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1、RNARNA干扰完整解析干扰完整解析RNA的干扰RNA干干扰是什么是什么 RNA干干扰的的发现 RNA干干扰的作用机制的作用机制 RNA干干扰的的应用用RNA干扰干扰RNA干扰存在的问题干扰存在的问题什么是RNA干扰？英文：RNA interference，缩写RNAi 。概念：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象 RNA干扰的发现 2006年，安德鲁法厄与克雷格梅洛（Craig C. Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。19
2、95199219911990Napoli等尝试在有颜色的矮牵牛(Petuniahybrida)花翼瓣中通过介入CHS基因使查尔酮合成酶过量表达,来加深花瓣的颜色。出人意料的是,花瓣颜色不仅未加深,而且42%的介入CHS基因的植物的花全部变白或有白色或灰白图案。Fire等把RNA注入新秀杆线虫以控制基因的表达Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达2002200019991998美国华盛顿卡耐基研究院的Fire等在研究RNA干扰所需的结构和传递条件的试验中发现,把dsRNA正
3、义链和反义链的混合物注入线虫体内,比注入单独的任意一个正义链或反义链的效果均要好。Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（ smallinterferingRNA，siRNA）引发RNAi。Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（smallhairpinRNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究
4、奠定了基础。Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶和2,5-寡聚腺苷酸合成酶信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。RNAi的作用机制的作用机制RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行： (1) siRNA的形成阶段； (2) RNA诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex，RISC)形成阶段 ； (3) 效应阶段 ； (4) 扩增阶段。RNAi机制机制外源
5、外源病毒病毒转座子转座子目标识别目标识别内切酶切割目标内切酶切割目标外切酶降解外切酶降解RNARdRP合成合成RNA激活的激活的siRNA复合物复合物双链双链siRNA异常异常ssRNARdRP合成合成RNA二级二级siRNA 目前，RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列(inverted repeats)转录及外源基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。 当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dice
6、r等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合，然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为2125nt大小的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)。 (1)siRNA的形成阶段的形成阶段核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶解旋酶解旋酶Dicer同源搜索活性同源搜索活性siRNAslongdsRNADicercontainstwoRNAseIIIdomains Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为2125nt大小在3端带有23个碱基悬端和5端
7、磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。 19ntduplex2nt3overhangssiRNAshaveadefinedstructuresiRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。 在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNase核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer
8、酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt23nt的siRNA呢?最近对RNase催化结构域的结构的研究使其真相大白。 Dicer Dicer 一种核酸酶,负责将dsRNA 转化为siRNA ： 它属于RNase 家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶( helicase) 结构域和一个PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 结构域, Dicer 在催化过程中以二聚体的形式出现, 其催化结构域在dsRNA 上反平行排列, 形成四个活性位点, 但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性, 这两个位点在相距约22bp 的距离切断ds
9、RNA , 各种生物体内Dicer结构略有不同, 致使siRNA 长度存在微小差别。DicerModels for Dicer cleavage启始阶段启始阶段加工酶加工酶加工成加工成21-23核苷酸片段核苷酸片段DicerRISCmRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解被核酸外切酶或核酸内切酶降解siRNA的形成的形成siRNADicerRISC(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段诱导的沉默复合物形成阶段 生成的siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNA-induced silencing complex），具有序
10、列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。 RNA诱导的沉默复合物诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)(3)效应阶段效应阶段 siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5起始端下游710个核苷酸处切断mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。 效应阶段效应
11、阶段mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解被核酸外切酶或核酸内切酶降解解旋酶解旋酶核酸外切酶核酸外切酶同源性检索活性同源性检索活性核酸内切酶核酸内切酶RISC 在这些机制中，在这些机制中，RISC是一个很是一个很灵活的平台，在不同的情况下结合不灵活的平台，在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能。同的调节分子从而具有不同的功能。RISC复合物的核心负责接受从复合物的核心负责接受从Dicer加工来的小加工来的小RNA，并用该小，并用该小RNA作作为识别其同源底物的向导从而介导为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生。的发生。RISCRNA-induced Silencing Comp
12、lex解旋酶核酸内切酶Argonaute proteinsiRNAmRNA250KD (inactive)100KD (active)ATP8/10/2024(4)扩增阶段扩增阶段 该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。 RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在R
13、dRP的识别下启动RNAi的反应过程。 RNAi扩大效应扩大效应 目前，对这些现象的解释至少有目前，对这些现象的解释至少有四种机制：四种机制： Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级siRNA”，再由后者降解同源的mRNA，故dsRNA的长度决定了放大效应的水平； siRNA在酶作用中，可多次利用，能进一步提供放大的信号； 移行RNAi (transitive RNAi)中，siRNA可作为靶mRNA的引物，在RdRP和Dicer等的作用下产生“次级siRNA”，导致沉默信号的扩增。 “异常RNA”(aberrant RNA)无需引物，可在RdRP的作用下生成dsRNA，并由Dicer酶
14、切生成siRNA。 以上四种机制中，尤其是移行RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增及传递提供了重要线索。 移行移行RNAi 移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特定的mRNA由3 5方向移动，这就是“移行RNAi”。在移行RNAi中新生成的siRNA并非直接来自导入的dsRNA，而是在细胞中RdRP的作用下，以初级siRNA的反义链为引物，以靶mRNA为模板，生成dsRNA，随后在Dicer酶及ATP的作用下产生新的siRNA，称为次级siRNA。除RdRP通过产生次级siRNA参与RNAi信号扩增外，其他与RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级siRNA参与
15、沉默信号的扩增。此外，RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制： (1) Dicer将长dsRNA切成初级siRNA，这一放大水平取决于dsRNA的长度；(2) siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。 应用：应用： RNAi主要通过在转录后 （post-transcriptional）水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，我们可以按拟定的方式来关闭（shutting off）非必需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢
16、性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路 。药物开发RNAi的应用领域病毒性疾病的治疗基因功能研究2 24 41 1肿瘤治疗3 3 1）基因功能研究 由于RNAi技术可以利用siRNA使目的基因沉默，研究基因的功能。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。 2）病毒性疾病的治疗 RNAi 机制作为真核生物基因组免疫系统, 抑制外源和内源有害基因表达。利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会抑制病毒的增殖。利用RNAi
17、 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了HIV-1的coreceptor(辅助受体)-CCR5进入人体外周淋巴细胞，不影响另一种HIV-1的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。 Randall等证明了针对 HCV(丙型肝炎病毒) RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的 HCV RNA降低80倍；将siRNA
18、 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默 HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等也证明了siRNA特异抑制 HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。Fig3.RNAi的抗病毒机制3）肿瘤治疗 用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因，(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达，(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。4）药物开发。利用RNAi技
19、术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高通量的筛选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物RNA干扰存在的问题目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍；如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚；目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。siRNA的稳定性在多基因家族中的非特异性问题如何将RNAi技术运用到临床试验结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！42
