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1、微核制片技术及其应用(诱变剂的遗传毒性评价）一、一、实验实验目的目的1.了解微核了解微核检测检测的原理和毒理的原理和毒理遗传遗传学意学意义义。2.掌握蚕豆根尖微核（或掌握蚕豆根尖微核（或细细胞胞电电泳）泳）监测环监测环境境污污染的一染的一般方法。般方法。3.3.学会利用微核学会利用微核测试测试系系统评统评价价环环境物境物质质的的遗传遗传毒理效毒理效应应。二、二、实验实验原理（微核技原理（微核技术术）1、微核（、微核（micronuclei,MCN）：是真核）：是真核类类生物生物细细胞胞经辐经辐射或化学射或化学药药物的作用而物的作用而产产生的一种游离于主核之外生的一种游离于主核之外的异常核的异常
2、核结结构。在构。在细细胞胞间间期微核呈期微核呈圆圆形或形或椭圆椭圆形，大小形，大小为为主核主核1/3以下。微核的折光率及以下。微核的折光率及细细胞化学反胞化学反应应性性质质和和主核一主核一样样，也具合成，也具合成DNA的能力。的能力。微核形微核形态态2、微核的形成机理：、微核的形成机理：许许多理化因素，如多理化因素，如辐辐射、化射、化学学药剂药剂等作用于分裂等作用于分裂细细胞，引起染色体断裂或干胞，引起染色体断裂或干扰扰染色体行染色体行为为使之在有使之在有丝丝分裂分裂过过程中行程中行动动滞后，末期滞后，末期未能未能进进入主核，当子入主核，当子细细胞胞进进入下一次分裂入下一次分裂间间期期时时，便
3、便浓缩浓缩形成独立于主核之外的小核形成独立于主核之外的小核微核。微核。3 3、微核率的大小与用微核率的大小与用药剂药剂量或量或辐辐射累射累积积效效应应呈正相呈正相关，因此，可关，因此，可在在间间期期进进行微核的行微核的观观察和察和计计数来数来检检测测染色体畸染色体畸变变水平，水平，指示染色体或指示染色体或纺锤纺锤体的体的损伤损伤程度微核是常用的程度微核是常用的遗传遗传毒理学指毒理学指标标之一。之一。4 4、微核微核测试测试已用于已用于辐辐射射损伤损伤、辐辐射防射防护护、化学、化学诱变诱变剂剂、新、新药试验药试验、染色体、染色体遗传遗传疾病及癌症前期疾病及癌症前期诊诊断断等方面等方面微核成因化学
4、致突化学致突变变物物染色体作用于纺锤丝无着丝点，片或环整条染色体带着丝粒的环和断片于细胞分裂末期细胞质中形成微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成多染多染红细红细胞（胞（PCEPCE）呈灰）呈灰蓝蓝色，色，正染正染红细红细胞（胞（NCENCE）呈橘黄色。）呈橘黄色。微核的形成微核的形成70年代初，年代初，Matter和和Schmid首先用首先用啮齿类动啮齿类动物骨髓物骨髓细细胞微核率胞微核率来来测测定疑有定疑有诱变诱变活力的化合物，建立了微核活力的化合物，建立了微核测测定法。此后，微核定法。此后，微核测测定定逐逐渐渐从从动动物、人物、人扩扩展到植物展到植物领领域。人和域。人和动动物的微核物的微核测
5、试测试多用一定培养多用一定培养条件与条件与时间时间下的骨髓和外周血下的骨髓和外周血细细胞，但胞，但细细胞同步化困胞同步化困难难，微核率低，微核率低，约约0.2%。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核测试测试材料，材料，效果效果较较好，其中好，其中70年代末年代末Te-HsiuMa用一种原用一种原产产于美洲的于美洲的鸭鸭跖草，跖草，建立的四分建立的四分孢孢子期微核率子期微核率计计数（数（MCN-in-tetrad）的）的测试测试系系统统是是较较好好的系的系统统之一。之一。华华中中师师范大学生物系自范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆年开始
6、，建立了一套蚕豆根尖微核根尖微核测试测试系系统统，并首次用于，并首次用于监测监测水水环环境境污污染，染，经鉴经鉴定已列入国家定已列入国家生物生物监测监测技技术规术规范（水范（水环环境部分）。美国国家境部分）。美国国家环环保局也肯定了蚕保局也肯定了蚕豆根尖微核豆根尖微核试验试验在在环环境突境突变变性性检测检测中的作用，中的作用，对许对许多多环环境致癌物都作境致癌物都作了了标标准化的准化的试验试验，建立了，建立了庞庞大的数据大的数据库库，可以推广。，可以推广。三、三、实验实验用具用具1、材料：蚕豆（、材料：蚕豆（Vicia faba,2n=12）干种子）干种子蚕豆根尖蚕豆根尖细细胞的染色体大、数量
7、少，胞的染色体大、数量少，DNA含量含量高，根尖中含有高，根尖中含有较较多的分裂相多的分裂相细细胞，胞，对诱变对诱变因子反因子反应应敏感，且容易敏感，且容易观观察，是理想的察，是理想的遗传遗传毒理分析材料。毒理分析材料。显显微微镜镜、培养箱、紫外灯、水浴、培养箱、紫外灯、水浴锅锅、剪刀（或刀片）、剪刀（或刀片）、镊镊子、解剖子、解剖针针、载载玻片、盖玻片、玻片、盖玻片、烧烧杯、杯、滤纸滤纸等。等。2、实验仪实验仪器及用具器及用具1mol/L盐盐酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品红红染染液；液；NaN3（叠氮（叠氮钠钠）、）、EMS（甲基磺酸乙（甲基磺酸乙酯酯）、）、DES
8、（硫酸二乙（硫酸二乙酯酯）等化学）等化学诱变剂诱变剂等；等；紫外紫外线线、微波等物理、微波等物理诱变诱变因子。因子。3、药药品和品和试剂试剂1、浸种催芽、浸种催芽：25下浸泡下浸泡24h，吸，吸胀胀后，用河沙作后，用河沙作发发芽床，芽床，25培养箱中催芽培养箱中催芽1224h，初生根，初生根长长出出23mm时时，取，取发发芽良好的种子，芽良好的种子，放入放入铺满滤纸铺满滤纸的瓷的瓷盘盘中，中，25继续继续催芽，大部分根催芽，大部分根长长至至12cm（约约3648h）。2、染毒：、染毒：用被用被检测检测液液处处理根尖。每理根尖。每处处理理选选68粒初生根生粒初生根生长长良良好、根好、根长长一致的
9、种子，放入培养皿中，用被一致的种子，放入培养皿中，用被检测检测液浸没根尖。阳性因液浸没根尖。阳性因子可采用子可采用NaN3和紫外和紫外线线等，等，0.2、0.4、0.8mmol/LNaN3溶液。紫溶液。紫外外线线分分别处别处理理20、40、60min。另外可取一。另外可取一处污处污水作被水作被检检液之一。用液之一。用自来水（或蒸自来水（或蒸馏馏水）水）处处理作理作对对照。照。处处理根尖理根尖1224h。3、根尖、根尖细细胞恢复培养：胞恢复培养：处处理后的种子用自来水（或蒸理后的种子用自来水（或蒸馏馏水）水）浸洗三次，每次浸洗三次，每次23min。洗。洗净净后置入后置入辅辅有湿有湿润滤纸润滤纸的
10、瓷的瓷盘盘中，中，25下恢复培养下恢复培养2224h。四、四、实验实验操作流程操作流程4、根尖、根尖细细胞固定并保存：胞固定并保存：切取恢复后的切取恢复后的1cm长长的幼根，甲醇：的幼根，甲醇：冰醋酸（冰醋酸（3：1）液固定）液固定24h。置置70%的乙醇中保存于的乙醇中保存于4冰箱中。冰箱中。5、解离：、解离：加入加入1mol/L盐盐酸浸没幼根酸浸没幼根10min，使幼根，使幼根软软化。解离前化。解离前后用蒸后用蒸馏馏水清洗干水清洗干净净。6、染色、染色、压压片：片：截取截取12mm长长的根尖置的根尖置载载玻片上，滴一滴染玻片上，滴一滴染液，染色液，染色58min，加上盖玻片，加上盖玻片，压
11、压片。片。7、镜检观镜检观察、察、计计数：数：首先在低倍首先在低倍镜镜下找到分生下找到分生组织组织区区细细胞分散胞分散均匀，分裂相均匀，分裂相较较多的部位，再多的部位，再转转高倍高倍镜观镜观察。察。每一每一处处理理观观察察3个根尖，每个根尖数个根尖，每个根尖数1000个个细细胞，胞，统计统计其中含微其中含微核的核的细细胞数，然后平均，即胞数，然后平均，即为该处为该处理的理的MCN，即微核千分率。，即微核千分率。五、五、结结果与分析果与分析微核微核识别标识别标准：准：（1）在主核大小的）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。以下，并与主核分离的小核。直径大直径大约约是是细细胞直径的胞直径的
12、1/201/5。（2）小核着色与主核相当或稍浅。）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形）小核形态为圆态为圆形、形、椭圆椭圆形或不形或不规则规则形。形。处理观察的细胞数 微核数总计 微核NaN3 (mmol/L)0.20.40.8紫外线(min)204060蚕豆根尖微核蚕豆根尖微核检测记录检测记录表表注：以小注：以小组为单组为单位位统计统计平均微核千分率。平均微核千分率。处理观察的细胞数 微核数总计 微核NaN3 (mmol/L)0.20.40.8蒸馏水计计算各算各测试样测试样品（包括品（包括对对照）的微核千分率（照）的微核千分率（MCN）：）：样样品品污污染（中毒）程度的确定：染（中毒）程度
13、的确定：MCN10，基本没有，基本没有污污染（中毒）染（中毒）；10MCN18，轻轻度度污污染（中毒）染（中毒）；18MCN30，中度，中度污污染（中毒）；染（中毒）；MCN30，重度，重度污污染（中毒）。染（中毒）。某某样样品或品或对对照照观观察到的微核数察到的微核数某某样样品或品或对对照照观观察到的察到的细细胞数胞数MCN=1000“污污染指数染指数”判判别别（此方法可避免因（此方法可避免因实验实验条件等因素条件等因素带带来的来的MCN本底的波本底的波动动）：）：样样品品实测实测微核平均千分率微核平均千分率对对照平均微核千分率照平均微核千分率0PI1.5，基本没有，基本没有污污染；染；1.5PI2，轻轻度度污污染；染；2PI3.5，中度，中度污污染；染；PI3.5，重度，重度污污染。染。污污染指数染指数PI=MNNCE单个微核多个微核骨髓骨髓细细胞微核的形成胞微核的形成洋葱微核的形成洋葱微核的形成分析分析药药物或物或污污染源染源处处理后，理后，对对蚕豆微核率的蚕豆微核率的影响，比影响，比较诱变较诱变因子作用的大小。因子作用的大小。思考思考题题：在蚕豆根尖在蚕豆根尖细细胞的微核胞的微核测试测试中，中，为为什么要什么要进进行行恢复培养？恢复培养？
