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1、第一节第一节 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞的功能检测 一、一、T T细胞细胞(xbo)(xbo)功能检测功能检测 二、二、B B细胞功能检测细胞功能检测 三、三、NKNK细胞活性测定细胞活性测定第十五章第十五章 免疫免疫(miny)(miny)细胞功能检测技术细胞功能检测技术第一页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)第二节第二节 吞噬细胞功能检测技术吞噬细胞功能检测技术 一、中性一、中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞功能检测粒细胞功能检测 二、巨噬细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测第三节第三节 免疫细胞功能检测的临床应用免疫细胞功能检测的临床应用思考题思考题小小 结结 第二页，共四十三
2、页。免疫细胞功能测定(精) 对淋巴细胞群，中性粒细胞、巨噬对淋巴细胞群，中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等功能测定可以有细胞、树突状细胞等功能测定可以有效评价效评价(pngji)(pngji)机体特异性和非特异性免机体特异性和非特异性免疫功能。疫功能。 第三页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)第一节第一节 淋巴细胞的功能淋巴细胞的功能(gngnng)(gngnng)检测检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括原或有丝分
3、裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激(cj)(cj)后的增殖反后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 第四页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)淋巴细胞淋巴细胞T T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）B B细胞（执行体液细胞（执行体液(ty)(ty)免疫功能）免疫功能）NKNK和和K K细胞（非特异性免疫作细胞（非特异性免疫作用）用） 第五页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)一、一、T细胞细胞(xbo)功能的检测功能的检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞分泌功能细
4、胞分泌功能(gngnng)(gngnng)测定测定T T细胞介导的细胞毒细胞介导的细胞毒试验试验体内试验体内试验第六页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)（一）（一）T T淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖(zngzh)(zngzh)试验试验1. 1. 原理原理(yunl)(yunl)：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成(hchng)(hchng)分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松第七页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精) 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋
5、巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小( (直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无第八页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)2. 2. 淋巴细胞转化淋巴细胞转化(zhunhu)(zhunhu)的刺激物
6、的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物： PHA -T PHA -T细细胞胞 ConA -T ConA -T细胞细胞 PWM -T PWM -T、 B B细胞细胞 LPS -B LPS -B细细胞胞特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原(kngyun)(kngyun) 同种组织抗原同种组织抗原 第九页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)3. 3. 检测检测(jin c)(jin c)方法方法 形形态态法法：刺刺激激物物 淋淋巴巴细细胞胞（4-64-6天天） 母母细细胞胞化化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h） DNA DNA合成期合成期 + + 3
7、3HTdRHTdR掺入掺入 收集收集(shuj)(shuj)细胞细胞 检测检测射线射线 测定测定(cdng)(cdng)细胞内的细胞内的3H3HTdRTdR第十页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)（1 1）形态学检查法）形态学检查法第十一页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)方法学评价方法学评价(pngji)(pngji)：优点：形态学方法简便易行，优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。适于基层实验室应用。缺点：是依靠缺点：是依靠(yko)(yko)肉眼观察形态肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素学变化，判断结果易受主观因素
8、影响，重复性和准确性较差。影响，重复性和准确性较差。 第十二页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)（2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。观性强，重复性好。缺点：但需一定缺点：但需一定(ydng)(ydng)设备条件，同设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。时还存在放射性核素污染问题。第十三页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (二二) T) T细胞细胞(xbo)(xbo)分泌功能测定分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺细胞经各种丝裂原或抗原刺激后激后, ,分泌各种
9、细胞因子分泌各种细胞因子, ,可借助免疫学、细胞可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平量、生物学活性或基因表达水平(shupng)(shupng)，以反，以反映映T T细胞功能。细胞功能。 第十四页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)（三）（三）T T细胞细胞(xbo)(xbo)介导的细胞介导的细胞(xbo)(xbo)毒试毒试验验1.1.原理原理(yunl)(yunl)：靶细胞抗原靶细胞抗原(kngyun)(kngyun)T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞第十五页，共四十
10、三页。免疫细胞功能测定(精)形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+ +肿瘤肿瘤(zhngli)(zhngli)细胞细胞 计数残留肿瘤计数残留肿瘤(zhngli)(zhngli)细细胞胞同位素法同位素法 ：淋巴细胞（：淋巴细胞（CTLCTL）+ +含含51Cr 51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 51Cr 释放释放 测定测定射线射线2.2.方法方法(fngf)(fngf)意义意义(yy)(yy)： 肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 第十六页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)图图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图细胞细
11、胞毒试验示意图第十七页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (四四) ) 体内体内(t ni)(t ni)试验试验特异性抗原特异性抗原(kngyun)(kngyun)皮皮肤试验肤试验PHAPHA皮肤试验皮肤试验 第十八页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)二、二、B细胞细胞(xbo)功能检测功能检测B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成细胞抗体形成(xngchng)(xngchng)功能的功能的检测检测体内试验体内试验第十九页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (一一)B)B细胞增殖能力细胞增殖能力(nngl)(nngl)的试验的试验抗抗Ig
12、MIgM细菌细菌(xjn)(xjn)脂多糖脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞细胞(xbo)(xbo)增殖增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法第二十页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (二二) ) 溶血溶血(rn xu)(rn xu)空斑试验空斑试验1. 1. 原理原理(yunl)(yunl)：第二十一页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)2. 2. 方法学：方法学：经典溶血空斑形成经典溶血空斑形成(xngchng)(xngchng)试验试验被动溶血空斑试验被动溶血空斑试验 第二十二页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)3 3临床临床(ln chun)(ln ch
13、un)应用与评价应用与评价溶血空斑试验主要用于测定溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素药物和手术等因素(yn s)(yn s)对体液对体液免疫功能的影响免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。机体产生抗体的能力。 第二十三页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (三三) ) B B细胞抗体形成细胞抗体形成(xngchng)(xngchng)功能的检测功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法1.原理原理(yunl)(yunl)：第二十四页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)2 2应用应用(yngyng)(yngyng)与方法学评价：与方法学评价：该
14、方法既可检测抗体分泌细胞，该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。又可检测抗体分泌量。优点优点(yudin)(yudin)：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。第二十五页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (四四) )体内体内(t ni)(t ni)试验试验体内抗体体内抗体(kngt)(kngt)产生的特异性抗原有白喉产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链
15、球菌菌苗等。菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后免疫前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内体的效价，判断受检者体内B B细胞的功能。细胞的功能。第二十六页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)染色染色(rns)(rns)计数计数离心离心(lxn)(lxn)取上清取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心取沉淀离心取沉淀(chndin)(chndin)测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形
16、态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法三、三、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞: : K562细胞株第二十七页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)第二节第二节 吞噬细胞功能检测吞噬细胞功能检测(jin c)(jin c)技术技术 吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用作用(zuyng)(zuyng)三个阶段，据此建立相应的检测方法。三个阶段，据此建立相应的检测方法。 一、中性粒细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术第二十八
17、页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)吞噬细胞吞噬细胞(tn sh x bo)(tn sh x bo)的的功能：功能： 趋化趋化 吞噬吞噬(tnsh)(tnsh) 胞内杀灭作用胞内杀灭作用 第二十九页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)一、中性一、中性(zhngxng)粒细胞功能的检测粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬吞噬(tnsh)(tnsh)和杀菌功能的检测和杀菌功能的检测第三十页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (一一) ) 细胞运动功能细胞运动功能(gngnng)(gngnng)趋化功能趋化功能(gngnng)(gngnng)检测检测1.1.原理原理(y
18、unl)(yunl)：第三十一页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)2. 2. 方法学：方法学：琼脂糖平板琼脂糖平板(pngbn)(pngbn)法法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）第三十二页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (二二) )吞噬和杀菌吞噬和杀菌(sh jn)(sh jn)功能测定功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：第三十三页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)2. 2. 溶菌法溶菌法3 3NBTNBT还原还原(hun yun)(hun yun)试验试验 第三十四页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)二、巨噬细胞功能二、巨噬细胞功能(gngnng
19、)检测检测( (一一) )炭粒廓清炭粒廓清(kuqng)(kuqng)试试验验 正常正常(zhngchng)(zhngchng)小鼠肝中枯否细胞可吞噬小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除清除90%90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁( (炭粒悬液炭粒悬液) )，间隔一定时间反复取静脉血，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。第三十五页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (二
20、二) )吞噬吞噬(tnsh)(tnsh)功能检功能检测测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬吞噬(tnsh)(tnsh)功能，常用鸡红细胞功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬念珠菌、酵母细胞等作为吞噬(tnsh)(tnsh)颗粒，用颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。获得鼠巨噬细胞。 第三十六页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (三三) )巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定(cdng)(cdng)1 1酸性酸性(sun xn)(sun
21、 xn)磷酸酶的测定磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用-萘醋酸法萘醋酸法第三十七页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (四四) ) 细胞毒作用细胞毒作用(zuyng)(zuyng)测定测定 用用IFN-IFN-激活激活(j hu)(j hu)小鼠巨噬细胞，观察其小鼠巨噬细胞，观察其对对125I-UdR125I-UdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀伤活性。的杀伤活性。第三十八页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)( (五五) ) 巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定(cdn
22、g)(cdng) 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆性因子，加速正常血浆(xujing)(xujing)的凝固，为此取已经的凝固，为此取已经3737预温的正常兔血浆预温的正常兔血浆(xujing)(xujing)和和CaCl2CaCl2混合液，加混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置3737，即，即时记录血浆时记录血浆(xujing)(xujing)凝固时间。凝固时间。第三十九页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)反映机体免疫功能状态。反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病肿瘤、
23、免疫缺陷病等疾病(jbng)(jbng)的诊的诊断和疾病断和疾病(jbng)(jbng)预后监测。预后监测。组织器官移植后对受者的细胞免组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。早期发现，以便及时采取有效措施。第三节第三节 免疫免疫(miny)(miny)细胞功能检测的临床应用细胞功能检测的临床应用第四十页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)思考题思考题1.1.T T细胞功能检测内容有哪些？细胞功能检测内容有哪些？2.2.什么是什么是T T细胞增殖细胞增殖(zngzh)(zngzh)试验的原理、刺激物及方法学试验的原
24、理、刺激物及方法学？3.3.何谓何谓T T细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？4.4.何谓结核菌素皮肤试验？何谓结核菌素皮肤试验？5.5.B B细胞功能检测的方法学有哪些？细胞功能检测的方法学有哪些？6.6.何谓溶血空斑试验的原理和方法学？何谓溶血空斑试验的原理和方法学？7.7.NKNK细胞活性测定的方法学有哪些？细胞活性测定的方法学有哪些？8.8.中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。9.9.巨噬细胞功能检测方法学及相应原理。巨噬细胞功能检测方法学及相应原理。10.10.免疫细胞功能检测的临床应用有哪些？免疫细胞功能检测的
25、临床应用有哪些？第四十一页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)小小 结结免疫细胞功能试验包括体内和体外试验。免疫细胞功能体外试免疫细胞功能试验包括体内和体外试验。免疫细胞功能体外试验主要根据免疫细胞的增殖活性、分泌活性和杀伤活性等特性验主要根据免疫细胞的增殖活性、分泌活性和杀伤活性等特性而进行实验设计。而进行实验设计。具体免疫细胞功能检测内容包括：具体免疫细胞功能检测内容包括：淋巴细胞功能检测，包淋巴细胞功能检测，包括括T T细胞增殖试验、细胞增殖试验、T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定(cdng)(cdng)、T T细胞介导的细胞介导的细胞毒试验以及体内试验；细胞毒试验以及体内试验；B
26、B细胞增殖试验、溶血空斑试验、细胞增殖试验、溶血空斑试验、酶联免疫斑点法以及体内试验；酶联免疫斑点法以及体内试验；NKNK细胞活性检测方法：酶释细胞活性检测方法：酶释放法、放射性核素释放法、化学发光法、流式细胞术法等。放法、放射性核素释放法、化学发光法、流式细胞术法等。吞噬细胞功能检测，方法有趋化功能检测、吞噬和杀菌功吞噬细胞功能检测，方法有趋化功能检测、吞噬和杀菌功能测定能测定(cdng)(cdng)等。等。第四十二页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)内容(nirng)总结第一节 淋巴细胞的功能检测。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。未转化和转化淋巴细胞的形态(xngti)特征。PWM -T、 B细胞。同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞。肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力。可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量。常用靶细胞: K562细胞株。(一) 细胞运动功能趋化功能检测。正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒第四十三页，共四十三页。免疫细胞功能测定(精)
