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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶+ CO+ CO2 22 2NHNH3 3+ H+ H2 2O O硝化细菌是指能够氧化无机氮化物硝
2、化细菌是指能够氧化无机氮化物,从中获取能量从中获取能量,从而把二氧化碳合成为有机物的一类细菌。硝化从而把二氧化碳合成为有机物的一类细菌。硝化细菌合成有机物的过程表示如下：细菌合成有机物的过程表示如下： 2NH3+3O2(硝化细菌硝化细菌)2HNO2+2H2O+能量能量 2HNO2+O2(硝化细菌硝化细菌)2HNO3+能量能量 6CO2+6H2O(能量能量)C6H12O6 NH3既是硝化细菌的氮源，也是其能源。既是硝化细菌的氮源，也是其能源。思考：硝化细菌的新陈代谢类型是什么？思考：硝化细菌的新陈代谢类型是什么？1 1、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供人为提供有利
3、于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件( (包包括营养、温度、括营养、温度、pHpH等等) )，同时，同时抑制或阻止其他抑制或阻止其他微生物微生物生长。生长。什么是选择性培养基？什么是选择性培养基？P22P22页页2 2、方法：、方法：利用选择培养基分离利用选择培养基分离二、筛选菌株二、筛选菌株15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaNa2 2HPOHPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌
4、的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就能够选择出分解尿
5、素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积样，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。品中微生物的数量。. .统计菌落数目：统计菌落数目：利用血球计数板在显微镜下计数是常用的一种微生物利用血球计数板在显微镜下计数是常用的一种微生物计数法计数法显微镜直接计数法显微镜直接计数法其原理与计数板的构造有其原理与计数板的构造有关关每块计数板上有两个计数室每块计数板上有两个计数室 （正方形），盖上盖玻片后（正方形），盖上盖玻片后容积是一定的（容积是一定的（0.1mm3
6、），深为），深为0.1mm，边长为，边长为1mm，其上面有精确的刻度。其上面有精确的刻度。其刻度一般有两种规格其刻度一般有两种规格16个中方格，每个中方格分个中方格，每个中方格分25个小格个小格 162525个中方格，每个中方格分个中方格，每个中方格分16个小格个小格 2516计数室计数室计数室计数室 我们采用的是我们采用的是2516的，计数时查的，计数时查5个个小小方格的总菌数。方格的总菌数。如图：如图：计算：计算：1个计数室的总菌数个计数室的总菌数=A/525B1g（ml）样品中的总菌数）样品中的总菌数=A/525161000B =50,000AB个个5个方格的总菌数个方格的总菌数稀释倍数
7、稀释倍数每毫升原液所含细菌总数每毫升原液所含细菌总数=每小格平均细菌数每小格平均细菌数4001000稀释倍数稀释倍数注：注：400=2516，表示，表示400个小格，个小格，1000表示表示1mL=131.取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖盖取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖盖玻玻片。片。 2.取酵母菌液，取酵母菌液，摇匀摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡计数室内不得有气泡。3.用用10物物镜观察并将计数室移至视野中央。镜观察并将计数室移至视野中央。 4. 在在10物物镜下计数：计数镜下计数：计数4个（或
8、个（或5个）个）小小格的格的菌体总菌体总数数，然后求得平均值。乘上，然后求得平均值。乘上400就得出计数区总菌数，就得出计数区总菌数，最后再换算到每最后再换算到每mL菌液中的含菌数。菌液中的含菌数。5.注意事项：注意事项：计上不计下，计左不计右。计上不计下，计左不计右。实验步骤：实验步骤：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；缺点：缺点：2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度在稀释度足够高足够高时，微生物在固体培时，微生物在固体培养基上所形成的养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单细胞一个单细胞繁殖繁殖而成的，即而成的，即一个菌落代表原先的一个单细
9、胞。一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：常用方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。（3）计算：）计算：计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数 =（CV）M例、某同学在稀释倍数为例、某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得的培养基中测得平板上菌落数的平均数为平板上菌落数的平均数为234，那么每克样，那
10、么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为的体积为0.1ml） ( )A. 2.34108 B. 2.34109C. 234 D. 23.4 B注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值，更具说服力，可为使结果接近真实值，更具说服力，可将同一稀释度加到将同一稀释度加到三个或三个以上三个或三个以上的平板，的平板，培养后计算出菌落培养后计算出菌落平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。（为什么（为什
11、么（为什么（为什么）例例2 2、自自然然界界中中的的微微生生物物往往往往是是混混杂杂生生长长的的。人人们们在在研研究究微微生生物物时时一一般般要要将将它它们们分分离离提提纯纯，然然后后进进行行数数量量的的测测定定。下下面面是是对对大大肠肠杆杆菌菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：进行数量测定的实验，请回答有关问题：步步骤骤如如下下：a a、制制备备稀稀释释倍倍数数为为10102 2、10103 3、10104 4、10105 5、10106 6的的系系列列稀稀释释液；液；b b、为了得到更加准确的结果，、为了得到更加准确的结果，应应选选用用 法法接接种样品；种样品；c、适宜温度下培养。、适宜
12、温度下培养。结果分析：结果分析：（1）测测定定大大肠肠杆杆菌菌菌菌落落数数时时，在在对对应应稀稀释释倍倍数数为为10106 6的的培培养养基基中中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是（得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是（ ）A A、一个平板，统计的菌落数时、一个平板，统计的菌落数时230230个个B B、两个平板，统计的菌落数分别为、两个平板，统计的菌落数分别为220220和和260260，取平均值为，取平均值为240240C C、三个平板，统计的菌落数分别为、三个平板，统计的菌落数分别为2121、212212和和256256，取平均值为，取平均值为163163D D、四四个个平平
13、板板，统统计计的的菌菌落落数数分分别别为为210210、260260、240240和和250250，取取平平均均值为值为240240稀释涂布平板法稀释涂布平板法D（2 2）某同学在稀释倍数为）某同学在稀释倍数为10106 6的培养基上测得平板上菌落的培养基上测得平板上菌落数的平均值为数的平均值为212212，那么每毫升样品中的菌落数约是（涂，那么每毫升样品中的菌落数约是（涂布平板时所用的稀释液体积为布平板时所用的稀释液体积为0.20.2mL） 个。个。 （3）用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测）用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量（多得的数量（多/少）少） ，因为因为
14、 。1.06109多多当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一 个菌落个菌落 例：在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数例：在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由2516400个小个小室组成，容纳液体总体积为室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3。某同学操作时将。某同学操作时将1 mL酵母酵母菌样品加菌样品加99 mL无菌
15、水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：从静置试从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；把酵把酵母菌培养液放置在冰箱中；母菌培养液放置在冰箱中；第七天再取样计数，记录数据，统计第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。分析绘成曲线。请纠正该同学实验操作中的请纠正该同学实验操作中的3
16、处错误：处错误：_；_；_。答案：答案：应将试管轻轻震荡几次再吸取酵母菌培养液进行计算；应将试管轻轻震荡几次再吸取酵母菌培养液进行计算；应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养；应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养；应连续七天，每应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据天观察、取样计数并记录数据(2)在实验前应该对计数板、吸管等器具进行在实验前应该对计数板、吸管等器具进行处理。处理。(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是 。(4)如果观察到如图所示如果观察到如图所示a、b、c、d、e 5个大格共个大格共80个小室内共有个小室内
17、共有酵母菌酵母菌48个，则上述个，则上述1 mL酵母菌样品中约有酵母菌酵母菌样品中约有酵母菌 个；个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？ 。 灭菌灭菌适当稀释适当稀释2.4108多次实验，求平均值多次实验，求平均值设置对照的主要目的是：设置对照的主要目的是：. .设置对照：设置对照：排除实验组中排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同
18、学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同， 培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 ( (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质) )小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，要有说服力，对照的设置是必不可少的对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土
19、样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二. .实验的具体操作实验的具体操作 . .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入
20、事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。. .制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行 三三 样品的稀释样品的稀释. .取样涂布取样涂布实验时要对实验时要对培养皿作好标记培养皿作好标记。注明培。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。等。. .取
21、样涂布取样涂布分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同如果得到了如果得到了3 3个或个或3 3个以上个以上菌落数目在菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数
22、，如果并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确精确，需要重新实验。，需要重新实验。微生物的培养与观察微生物的培养与观察. .微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1
23、12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。三三. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个
24、重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五. .课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大
25、肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(E
26、MB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定正确的表述是对细菌群体生长规律测定正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 DD及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。是人们在一定条件下进行的。这些条件是：这些条件是：一种细菌一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数测定细菌总数。在这些条件下，才能测定
27、出细菌的生长规律。测。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A 1 1. .使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ）
28、 A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2 2. .能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ( ) ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练C CD D3 3. .下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分
29、离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4 4. .为培养和分离出酵母菌并
30、淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（） A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C 练一练练一练用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )A. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水 C. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
