第六章 兽药残留检测技术苯并咪唑类1

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1、第六章 兽药残留检测技术第七节第七节 苯并咪唑类药物残留的危苯并咪唑类药物残留的危害分析与检测方法害分析与检测方法 一、概述一、概述l苯并咪唑类苯并咪唑类(Benzimidazoles，BEN)是一种驱虫剂是一种驱虫剂,被广被广泛应用于动物寄生虫的治疗泛应用于动物寄生虫的治疗,同时还作为杀霉菌剂应用于同时还作为杀霉菌剂应用于庄稼存贮和运输期间庄稼存贮和运输期间,使其免受霉菌污染。使其免受霉菌污染。l自自20世纪世纪60年代早期年代早期,美国合成噻苯达唑以来美国合成噻苯达唑以来,已合成数已合成数百种苯并咪唑类驱虫药。百种苯并咪唑类驱虫药。噻苯达唑噻苯达唑作为第一个商品化的作为第一个商品化的苯并咪

2、唑类药物苯并咪唑类药物,曾广泛用于世界各地曾广泛用于世界各地,用以驱除各种动用以驱除各种动物物(如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等)胃肠道寄生虫。胃肠道寄生虫。用于治疗时可一次内服给药用于治疗时可一次内服给药,也可以低浓度置于饲料中长也可以低浓度置于饲料中长期使用做预防用。期使用做预防用。l由于噻苯达唑驱虫作用不强由于噻苯达唑驱虫作用不强,用药剂量较大用药剂量较大,且驱虫谱不广且驱虫谱不广,目前目前,已逐渐为其他苯并咪唑类药物已逐渐为其他苯并咪唑类药物阿苯达唑、奥芬阿苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。l

3、本类药物的特点是驱虫谱广本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好驱虫效果好,毒性低毒性低,甚至还有甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。一定的杀灭幼虫和虫卵作用。l苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期唑对妊娠早期(约妊娠三周约妊娠三周)绵羊的胎儿有绵羊的胎儿有致畸作用致畸作用,因此用因此用于孕畜时应特别慎重。于孕畜时应特别慎重。苯并咪唑类药物的结构式苯并咪唑类药物的结构式l苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包括噻苯包括噻苯达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类,

4、以及苯并以及苯并咪唑环上的各种侧链取代物。咪唑环上的各种侧链取代物。苯并咪唑氨基甲酸酯类苯并咪唑氨基甲酸酯类苯并咪唑环苯并咪唑环噻苯达唑的同系物噻苯达唑的同系物苯并咪唑类药物苯并咪唑类药物l1、噻苯达唑噻苯达唑(Thiabendazole, TBZ)l2、坎苯达唑、坎苯达唑(Cambendazole, CAM)l3、苯硫脲酯、苯硫脲酯(Thiophanate)l4、非班太尔非班太尔(Febantel, FEB)l5、芬苯达唑、芬苯达唑(Fenbendazole, FBZ)l6、奥芬达唑、奥芬达唑(OxfendazoIe, OFZ)l7、阿苯达唑阿苯达唑(Albendazole, ABZ)l8、

5、甲苯达唑甲苯达唑(Mebendazole, MBZ)l9、奥苯达唑、奥苯达唑(Oxibendazole, OXI)l10、氟苯达唑、氟苯达唑(Flubendazole, FLU)l11、三氯苯达唑、三氯苯达唑(Triclabendazole, TCB)二、组织中苯并咪唑残留和限量二、组织中苯并咪唑残留和限量l苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与药药物本身物本身有关外有关外,还与还与给药途径给药途径、靶组织靶组织和和消除期消除期有关。有关。l标志残留标志残留定义为定义为母体药物及其主要代谢产母体药物及其主要代谢产物的总和物的总和。部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高

6、残留限量部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)三、样品处理三、样品处理l苯并咪唑类分子含咪唑环结构苯并咪唑类分子含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两性两个氮原子具有酸碱两性,在适当的在适当的pH条件下条件下,分子可以质子化分子可以质子化(pKa约约56)或去质或去质子化子化(pKa约约12)。l在酸性或碱性条件下在酸性或碱性条件下,大部分苯并咪唑类药物可解离大部分苯并咪唑类药物可解离,易溶易溶于水性溶剂于水性溶剂,并被提取并被提取,然后然后调节调节pH值使呈中性值使呈中性,用乙酸乙用乙酸乙酯抽提酯抽提。l由于由于5-OH-TBZ在在pH值范围内都能电离值范围内都能电离,易溶于酸性或

7、碱易溶于酸性或碱性的水溶液性的水溶液,乙酸乙酯很难将其抽提出来。乙酸乙酯很难将其抽提出来。l对于对于CAM、TCB和和TCB代谢产物代谢产物,它们都有两个或更多的它们都有两个或更多的pKa,因此溶剂提取时因此溶剂提取时,控制溶液的控制溶液的pH值尤为重要值尤为重要。l三氯苯达唑三氯苯达唑(TCB)、三氯苯达唑硫化物、三氯苯达唑硫化物(TCB-SO)、 TCB-SO2和和CAM分别在分别在pH7.310.9、5.09.0、3.88.0和和7.411.1呈中性呈中性,因此因此,只有当只有当pH7.48.0时时,所有这些分子都所有这些分子都呈呈中性中性。l大部分苯并咪唑类药物在大部分苯并咪唑类药物在

8、pH8时都呈中性时都呈中性,当预测某些苯当预测某些苯并咪唑类药物的并咪唑类药物的pKa约为约为8时时,这时欲对这些组分同时提取这时欲对这些组分同时提取变得相当困难。变得相当困难。l但也有例外但也有例外,如如MBZ-NO2和和OXI在在pH8.6和和8.3,以非电离以非电离形式存在。形式存在。1、水解、水解l肝肝和和奶奶样中苯并咪唑类药物与样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取不易被有机溶剂提取,可先将样品可先将样品水解水解后再提取后再提取游离的药物。游离的药物。l常用的水解方法有常用的水解方法有酸水解酸水解和和酶水解酶水解两种。两种。l酸水解酸水解通常使用无机酸通

9、常使用无机酸,例如用例如用4moL/L盐酸于盐酸于80110 ,在在14h即可完成水解。即可完成水解。l酸水解具有简便、快速、水解完全等优点酸水解具有简便、快速、水解完全等优点,因而因而被广泛采用。被广泛采用。酶水解酶水解l酶水解酶水解通常使用通常使用-葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶或或芳基硫酸酯芳基硫酸酯酶酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。后者可水解硫酸酯结合物。l由于肝样中通常存在上述两种结合物由于肝样中通常存在上述两种结合物,常使常使用用-葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶芳基硫酸酯混合酶,控制控制pH4.57.0,于一定温度下孵

10、育于一定温度下孵育1872h。l与酸水解相比与酸水解相比,酶水解比较温和酶水解比较温和,一般不会引一般不会引起药物的分解起药物的分解,但有时水解不完全和实验费但有时水解不完全和实验费用高是该法的缺点。用高是该法的缺点。lTocco等发现等发现TBZ在在尿尿和和奶奶中的代谢产物主要是中的代谢产物主要是5-OH-TBZ与葡糖苷酸和硫酸酯结合物与葡糖苷酸和硫酸酯结合物,结合物用结合物用-葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸硫酸酯酶或酸(6mol/L盐酸回馏盐酸回馏1h)水解水解,释放出游离的释放出游离的5-OH-TBZ。lChuckwudebe等对等对TBZ在在蛋鸡蛋鸡和和奶牛奶牛中代谢产物进行了中代

11、谢产物进行了研究研究,发现结合物主要是发现结合物主要是硫酸酯结合物硫酸酯结合物。lMarkus等对肝样中的等对肝样中的ABZ及其相关代谢物的结合物用及其相关代谢物的结合物用酸解方法进行水解酸解方法进行水解,释放出游离的释放出游离的ABZ-NH2-SO2。lCoulet等对组织中的等对组织中的TBZ蛋白结合物用蛋白结合物用碱解方法水解碱解方法水解。2、提取及净化、提取及净化l液液-液萃取液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的是提取苯并咪唑类药物的最常用方法最常用方法,通通常将水性溶液调节至适当的常将水性溶液调节至适当的pH值值,用水不相溶的有机溶用水不相溶的有机溶剂提取。剂提取。l用酸溶液提取时

12、用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。即包括了样品的水解过程。l由于苯并咪唑类药物的极性和由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大差异很大,因此因此多残留多残留提取相当困难提取相当困难,即使对单一药物即使对单一药物,母药及其代谢产物的同母药及其代谢产物的同时提取亦难。时提取亦难。例如例如lMBZ及其两个代谢产物及其两个代谢产物MBZ-OH和和MBZ-NH2,由于由于MBZ和和MBZ-NH2呈碱性呈碱性,pKa分别是分别是3.5和和5.5,在在pH7.5时时,这两种化合物不被电离这两种化合物不被电离;MBZ-OH含酸性的含酸性的-OH,其其pKa为为9.8,在在pH10000),但干扰少但干扰

13、少,吸收峰稳定、灵敏度足够吸收峰稳定、灵敏度足够,应用较多。应用较多。l对于本身有荧光的化合物对于本身有荧光的化合物,如阿苯达唑及其代谢物和噻苯如阿苯达唑及其代谢物和噻苯达唑及其代谢物达唑及其代谢物,可用可用荧光检测荧光检测,内源性杂质干扰小、检内源性杂质干扰小、检测灵敏度高。测灵敏度高。l光电二极管阵列检测光电二极管阵列检测(PDA)可提供化合物的吸收光谱图可提供化合物的吸收光谱图(200700nm),与标准品谱图进行对照与标准品谱图进行对照,可对样品作出初步可对样品作出初步的定性判断。的定性判断。lPDA检测器价格低廉、应用广检测器价格低廉、应用广,但在专一性和灵敏度上欠但在专一性和灵敏度

14、上欠高高,特别在检测动物组织中痕量的药物残留时有一定局限特别在检测动物组织中痕量的药物残留时有一定局限性。性。l质谱检测质谱检测(MS) 特别是串联质谱检测特别是串联质谱检测(MS/MS) 作为通用作为通用型检测器型检测器,具有高灵敏和高选择性的优点具有高灵敏和高选择性的优点,能提供化合物能提供化合物的结构信息的结构信息,予以定性确证予以定性确证,在残留分析中的应用日趋广在残留分析中的应用日趋广泛。泛。lLC-MS通常采用短柱通常采用短柱(150mm)分离分离,色谱柱平衡时间短色谱柱平衡时间短,适合样品的高通量分析。适合样品的高通量分析。lBlanchflower等采用等采用LC-MS法测定法

15、测定FBZ和和OFZ残留残留,发现等发现等度洗脱比梯度洗脱重复性好。度洗脱比梯度洗脱重复性好。lCannavan等采用梯度洗脱来分离等采用梯度洗脱来分离TBZ和和5-OH-TBZ,流动流动相由乙腈和相由乙腈和0.1mol/L醋酸铵组成。醋酸铵组成。lBalizs建立了建立了15种苯并咪唑残留测定的种苯并咪唑残留测定的LC-MS/MS方法方法,采采用细直径柱用细直径柱(2.1mm)分离分离,流动相流速为流动相流速为0.040.2mL/min,苯苯并咪唑类药物在并咪唑类药物在6min内出峰内出峰,但没有达到完全分离。但没有达到完全分离。lDe Ruycke等建立了等建立了LC-MS/MS法测定蛋和肌肉组织中苯法测定蛋和肌肉组织中苯并咪唑残留并咪唑残留,包括包括FLU、FLU-HMET和和FLU-RMET。后来。后来,他们还检测了牛奶中左旋咪唑和他们还检测了牛奶中左旋咪唑和7种苯并咪唑类药物的残种苯并咪唑类药物的残留。留。