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1、第三章 出血、血栓与止血检测z第一节 止血、凝血和纤溶机制z正常止血机制，有赖于完整的血管壁，有效的血小板，以及凝血系统和纤溶系统之间的平衡，由先天性或获得性病因，导致止血与凝血或抗凝与纤溶系统的异常,遂引起临床出血症状或血栓形成与血栓性疾病。导致以上疾病的原因可概括为五个方面:x1.血管壁的结构和功能异常x2.血小板的数量与功能异常x3.凝血因子的数量与活性异常x4.血中抗凝物质的含量异常x5.纤维蛋白溶解活性异常一、血管壁的作用z血管在止血方面起重要作用,其管壁须完整，具有良好的收缩力和正常的通透性，反之均可导致自发性出血或外伤后出血不止。当微血管损伤后,通过交感神经的轴突反射立即发生收缩
2、,历时15-30秒，使局部血流减少血流速度减慢,内皮细胞合成和释放的血管性血友病因子是血小板粘附于暴露的血管内皮细胞下胶原；聚集变性的血小板所释放的血管活性物质（血栓素A2、5-羟色胺），内皮细胞产生的内皮素以及血管紧张素又继而加强了血管收缩使血流更为缓慢,更有利于血小板的沉积与粘附。内皮损伤后暴露出的胶原纤维，所释放的组织因子分别启动了内源性和外源性凝血系统以加强止血作用。总之，血管的止血作用表现为（1）血管的收缩；（2）血小板的激活；（3）凝血系统的激活；（4）局部血粘度的增高。二、血小板的作用z血管收缩，血流缓慢有利血小板的粘附反应。z血小板膜糖蛋白I b-IX（GP I b-IX）经v
3、WF介导迅速粘附于暴露的胶原组织，激活的血小板基膜上糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)经纤维蛋白原(Fg)介导发生相互粘附（即聚集），此为血小板 第一相聚集，属可逆反应。z已变性的血小板释放其内含的5-羟色胺和ADP等物质,前者使血管进一步收缩，内原性ADP使更多的血小板聚集称为第二相聚集，为不可逆反应，从而形成白色血栓。z血小板释放的TXA2和5-HT等致血管收缩，血小板收缩蛋白（肌动蛋白和肌球蛋白）可使纤维蛋白网收缩，使血栓更为坚固，止血更为完善。三、凝血因子的作用z凝血过程也就是血液由流动状态转变为凝胶状态的过程。z血浆中的各种凝血因子平时都处于无活性状态，只有被活化后才具
4、有凝血活性。z一般认为凝血过程分为三个阶段（三期）：z凝血酶原激活物(活性凝血活酶)形成阶段z凝血酶形成阶段z纤维蛋白形成阶段z凝血第一阶段也就是凝血活酶形成阶段，因其起动方式及激活X因子的途径不同而分为内原性途径和外源性途径。（一）内源性凝血途径z起动于接触活化,从XII因子被活化为XIIa开始，当XII因子接触到一种带负电荷的表面，即被活化为XIIa，此过程称固相激活，很缓慢，但当少量的XIIa作用于前激肽释放酶使之转变为激肽释放酶时，后者却能迅速激活出大量的XIIa，这一反馈作用称为液相激活 ,它使得接触活化的效益大为增强。XIIa是一种蛋白水解酶，它能 激活XI因子成XIa ,XIa在
5、Ca2+ 参与下作用于IX因子而成为IXa，后者在血小板磷脂表面与Ca2+和VIII因子一起形成复合物,它具有很强的蛋白水解酶活性，能使X因子转变为具有活性的Xa,当Xa与V因子、Ca2+结合并由后者连接于血小板磷脂表面时，便形成了又一个复合物，即内源性凝血酶原激活物(血浆凝血活酶)。内源性凝血途径由于参与的因子多 ，反应步骤复杂,故需38分钟，占全血凝固时间（412分钟)的75%,因此当参与第一阶段的各种凝血因子特别是VIII、IX、XI、因子的含量明显减低如各型血友病时，凝血时间延长。内源性途径负电荷XIIa前急肽释放酶急肽释放酶XIXIaCa 2+ VIIIIXaPF3IXXXaVCa
6、2+磷脂（PF3/III）III+VIICa 2+ Ca 2+ VIIIII外源性途径（凝血活酶）XII凝血活酶凝血酶原凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白单体+肽可溶性纤维蛋白坚固的纤维蛋白Ca 2+Ca 2+XIIIXIIIaz 凝血第二阶段即凝血酶形成阶段凝血第二阶段即凝血酶形成阶段。z凝血酶原是一种单链糖蛋白，无凝血活性，当它与第一阶段所形成的凝血酶原激活物的磷脂表面结合受到水解成为凝血酶时，即有凝血活性，一旦有少量凝血酶形成，通过其正反馈作用增强因子x等的活性而加速血液凝固的过程。z z凝血第三阶段即纤维蛋白形成阶段凝血第三阶段即纤维蛋白形成阶段z纤维蛋白原分子结构式为(A)(B)2z在凝血酶作
7、用下，其多肽链末端的精氨酸甘氨酸键被切断分解掉带负电荷的纤维蛋白肽A、肽B后转变为纤维蛋白的单体，即() 2，许多纤维蛋白单体之间互相聚合而成为肉眼可见的纤维蛋白聚合体，称为可溶性或不稳定性纤维蛋白聚合体，在因子XIII作用下，一个纤维蛋白单体的赖氨酸残基与另一个单体的谷氨酰胺通过转肽作用而释放出氨，构成共价键，使纤维蛋白交叉联结成网，然后成为稳定的聚合体，不为尿素所溶解。它网罗各种血细胞而成为红色凝血块，至此凝血过程全部完成。（二）外源性凝血途径z本途径由组织损伤后释放的组织因子(凝血III因子,组织凝血活素)起动，因子属脂蛋白,含有大量磷脂,它广泛地存在于各组织中，而以脑、肺和胎盘中含量最
8、多。组织因子进入血液后，与因子VII、 Ca2+相互作用形成复合物,并作用于因子X使之水解成Xa,Xa形成后,由将其与Va因子结合于磷脂(主要是组织因子的磷脂)表面上而成为又一复合物即外源性凝血酶原激活物（组织凝血活酶)，外源性凝血途径由于参与的因子少，步骤简单，反应迅速，需时不到10秒钟。四、抗凝系统的作用z（一）细胞抗凝作用 z 体内单核-吞噬细胞系统和肝细胞对进入血流的促凝物质和被激活的凝血（抗凝血）蛋白进行吞噬、清除或摄取、灭活。z（二）体液抗凝作用 z 肝和内皮细胞合成的抗凝血酶III(antithrombin III,AT-III)，在肝素的介导下，灭活凝血酶、IXa、Xa、XIa
9、、XIIa等丝氨酸蛋白酶，这种抗凝作用占体内总抗凝作用的50%67%。肝合成的肝素辅因子II(heparin cofactor II,HC-II)主要灭活凝血酶，其次灭活FXa。蛋白C和蛋白S是依赖维生素K的抗凝蛋白，在凝血酶和内皮细胞合成的血栓调节蛋白(thrombomodulin ,TM)的作用下，PCAPC， APC在PS协同下，灭活Fva、FVIIIa和激活纤溶系统。新发现的组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)由内皮细胞和肝合成，具有抑制VIIa 、 Xa的作用。其他抗凝蛋白（2-巨球蛋白、 1抗胰蛋白酶）作用较弱。五、纤维蛋白
10、溶解系统的作用z体内或体外的凝血块可以被溶解，纤溶系统来完成。血管内皮细胞能合成和释放组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，肾小球和内皮细胞能合成和释放尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)，内源性凝血系统的XIIa和凝血酶都能使纤溶酶原(plasminogen,PLG)转变成纤溶酶(plasmin,PL)。 t-Pa和 u-PA都可被纤溶酶原激活抑制物-1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)所灭活；由肝合成的抗纤溶酶与纤溶酶形成复合物，从而灭活PL。zPL是活性很强的丝氨酸蛋白酶。它作用于纤维蛋白原（Fg）使降解成X、Y、D、E、B1-42碎片和其附属物A、
11、B、C、H；它水解未经XIIIa交联的可溶性纤维蛋白单体，使SFM产生X、Y、D、E， B15-42和其附属物A、B、C、H；它还可水解纤维蛋白，使其产生碎片X、Y、D、E，以及D-二聚体和其他复合物。此外，PL还可水解凝血因子如IX、X、XI、XII、XIII等。碎片X（X）、Y（Y）、D、E（E）具有较强的抗腺细胞聚集和抗凝血作用，可致使血液呈低凝状态。第二节 血管壁检测z一、毛细血管抵抗力试验z 原理:毛细血管的完整性与其自身的结构功能,血小板的数量和功能,以及神经体液因素密切相关。当上述某一因素缺陷或毛细血管壁受到理化因素、微生物毒素等侵害，即可破坏其完整性，使其脆性和通透性增高，容易
12、出血。在对静脉血流施加一定阻力使毛细血管血压升高时，新出血点常显著增加,借以了解毛细血管和血小板等因素的异常变化。z参考值： 成年男性 新出血点5 女性和小儿10z临床意义：新出血点数目超过参考值上限即为CFT阳性,表示毛细血管脆性增高，可见于：（1）毛细血管壁异常 （2）血小板数量减少 （3）血小板功能减低（二）出血时间(bleeding time BT)测定z出血时间是指皮肤毛细血管被刺伤后开始出血到自然止血所需的时间。z原理：BT长短主要与毛细血管的完整性，血小板的数量和功能以及血浆中VIII/vWF等凝血因子的含量有关，上述任何因素的缺乏都可引起延长。 z参考值 Duke法1-3分钟
13、Ivy法0.5-6分钟z(Ivy法:血压计袖带加压5.3KPa(40mmHg)前臂屈侧长深各2mm,每隔30吸血一次)z(VIII/vWF减少或缺乏使血小板粘附胶原的能力减弱)z临床意义：延长见于 z （1）血小板显著减少(400109 /L ) 见于：A .严重组织损伤、急性大出血及溶血（一过性增多） B.真性红细胞增多症、原发性出血性血小板增多症、慢粒(早期)等骨髓增生性疾病(持续) C .脾切除术后。（二）血小板平均容积和血小板分布宽度测定z参考值：MPV为711；PDW为15%17%z临床意义：z1.血小板平均容积代表单个血小板的平均容积。增加见于：（1）血小板破坏增加而骨髓代偿功能良
14、好者；（2）造血功能抑制解除后，MPV增加是造血功能恢复的首要表现。减低见于：（1）骨髓造血功能不良，血小板生成减少；（2）有半数白血病患者MPV减低；（3） MPV随血小板数而持续下降，是骨髓造血功能衰竭的指标之一。z2.血小板分布宽度可反映血液内血小板容积大小的离散度，用所测单个血小板容积大小的变异系数来表示。PDW减小表明血小板的均一性高，PDW增高表明血小板大小悬殊。三、血小板粘附试验（platelet adhesion test,PAdT)z正常血小板具有粘附于胶原纤维和带负电荷异物表面的能力。z原理：使一定量的静脉血与一定表面积的异物(如玻璃珠)接触一定时间后,即有血小板粘附和滞留
15、于异物表面，测定接触异物前后血小板数（分别以A、B示）之差，求出血小板的粘附率,以反映血小板的粘附功能z血小板粘附率(%)=(A-B)/A%z参考值:玻璃柱法 62.5 %8.61%（范围45.34%79.78%）z临床意义:减低：血小板无力症、血管性假血友病、尿毒症。z 增高:血栓前状态和血栓性疾病(如心梗、脑血栓等），动脉粥样硬化、高血压、高脂血症等。四、血小板聚集试验（platelet aggregation test PAgT)z原理：正常血小板具有彼此粘连聚集的功能。向富血小板血浆或全血中加入诱导剂(促血小板聚集的试剂,如ADP、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素等），置入专用仪器内,于恒温
16、条件下促使血小板聚集,测定其透光度或阻抗变化,并自动记录,描绘出聚集图象,以示血小板的聚集水平。z参考值：因不同方法而异。z临床意义：A.减低:见于血小板无力症、原发性出血性血小板增多症、真性红细胞增多症、低纤维蛋白原血症、血管性假血友病、尿毒症、肝硬化等。 B.增高 血栓性疾病、高脂血症、糖尿病等。五、血块收缩试验(clot retraction test,CRT)z在富含血小板血浆中加入和凝血酶，使血浆凝固成凝块，血小板收缩蛋白使血小板伸出伪足，伪足前端连接到纤维蛋白束上。当伪足向心性收缩，使纤维蛋白网眼缩小，测定析出血清的体积可反映血小板血块收缩的能力。z参考值：血块收缩率=血清(ml)
17、/全血(ml)（100%-Hct%） 100%，其参考值为65.8%11.0%。z临床意义z1.减低 见于ITP、血小板无力症、红细胞增多症、低（无）纤维蛋白原血症等。z2.增高 见于先天性和获得性XIII缺乏症。第四节 凝血因子检测z一、凝血时间测定（clotting time ,CT)z 血液离开血管至发生凝固所需的时间，称凝血时间。CT长短与各凝血因子的含量和功能有关,常用于各型血友病的筛检。z参考值：玻片法25min 普通试管法412min 硅化试管法1630minz(硅化试管法能减少凝血因子与玻璃管的接触，故轻度内源凝血系统障碍时试管法CT正常，硅管法延长，故较敏感。z凝血时间延长，
18、见于：A.凝血因子VIII、IX、XI缺乏（甲、乙、丙型血友病）B.凝血酶原严重缺乏，如先天性凝血酶原缺乏症 C.纤维蛋白原严重减少,如先天性纤维蛋白原缺乏症 D.严重的凝血因子V、X、XII缺乏 E.血中抗凝物质增多 F.DIC晚期z凝血时间缩短,见于:血液呈高凝状态时，血栓性疾病。二、活化部分凝血活酶时间（active partial thrombplastin time, APTT)zAPTT较CT敏感，用于血友病的进一步筛检。白陶土（接触因子激活剂）能充分激活因子XII、XI，利用组织因子中的脑磷脂部分，在钙离子作用下，可使血浆凝固。z硫酸钡吸附血浆 VIII、XIz正常血浆 VIII
19、、IX、XIz正常血清 IX、XIz临床意义：同CT测定，若APTT延长，可用含不同凝血因子的已知血浆和血清做纠正试验,以确定所缺乏的凝血因子的种类,若延长的APTT不被任何血清和血浆所纠正,提示血中抗凝物质增多。三、血浆凝血酶原时间测定z原理：血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)测定是在被检血浆中加入Ca2+和组织因子（组织凝血活酶），观察血浆的凝固时间。它是反映外源性凝血系统个凝血因子总的凝血状况的筛选试验。z参考值：z1.凝血酶原时间 1113秒。同时测定正常对照值，病人测定值超过正常对照值3秒以上为异常。z2.凝血酶原比值(prothrombin ratio,PT
20、R)即被检血浆的凝血酶原时间(S)/正常血浆的凝血酶原时间(S)，参考值为1.00.05。z3.国际标准化比值 (international normolized ratio,INR)即PTRISI,参考值为1.0 0.1。为国际敏感度指数，ISI越小（小于2.0），组织凝血活酶的敏感性越高。z临床意义：z1.PT延长：见于（1）先天性凝血因子I、II、VII、X缺乏；（2）后天性凝血因子缺乏，如严重肝病、维生素K缺乏、纤溶亢进、DIC、口服抗凝剂、异常凝血酶原增加等。z2.PT缩短：见于血液高凝状态如DIC早期、心肌梗塞、脑血栓形成等。z3.INR是监测口服抗凝剂的首选指标，国人以INR为2
21、.03.0为宜。四、血浆纤维蛋白原测定z原理：目前推荐Clouse法（凝血酶比浊法）。在受检血浆中加入一定量凝血酶，使血浆中的纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)转变为纤维蛋白，通过比浊原理计算Fg的含量。z参考值：24g/L。z临床意义：z1.增高：见于糖尿病、心肌梗塞、急性感染、多发性骨髓瘤、休克、大手术后、恶性肿瘤等及血栓前状态。z2.减低：见于DIC、原发性纤溶症、重症肝炎和肝硬化等。五、简易凝血活酶生成试验及纠正试验z原理：简易凝血活酶生成试验(simple thromboplstin generation test, STGT)：受检者稀释的全血溶液中含形成凝血酶原酶的各种凝血
22、因子和红细胞溶解产物（代替PF3），按一定时间加入正常基质血浆（提供凝血酶原和纤维蛋白原），测定凝血活酶生成所需的时间，以检查内源凝血系统凝血活酶生成有无障碍。z纠正试验：在STGT延长的受检稀释全血溶液中加入1/10容量的正常BaSO4吸附血浆（提供FVIII、XI、XII）、正常血清（提供FIX、XI、XII）和正常新鲜血浆（提供FVIII、IX、XI、XII），分别测定正常基质血浆的最短凝固时间，以了解内源性凝血活酶生成相关凝血因子的状况。z参考值：最短的凝固时间15S（1014S）。z临床意义：见下页表表4-2-14 STGT及纠正试验z 最短基质血浆凝固时间（秒） 因子VIII缺乏
23、因子IX缺乏 因子XI/XIII缺乏 血循环中存 在抗凝物质z受检溶血液 15 15 15 15z受检溶血液z+正常BaSO4z吸附血浆 15 15 15 15z受检溶血液z+正常血清 15 15 15 15z z受检溶血液z+正常血浆 15 15 15 15六、可溶性纤维蛋白单体复合物测定z纤维蛋白单体（FM）是纤维蛋白原(Fg)转变为纤维蛋白(Fb)的中间产物，它们可以自行聚合成复合物，并可溶解于5mmol/L的尿素溶液中，故称为可溶性纤维蛋白单体复合物(soluble fibrin monomer complex,SFMC)。SFMC的血浆水平增高，反映凝血酶的活性增强，是血栓形成的标志
24、物之一。z参考值 胶乳凝集法为阴性；ELISA法为48.515.6mg/L；RIA法为50.5 26.1 mg/L 。z临床意义 在血栓前状态、血栓性疾病（冠心病、脑血管疾病、糖尿病、DIC、妊高症等）以及恶性肿瘤、严重感染、创伤手术、产科意外等，血浆SFMC都会增高。第五节 抗凝血功能检测z一、血浆抗凝血酶III测定（发色底物法）z临床意义 z1.增高 见于血友病、白血病和再生障碍性贫血等的急性出血期以及口服抗凝药物治疗过程中。z2.减低 见于先天性和获得性AT-III缺乏症，后者见于血栓前状态、血栓性疾病、DIC和肝脏疾病。z（二）血浆蛋白C抗原测定（火箭电泳法）z临床意义 PC:Ag减低
25、，见于先天性和获得性PC缺乏症，后者见于DIC、肝病、手术后、口服抗凝剂等。z（三）血浆游离蛋白S测定（凝固法）z临床意义 FPS（free protein S,FPS)减低见于先天性和获得性PS缺乏症，后者见于肝病、口服抗凝剂等。第六节 纤维蛋白溶解检测z一、优球蛋白溶解时间z原理：于pH4.5低离子介质中沉淀的血浆优球蛋白组份中含有Fg、PLG（纤溶酶原）、和纤溶酶原激活物，但不含纤溶酶抑制物。沉淀物于pH9缓冲液中复溶后再加入适量溶液Ca2+（加钙法）或凝血酶（加酶法），Fg转变成纤维蛋白凝块，在37C条件下观察凝块完全溶解所需时间，即为优球蛋白溶解时间(euglobulin lysis
26、 time ,ELT) 。z参考值：加钙法为129.841.4 min；加酶法为157.5 59.1 min。z临床意义：z1.纤维蛋白凝块在70 min内完全溶解，表明纤溶活性增强，见于原发性纤溶和继发性纤溶，如手术、应激状态、创伤、休克、前置胎盘、胎盘早期剥离、恶性肿瘤广泛转移、急性白血病等。z2.纤维蛋白凝块完全溶解时间延长，表明纤溶活性减低，见于血栓前状态、血栓性疾病和应用抗纤溶药物等。z二、血浆凝血酶时间z原理：受检血浆中加入“标准化”凝血酶溶液，测定开始出现纤维蛋白丝所需的时间，即为血浆凝血酶时间（thrombin time,TT) 。z参考值：手工法1618 s，受检TT值延长超
27、过正常对照值3 s以上为延长。z临床意义：延长见于低（无）纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症；血中FDP增高（如DIC）；血中有肝素或类肝素物质存在（如肝素治疗中、SLE和肝脏疾病等）。z三、血浆D-二聚体测定z1.胶乳凝集法z2.ELISA法z临床意义：继发性纤溶症（如DIC）为阳性或增高；而原发性纤溶症为阴性或不增高，此是两者鉴别的重要指标。但本试验在血栓形成和临床出血时也可出现阳性。第七节 血液流变学检测z血液流变学（hemorheology,HR)是研究血液及其有形成分的流变特性规律及其在医学中应用的科学。当血液的流动性和粘滞性发生异常，如血流缓慢、停滞和阻断，可使血液循环障碍，组织缺
28、氧、缺血，引起一系列病理变化或疾病。因此，检测全血粘度、血浆粘度、红细胞变性等有重要意义。z一、全血粘度(blood viscosity)测定z临床意义：z1.血液粘度增高 见于冠心病、心肌梗塞、高血压病、脑血栓形成、DVT(深静脉血栓形成）、糖尿病、高脂血症、恶性肿瘤、肺源性心脏病、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、烧伤等。z2.血液粘度减低 见于贫血。z二、血浆粘度测定(plasma viscosity）z三、红细胞变形性测定z原理 微孔滤膜滤过法：用缓冲液将受检血液配制成一定容积的10%红细胞悬液，测定通过5m直径该孔膜所需的时间，与对比液通过的时间比较，计算出红细胞滤过指数，即红细胞变形
29、性(erythrocyte defomability)。红细胞滤过指数越高，红细胞变形性越差。z四、红细胞电泳时间测定第九节 检测项目的选择和应用z血栓与止血的检测主要用于血小板数量异常、血小板功能缺陷、凝血障碍、血栓前状态和血栓性疾病的临床诊断、鉴别诊断、病情观察、疗效评价和预后判断，也用于抗栓治疗的监测。z（一）一期止血缺陷的选择z一期止血缺陷是指血管壁和血小板缺陷所致的出血性疾病。z（二）二期止血缺陷的选择z二期止血缺陷是指凝血因子缺乏所致的出血性疾病。z（三）纤维蛋白溶解综合征 包括原发性纤溶和继发性纤溶两种。z（四）血栓前状态（PTS）一般指血栓形成前、后，血液有形成分和（或）无形成分发生易于形成血栓的病理生理变化。z（五）抗栓治疗的监测
