实验二饮料中大肠菌群的测定

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1、大肠菌群的定义大肠菌群的定义大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠杆菌的定义大肠杆菌的定义大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-

2、+-的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。大肠菌群和大肠杆菌的关系大肠菌群和大肠杆菌的关系耐热大肠菌群的定义：耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中能在液体乳糖培养基中35/37 35/37 培养培养48h48h产产酸产气，并在酸产气，并在44.544.5培养培养24h24h产酸产气的细菌（依据产酸产气的细菌（依据ISOISO标准）标准）卫生学意义大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。食品中检出大肠

3、菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。大肠杆菌的生物学特性基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超

4、过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。大肠杆菌的生物学特性培养特性：大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度范围15-46 。l 在普通营养琼脂上有3种菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。大肠菌群及大肠杆菌测定 MPN法检验流程（FDA BAM） 检样50g+450ml稀释液 适当

5、十倍稀释样品选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9ml LST肉汤并加有导管），每管接种1mL 35 ，24 2h 48 2h 没有产气管 有产气管 报告阴性 接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培养） 24 2h 48 2h 查MPN表报告结果 产气管接种EMB平板（35、1824h） （大肠菌群） 从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 种LST复检产气 查MPN表报告结果（大肠杆菌） 大肠菌群测定MPN法检验几点说明MPNMPN检索表：检索表： MPN 为最大可能数(

6、Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。初发酵和证实试验：初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose ferm

7、entations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。产气量与倒管：产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问

8、时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。 大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。菌名菌落形态大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌

9、粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌 无色粪链球菌无色大肠杆菌测定革兰氏染色基本原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。 革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变

10、小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。大肠杆菌测定革兰氏染色基本步骤：将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色紫色紫色紫色，革兰氏阴性菌呈红色红色红色红色。大肠杆菌测定生化鉴定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole红色环不变色+-KovacsMR红色不变色+甲基红V-P玫瑰红色环不变色-V-P甲、乙液Citrate生长不生长-实验二实验二

11、饮料中大肠菌群的测定饮料中大肠菌群的测定一、实验目的一、实验目的1、学习饮料中大肠菌群检测程序、方法；、学习饮料中大肠菌群检测程序、方法；2、掌握饮料中大肠菌群检测结果的报告方式。、掌握饮料中大肠菌群检测结果的报告方式。二、实验材料二、实验材料1、设备和材料、设备和材料温温箱箱、水水浴浴锅锅、天天平平、显显微微镜镜、均均质质器器或或乳乳钵钵、温温度度计计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针2、培养基及试剂、培养基及试剂乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管、乳乳糖糖发发酵酵管管、蛋蛋白白胨胨水水、靛靛基基质质试试剂剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（麦康凯、伊红美蓝琼

12、脂（EMB）、革兰氏染色液）、革兰氏染色液GB4789.3-2010 大肠菌群计数GB4789.3-2010 大肠菌群计数（一）最先准备的器材（一）最先准备的器材规格名称 数量 用途1、500ml三角瓶 1个 稀释样品2、250ml三角瓶 1个 制EMB琼脂3、18180mm试管 9支 单料乳糖胆盐发酵管4、18180mm试管 3支 稀释样品（9ml）5、1ml移液管 5 支6、10ml移液管 3 支7、直径为90mm平皿 2套制EMB平板8、250ml量筒 1支9、玻璃珠：直径约5mm（二）应灭菌消毒的器材（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把不锈钢药匙1把 滴管胶头5只称量纸适量（三）应制备的培养

13、基（三）应制备的培养基 培养基 总量 所用容器l蒸馏水 225ml 500ml三角瓶l蒸馏水 9ml/ 3支 27ml 18180mm试管（稀释样品）l乳糖胆盐发酵管（单料）： 10ml/ 9支 100ml18180mm试管(装杜氏小管 )lEMB琼脂： 1瓶 150ml 250ml三角瓶（每 组配一瓶）蛋白胨20g、胆盐5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸馏水1000ml（将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示剂）；或购买制好的乳糖胆盐发酵培养基、按说明配置。分装试管，每管10ml，并放入一个到气管（杜氏小管），高压灭菌115、15分钟。双料乳糖胆盐发酵

14、培养基除蒸馏水外，其它成分加倍。乳糖胆盐发酵培养基：乳糖胆盐发酵培养基：P99 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氢二钾 2.0g 琼脂 15.0g伊红 0.4g美蓝0.065g 或20ml 伊红 (20g /L)和 10ml 美蓝(6.5 g /L) 蒸馏水 1000.0mL最终pH7.10.2 (25) 先将蒸馏水中加入磷酸氢二钾及蛋白胨、乳糖使之溶解，后加琼脂加热溶解，再调pH=7.2-7.4,再加入伊红,美蓝水溶液, 高压灭菌115、15分钟。 蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸，乳糖提供发酵所需的碳源，磷酸氢二钾维持缓冲体系，伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌

15、的生长。琼脂是凝固剂。 大肠杆菌在EMB上发酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金属光泽。沙门氏菌形成无色菌落。金黄色葡萄球菌基本上不生长。 EMB（伊红美蓝琼脂）（伊红美蓝琼脂）质控：质控：此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质控菌株接种后，控菌株接种后，3535培养培养18182424小时，小时，观察结果应如下表所示：观察结果应如下表所示：菌株 菌号 生长情况 菌落产气肠杆菌 ATCC 13048 好 粉红，无光泽大肠埃希氏菌 ATCC 25922 好，极好 有紫绿金属光泽中心肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 绿金属光泽，有黑心奇异变形杆菌 ATCC 25933

16、 好，极好 无色鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 好，极好 无色金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 说明：（1）伊红又称署红或四溴荧光素，为酸性染料。美蓝又称亚甲蓝，为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，染上红色，再与美蓝结合而形成紫黑色菌落，并有绿色金属光泽。二者除了作为指示剂外，还有抑制格兰氏阳性菌的作用。（2）在碱性环境中，不分解乳糖产酸的细菌不着色。伊红、美蓝不能结合，故沙门氏菌和志贺氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。（3）此培养基用于鉴别大肠杆菌及产气杆菌，并可快速鉴定白色念珠菌及鉴定凝固酶阳性葡萄球菌。美国公共卫生协会和美国细菌协会推荐，用于增殖或鉴别大肠

17、杆菌的检查。但某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。培养基保存应注意避光防止氧化。 样品1.酸奶12.鲜奶3.水样14.水样25.水样36.水样47.水样58.酸奶2A1组组 酸奶1 A2A2组组 水样1 A3组组 水样2 A4组组 水样3 B1B1组组 鲜奶 B2B2组组 水样4 B3B3组组 水样5 B4组组 酸奶2 三、实验方法与三、实验方法与步骤步骤1、采样及稀释、采样及稀释以以无无菌菌操操作作将将检检样样25g（或或25ml）放放于于含含有有225ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释液液的的灭灭菌菌玻玻璃璃瓶瓶内内（瓶瓶内内预预置置适适当当数数量量的的玻玻璃璃珠珠）或或灭灭菌菌

18、乳乳钵钵内内，经经充充分分振振摇摇或或研研磨磨做做成成1：10的的均均匀匀稀稀释释液液。固固体体检检样样最最好好用用无无菌菌均均质质器器，以以800r/min1000r/min的的速度处理速度处理1min，做成，做成1：10的稀释液。的稀释液。用用1ml灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1：10稀稀释释液液1ml，注注入入含含有有9ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释液液的的试试管管内内，振振摇摇混混匀匀，做做成成1：100的的稀稀释释液，换用液，换用1支支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液倍递增稀释液2. 乳糖初发酵试验乳糖初发酵试验 即即通通常常所

19、所说说的的假假定定试试验验。其其目目的的在在于于检检查查样样品品中中有有无无发发酵乳糖产生气体的细菌。酵乳糖产生气体的细菌。 将将待待检检样样品品接接种种于于乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管内内，接接种种量量在在1ml以以上上者者，用用双双料料乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管；1ml及及1ml以以下下者者，用用单单料料乳乳糖糖发发酵酵管管。每每一一个个稀稀释释度度接接种种3管管，置置（361）0C温温箱箱内内，培培养养（242）h，如如所所有有乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管都都不不产产气气，则则可可报报告告为为大大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行根据食品卫

20、生要求或对检验样品污染情况估计，选择三根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。管。也可直接用样品接种。10， 100, 1000 倍稀释（倍稀释（-1，-2，-3）3.分离培养分离培养（10倍稀释倍稀释） 将将产产气气的的发发酵酵管管分分别别转转种种在在伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂脂板板或或麦麦康康凯凯琼琼脂脂平平板板上上，置置（361）0C温温箱箱内内，培培养养18h24h，然然后后取取出出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。4.乳糖复发酵试验乳糖复发酵试验 即通

21、常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。确能发酵乳糖产生气体。 在在上上述述的的选选择择性性培培养养基基上上，挑挑取取可可疑疑大大肠肠菌菌群群12个个进进行行革革兰兰氏氏染染色色，同同时时接接种种乳乳糖糖发发酵酵管管，置置（361）0C的的温温箱箱内培养（内培养（242）h，观察产气情况。，观察产气情况。 凡凡乳乳糖糖发发酵酵管管产产气气，革革兰兰氏氏染染色色为为阴阴性性无无芽芽胞胞杆杆菌菌，即即报报告告为为大大肠肠杆

22、杆菌菌阳阳性性；凡凡乳乳糖糖发发酵酵管管不不产产气气或或革革兰兰氏氏染染色色为为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。5.报告报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告检索表，报告每每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。）食品中大肠菌群的最可能数。 根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表“最可能数（MPN）表”，即求得每100ml水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，即为1L水样中的总大肠菌群数。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1：10、1：100、1：1000或更高倍数的稀释。如果接种水的水样量不是10ml、1ml和0.1ml，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100ml的MPN值。MPN值MPN指数10（ml）/接种量最大的一管（ml） 3个大肠菌群/1L饮水 100个细菌总数/1ml饮水我国饮用水卫生标准：