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1、SNPs的检测方法2005.8.121SNP检测方法讲课主要内容nSNPs的定义nSNPs的研究意义nSNPs的研究进展和方向nSNPs的检测方法2SNP检测方法讲课SNPs的定义定义：单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列序列多态性多态性。 (99.9%)3SNP检测方法讲课SNPs的研究意义1. SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。_路标的作用传统研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遗传学（表型、基因、蛋白），4SNP检测方
2、法讲课2.基因多态性研究 研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别） 5SNP检测方法讲课SNPs研究进展和方向1. SNPs数据库的构建发现2. SNPs功能的研究（在1的基础上）6SNP检测方法讲课SNPs检测方法1.理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs(1) 灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧）(2) 快速、简便、高通量 (操作和分析的自动化程度高） (3) 费用相对低廉7SNP检测方法讲课2.现状： 到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。8SNP检测方法讲课3.每种SNPs的检测方法都可将之看
3、成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。9SNP检测方法讲课SNPs检测方法的分类一、区分一、区分SNPs 位点的位点的方法方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法二、检测分析技术二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3. DNA 芯片 4.质谱检测技术 10SNP检测方法讲课1.基于杂交的方法基于杂交的方法n原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。 （差异越大，检测的特异性就越好）11SNP检测方法讲课1
4、）利用Tmn固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等n 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH) 12SNP检测方法讲课核酸肽探针（Peptide nucleic acids，PNA)n其骨架是肽键n特点：1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响）2、链挤入 （形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面）3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）13SNP检测方法讲课1、与
5、靶分子高特异性地结合nTm值高n受盐浓度影响小（低盐浓度的体系）nTm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。14SNP检测方法讲课 LNA(locked nucleic acids) n其结构是在RNA分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。n特点： 1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合（构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配的Tm增加15SNP检测方法讲课DASH(dynamic allele-specific hybridization）16SNP检测方法讲课2）杂交+荧光共振分子信标
6、（双分子间杂交） 蝎状探针（分子内杂交）17SNP检测方法讲课分子信标（Molecular beacons）18SNP检测方法讲课蝎状探针 （Scorpion primer） 19SNP检测方法讲课2.基于酶的方法基于酶的方法1）DNA聚合酶2）连接酶3）限制性内切酶4）外切酶FEN5）RNase H20SNP检测方法讲课1）DNA聚合酶n等位基因特异性PCRn多重等位基因特异性PCRnTaqman法n引物延伸法n焦磷酸测序法21SNP检测方法讲课等位基因特异性PCR22SNP检测方法讲课Taqman 法23SNP检测方法讲课微测序法/引物延伸法24SNP检测方法讲课基本步骤（液相）1.设计P
7、CR扩增含SNPs位点的一段DNA2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸产物检测（ 放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、 质谱分析法、变性高压液相色谱法等）25SNP检测方法讲课APEX (arrayed primer extension)固相26SNP检测方法讲课焦磷酸测序法(Pyrosequencing )nDNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶( apyrase) 。n原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸
8、的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。27SNP检测方法讲课基本步骤1.1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与酶和底物孵育。2.2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。4. 4. ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。5.然后加入下一种dNTP。28SNP检测方法讲课29SNP检测方法讲课2)连接酶n联合链式反应 (combined chain reaction , CCR) n连接-滚环扩增反应 (ligation-rolling circle amplication , LRCA) 30SNP检测方法讲课
