接紧紧随随氯氯离离子子之之后后，同同时时由由于于分分离离胶胶孔孔径径的的缩缩小小，在在电电场场的的作作用用下下，蛋蛋白白分分子子根根据据其其固

23、有的带电性和分子大小进行分离。固有的带电性和分子大小进行分离。凝胶配制的计算试剂名称配制10ml不同浓度分离胶试剂用量/ml配制5ml浓缩胶试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)1.652.503.335.00-4X 分离胶缓冲液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液（10%Acr-0.5%Bis）-1.54X 浓缩胶缓冲液（pH6.8 Tris-HCl）-1.2510% SDS 0.100.100.100.100.51%TEMED 1.001.001.001.001.00ddH2O 4.753.903.071.44.

24、60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.050.050.050.050.025凝胶配制步骤 安装灌胶模具：安装灌胶模具：注意压紧，避免漏胶。注意压紧，避免漏胶。 配制分离胶溶液：配制分离胶溶液：配胶时分离胶的五个组分按表依次加入洁净的配制分离配胶时分离胶的五个组分按表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以搅拌混匀约胶的小烧杯内，以搅拌混匀约10-20 sec10-20 sec，均匀加入胶槽。，均匀加入胶槽。 灌制分离胶：灌制分离胶：灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的电泳缓冲液灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的电泳缓冲液（pH8.8pH8.8）（这可使凝固后的胶面平滑整齐

25、），然后于）（这可使凝固后的胶面平滑整齐），然后于3737凝固凝固15-30 min15-30 min。 配制浓缩胶溶液：配制浓缩胶溶液：配胶时浓缩胶的五个组分按表依次加入洁净的配制分离配胶时浓缩胶的五个组分按表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以搅拌混匀约胶的小烧杯内，以搅拌混匀约10-20 sec10-20 sec，均匀加入胶槽，插入加样梳。，均匀加入胶槽，插入加样梳。 灌灌制制浓浓缩缩胶胶：浓浓缩缩胶胶是是用用于于浓浓缩缩蛋蛋白白质质样样品品，位位于于整整块块SDS-PAGESDS-PAGE胶胶的的上上层层。常常用用浓浓度度是是5%5%，pH6.8pH6.8。 并并用用加加样样梳梳形形

26、成成加加样样孔孔。孔孔下下留留0.80.81.0cm1.0cm的的浓浓缩缩胶胶，以以便便蛋蛋白白质质样样品品在在这这段段胶胶的的电电泳泳中中被被浓浓缩缩并并聚聚焦焦成窄线，有利于下面的分离胶分离不同分子量蛋白时形成清晰的条带。成窄线，有利于下面的分离胶分离不同分子量蛋白时形成清晰的条带。蛋白质样品上样电泳预预电电泳泳：配配制制完完成成的的SDS-PAGESDS-PAGE胶胶通通常常要要预预电电泳泳510510分钟，以去除未交联丙烯酰胺的影响。分钟，以去除未交联丙烯酰胺的影响。蛋蛋白白质质的的加加样样量量：通通常常一一个个上上样样孔孔加加样样15l15l，含总蛋白量约为含总蛋白量约为40-100

27、g40-100g。加加样样模模式式：通通常常左左右右两两侧侧的的上上样样孔孔加加5 510l10l蛋蛋白白标标志志，若若样样品品数数较较少少（77个个），则则左左右右两两侧侧上上样样孔孔加加2 23 3ll蛋蛋白白质质上上样样缓缓冲冲液液，中中间间的的孔加蛋白标志。孔加蛋白标志。起起始始电电泳泳：电电泳泳通通常常采采用用稳稳压压模模式式，起起始始电电压压通常为通常为70v70v。电泳分离电压：电泳分离电压：通常为通常为100100120V120V。结结束束电电泳泳：电电泳泳结结束束的的标标志志通通常常以以欲欲分分离离的的蛋蛋白白质质泳泳动动到到胶胶的的1/21/22/32/3处处，或或者者以以

28、溴溴酚酚蓝蓝开开始从胶底部泳出为标准。始从胶底部泳出为标准。SDS-PAGE电泳凝胶染色 银染银染(silver staining )(silver staining ) 考马斯亮蓝染色（考马斯亮蓝染色（Coomassie Coomassie Brilliant Blue stainingBrilliant Blue staining） Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue R-250 R-250 Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue G-250 G-250 凝胶结果分析

29、 染色后的凝胶可以用凝胶扫描仪观测染色后的凝胶可以用凝胶扫描仪观测照相，也可平铺在普通扫描仪上扫描照相，也可平铺在普通扫描仪上扫描成图像。成图像。 凝胶图像可通过电脑软件进行分析。凝胶图像可通过电脑软件进行分析。确定目的蛋白的位置，根据蛋白标准确定目的蛋白的位置，根据蛋白标准条带确定蛋白质的相对大小。并可以条带确定蛋白质的相对大小。并可以通过软件计算不同泳道之间蛋白质的通过软件计算不同泳道之间蛋白质的相对含量。相对含量。SDS-PAGE凝胶电泳的Q&AQQ：SDS-PAGESDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？电泳凝胶中各主要成分的作用？A: A: 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电

30、泳提供载体，其凝固的好坏直接聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8pH6.8，分离胶选择，分离胶选择pH8.8pH8.8，选择，选择TrisTrisHCLHCL系统，系统，具体作用后面介绍；具体作用后面介绍；QQ：TEMEDTEMED与与APAP的作用？的作用？A A：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；QQ：十二烷基硫酸钠（：十二烷基硫酸钠（SDSSDS）的作用？）的作用？A A：阳离子去污剂

31、，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。白分子内的疏水作用、去多肽折叠。QQ：提高：提高SDS-PAGESDS-PAGE电泳分辨率的途径？电泳分辨率的途径？A A：1 1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4 4度冰箱放置，前者度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致易导致凝固不充分，后者

32、可导致SDSSDS结晶。一般凝胶可在室温下保存结晶。一般凝胶可在室温下保存4 4天，天，SDSSDS可水解聚丙烯酰胺。可水解聚丙烯酰胺。 2 2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-P82-103103。QQ：“ “微笑微笑” ”（两边翘起中间凹下）形带原因？（两边翘起中间凹下）形带原因？A A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。：主要是由于凝胶的中间部分凝固

33、不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。QQ：“ “皱眉皱眉” ”（两边向下中间鼓起）形带原因？（两边向下中间鼓起）形带原因？A A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。QQ：为什么带出现拖尾现象？：为什么带出现拖尾现象？A A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处

34、理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。QQ：为什么带出现纹理现象？：为什么带出现纹理现象？A A：主要是样品不溶性颗粒引起的。：主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。QQ：什么是：什么是“ “鬼带鬼带” ”，如何处理？，如何处理？A A：“鬼带鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶

35、端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在的免疫学活性，在WBWB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用

36、。 处理办法：处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的在加热煮沸后，再添加适量的DTTDTT或或BetaBeta巯基乙醇，以补充巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量不足的还原剂；或可加适量EDTAEDTA来阻止还原剂的氧化。来阻止还原剂的氧化。QQ：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？A A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：处理办法：更换正确更换正确pHpH值的值的BufferBuffer；降低

37、分离胶的浓度。；降低分离胶的浓度。QQ：为什么电泳的条带很粗？：为什么电泳的条带很粗？A A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pHpH正确正确（6.86.8）；适当降低电压；）；适当降低电压；QQ：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？A A：这这种种现现象象一一般般初初学学者者易易出出现现。比比如如电电压压50v50v以以上上，可可电电流流却却在在5mA5mA以以下下。主主要要是是由由于于电电泳泳槽槽

38、没没有有正正确确装装配配，电电流流未未形形成成通通路路。包包括括：a.a.内内外外槽槽装装反反；b.b.外外槽槽液液过过少少；c.c.电电泳泳槽槽底底部部的的绝绝缘缘体体未未去去掉掉（比比如如倒倒胶胶用用的的橡胶皮）。橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。处理办法：电泳槽正确装配即可。QQ：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？A A：这这主主要要出出现现在在初初学学者者中中，一一般般对对电电泳泳不不会会有有太太大大的的影影响响。前前者者主主要要原原因因是是拔拔梳梳子子用用力力不不均均匀匀或或过过猛猛所所致致；后后者者是是由由于于在在解解除除制制胶胶的的夹夹子子后后，板未压紧而致空气进入引起的。板未压紧而致空气进入引起的。