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1、实验三实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐凝胶过滤法使蛋白质脱盐生物化学实验之生物化学实验之1实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件【实验原理】【实验原理】 凝凝胶胶层层析析又又称称分分子子筛筛层层析析、排排阻阻层层析析或或凝凝胶胶过过滤滤，是是以以凝凝胶胶为为载载体体，根根据据蛋蛋白白质质的的大大小小和和形形状状，即即蛋蛋白白质质的的相相对对分分子子质质量量进进行行分离和纯化。分离和纯化。 该该方方法法广广泛泛用用于于生生物物大大分分子子的的分分离离、纯纯化化、浓缩等。浓缩等。【实验目的】【实验目的】 学学习习凝凝胶胶过过滤滤法法分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质的的原原理与操作技术理与操作技术2实验3凝胶过
2、滤法使蛋白质脱盐课件 凝凝胶胶是是一一类类具具有有多多孔孔立立体体网网状状结结构构的的不不溶溶性性珠珠状状颗颗粒粒。多多是是交交联联的的聚聚糖糖( (如如葡葡聚聚糖糖或或琼琼脂脂糖糖) )类类物物质质，用用它它来来进进行行物物质质分分离离，主主要要是是根根据据多多孔孔凝凝胶胶对对不不同同相相对对分分子子质质量量的的物物质质具具有有不不同同的排阻效应实现的。的排阻效应实现的。3实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件4实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件 葡聚糖凝胶的商品名称为葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它具有三维空间的，它具有三维空间的多孔网状结构，呈珠状颗粒。多孔网状结构，呈珠状颗粒。 5实
3、验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件 本实验用本实验用G-25使蛋白质与使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的(NH4)2SO4扩散进入扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分子凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可
4、以扩散可以扩散进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质与与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质很容易地分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的样品脱盐的目的。 。6实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图7实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件【器材与试剂】【器材与试剂】（一）器材（一）器材 1. 层析柱层析柱 (15mm300mm） 2. 铁架台铁架台 3. 滴定管夹滴定管夹 4. SephadexG25 5. 刻度吸管刻度
5、吸管 （二）试剂（二）试剂 1. 样品溶液样品溶液 蛋白质硫酸铵溶液蛋白质硫酸铵溶液 2.10黄柳酸黄柳酸 3.钠氏试剂钠氏试剂 4.洗脱液（去离子水）洗脱液（去离子水）8实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件【实验操作】【实验操作】（一）凝胶的溶胀（一）凝胶的溶胀 取取Sephadex G25， 加加入入去去离离子子水水置置室室温溶胀温溶胀 24小时小时以上，反复倾以上，反复倾泻去掉细颗粒，泻去掉细颗粒，或沸水浴中煮沸或沸水浴中煮沸23小时，可去小时，可去除颗粒内部的空除颗粒内部的空气及灭菌。气及灭菌。9实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件（二）连接层析装置二）连接层析装置 1. 1. 先将层析柱垂直
6、固定在铁架台上。先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 2. 按下图将各部位连接起来。按下图将各部位连接起来。洗洗脱脱液液连连接接软软管管层层析析柱柱收收集集容容器器连连接接软软管管10实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件11实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件（三）装柱与层析（三）装柱与层析 1.1.装柱装柱 向层析柱中注入少量洗向层析柱中注入少量洗脱液（去离子水），将凝胶脱液（去离子水），将凝胶浆液沿玻棒缓慢倾入柱中浆液沿玻棒缓慢倾入柱中（注满）。凝胶自然沉积约（注满）。凝胶自然沉积约1 12cm 2cm 高度后打开下端出高度后打开下端出水口水口, ,待凝胶床面上升到约待凝胶床面上升到约3/43/4
7、柱高停止。关闭出水口柱高停止。关闭出水口, ,静置。静置。12实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件。 2.2.洗柱洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般为柱床体积的为柱床体积的23倍），再拧紧螺旋夹。倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。13实验3凝胶过滤法使
8、蛋白质脱盐课件3.3.加样与洗脱加样与洗脱 用用刻刻度度吸吸管管吸吸取取1ml样样品品（蛋蛋白白质质硫硫酸酸铵铵溶溶液液），其其尖尖头头小小心心沿沿层层析析柱柱内内壁壁伸伸到到床床面面之之上上，慢慢慢慢将将样样品品加加到到凝凝胶胶床床面面上上（不不可可搅搅动动床床面面），此此时时能能看看到到床床面面上上样样品品与与洗洗脱脱液液之之间间有有一一清清晰晰界界面面。拧拧松松螺螺旋旋夹夹，待待样样品品全全部部进进入入凝凝胶柱中胶柱中, 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出液。接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出液。 14实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件 用刻度离心管收集洗出液，每管收集用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠滴加入白瓷板穴中，加入钠氏试剂氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。淀。 （2）取洗出液）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸滴置小试管中，加入磺柳酸1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。淀出现。4.收集检查收集检查15实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件 1）NH4+检查检查 2）蛋白质检查）蛋白质检查16实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐课件
