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1、第六章第六章体外分析体外分析皖南医学院皖南医学院弋矶山医院弋矶山医院陶绍能陶绍能1 1定义定义体外分析以放射性核素或其他非放射性物质体外分析以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。量生物活性物质的检测技术。 2 2放射分析方法或其派生的相关技术放射分析方法或其派生的相关技术放射分析方法或其派生的相关技术放射分析方法或其派生的相关技术在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。在体外进行机体
2、内物质种类和含量的分析测定。在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、其它生物活性物质和药物浓度等。其它生物活性物质和药物浓度等。其它生物活性物质和药物浓度等。其它生物活性物质和药物浓度等。3 3体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，
3、具有异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、样品用量少、放射线灵敏度高、特异性强、精密度好、样品用量少、放射线灵敏度高、特异性强、精密度好、样品用量少、放射线灵敏度高、特异性强、精密度好、样品用量少、放射线不引入人体内、应用面广、方法简便不引入人体内、应用面广、方法简便不引入人体内、应用面广、方法简便不引入人体内、应用面广、方法简便等优点。是对多种等优点。是对多种等优点。是对多种等优点。是对多种疾病诊治和研究的重要方法之一。疾病诊治和研究的重要方法之一。疾病诊治
4、和研究的重要方法之一。疾病诊治和研究的重要方法之一。19591959年由美国年由美国年由美国年由美国 Berson & YalowBerson & Yalow建立了本方法，建立了本方法，建立了本方法，建立了本方法， YalowYalow为为为为此在此在此在此在19771977年获得诺贝尔医学与生理学奖年获得诺贝尔医学与生理学奖年获得诺贝尔医学与生理学奖年获得诺贝尔医学与生理学奖 4 4体外分析技术建立的基础体外分析技术建立的基础:以配体和结合体的特异性结合反应为共同的以配体和结合体的特异性结合反应为共同的生物学基础生物学基础以结合反应动力学规律作为共同的方法学基以结合反应动力学规律作为共同的方
5、法学基础础以放射性等的测量技术作为共同的定量手段以放射性等的测量技术作为共同的定量手段5 5生物学基础：特异性结合反应生物学基础：特异性结合反应 配体配体-结合体结合体 抗原抗原-抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应； 配基配基-受体的结合反应；受体的结合反应； 底物底物-催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；激素激素-激素结合球蛋白的结合反应激素结合球蛋白的结合反应6 6方法学基础：结合反应动力学规律方法学基础：结合反应动力学规律遵守可逆反应的质量作用定律：遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1L+R RL k2, v27 7定量手段定量手段 (标记配体作为示踪剂标记配体作为示踪
6、剂)放射性测量技术放射性测量技术酶定量技术酶定量技术化学发光定量技术化学发光定量技术荧光定量技术荧光定量技术8 8体外分析技术体外放射分析体外放射分析体外非放射分析体外非放射分析放射性竞争放射性竞争结合分析结合分析放射性非竞放射性非竞争结合分析争结合分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析 ( (radioimmunoassay, RIA)RIA)免疫放射分析免疫放射分析免疫放射分析免疫放射分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析( (immunoradiometri
7、c assay, IRMA)IRMA)(EIA)(EIA)(CLIA)(CLIA)(FIA)(FIA)分类:9 9放射免疫分析放射免疫分析radioimmunoassay, RIA1010放射免疫分析法是放射免疫分析法是放射免疫分析法是放射免疫分析法是YalowYalow和和和和BersonBerson于于于于19195959年在研究胰岛素的时候创年在研究胰岛素的时候创年在研究胰岛素的时候创年在研究胰岛素的时候创立的一种体外放射分析技术。立的一种体外放射分析技术。立的一种体外放射分析技术。立的一种体外放射分析技术。结合了放射性核素的高灵敏度和结合了放射性核素的高灵敏度和结合了放射性核素的高灵敏
8、度和结合了放射性核素的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。抗原抗体反应的高特异性。抗原抗体反应的高特异性。抗原抗体反应的高特异性。Dr. Yalow 1111一、一、RIA的基本原理的基本原理（一）竞争抑制结合反应：（一）竞争抑制结合反应： 放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（记抗原（记抗原（记抗原（AgAg）与定量的标记抗原（与定量的标记抗原（与定量的标记抗原（与定量的标记抗原（* *AgAg）对限量的特对限量的特对限量的特对限量的特异性抗体（异性抗体（异性抗体（
9、异性抗体（AbAb）的竞争抑制结合反应。的竞争抑制结合反应。的竞争抑制结合反应。的竞争抑制结合反应。AgAg和和和和* *Ag AbAg Ab间呈负相关函数关系间呈负相关函数关系间呈负相关函数关系间呈负相关函数关系1212基本原理基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag(B)(F) 4*Ag与与Ag 免疫活性相同免疫活性相同4*AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag 90%2）半衰期足够长）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性大分子：大分子：125I小分子：小分子：3H
10、or 125I（二）（二） 标记抗原标记抗原3030标记抗原的要求标记抗原的要求1 1、质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫、质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫、质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫、质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。活性要相同。活性要相同。活性要相同。 2 2、标记抗原要有适当高的放射性比活度。、标记抗原要有适当高的放射性比活度。、标记抗原要有适当高的放射性比活度。、标记抗原要有适当高的放射性比活度。比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，
11、所使用比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损但过高的比活度，也
12、会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损的问题。的问题。的问题。的问题。 31313 3、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于于于于95%95%。放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIARIA的免疫的免疫的免疫的免疫反应和动力学参数产生影响。反应和动力学参数产生影响。反应和动力学
13、参数产生影响。反应和动力学参数产生影响。由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。原一般要经过重新提纯后才能再次使用。原一般要经过重新提纯后才能再次使用。原一般要经过重新提纯后才能再次使用。32324 4、标记抗原的稳定性要好：、标记抗原的稳定性要好：、标记抗原的稳定性要好：、标记抗原的稳定性要好：和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素和标准抗原相比，标记抗
14、原由于有了放射性核素和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。射线的影响，更容易发生分解。射线的影响，更容易发生分解。射线的影响，更容易发生分解。在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。3333（三）特异性抗体（三）特异性抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。包括多克隆抗体和单克隆抗体。包
15、括多克隆抗体和单克隆抗体。包括多克隆抗体和单克隆抗体。抗体的质量之间关系到抗体的质量之间关系到抗体的质量之间关系到抗体的质量之间关系到RIARIA分析方法的灵敏度分析方法的灵敏度分析方法的灵敏度分析方法的灵敏度和特异性。和特异性。和特异性。和特异性。3434抗体的要求（抗体的要求（三高三高）高亲和力高亲和力高特异性高特异性高滴度高滴度3535抗体的检测指标抗体的检测指标1 1、亲和常数、亲和常数、亲和常数、亲和常数KK（affinity constantaffinity constant）：）：）：）：亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力亲和常数反应了抗体与抗原的亲
16、和力亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力。KK值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵敏值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵敏值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵敏值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵敏度高，准确度和精确度都好。度高，准确度和精确度都好。度高，准确度和精确度都好。度高，准确度和精确度都好。K=K=结合常数结合常数结合常数结合常数k k1 1 / / 解离常数解离常数解离常数解离常数k k2 2 。 36362 2、交叉反应率：、交叉反应率：、交叉反应率：、交叉反应率：指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了
17、抗体的特异性指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似的类似物，例如甲状腺素中就有的类似物，例如甲状腺素中就有的类似物，例如甲状腺素中就有的类似物，例如甲状腺素中就有T T3 3、T T4 4、rTrT3 3等，雌激素里等，雌激素里等，雌激素里等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。又有雌二醇、雌三醇等。又有雌二醇、雌三醇等。又有雌二醇
18、、雌三醇等。 交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。 3737常用常用常用常用50%50%置换法来测定交叉反应的百分率。置换法来测定交叉反应的百分率。置换法来测定交叉反应的百分率。置换法来测定交叉反应的百分率。即将被测物质和其类似物，分别
19、作竞争抑制曲线，比较两者即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者在其结合率为零管（在其结合率为零管（在其结合率为零管（在其结合率为零管（B/B0B/B0）的）的）的）的50%50%时的剂量响应浓度，其比时的剂量响应浓度，其比时的剂量响应浓度，其比时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物的相应活
20、力。的相应活力。的相应活力。的相应活力。 38383 3、滴度：、滴度：、滴度：、滴度：又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。指在没有标准抗原存在的时候，结合指在没有标准抗原存在的时候，结合指在没有标准抗原存在的时候，结合指在没有标准抗原存在的时候，结合50%50%的标记抗原时抗血的标记抗原时抗血的标记抗原时抗血的标记抗原时抗血清的稀释度。清的稀释度。清的稀释度。清的稀释度。其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓
21、度，各置于试其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡后分离后分离后分离后分离B B和和和和F F，测出，测出，测出，测出B B的放射性，算出的放射性，算出的放射性，算出的放射性，算出B%B%，以，以，以，以B%B%为纵坐标为纵坐标为纵坐标为纵坐标以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释
22、曲线，以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，B%B%为为为为50% 50% 所对应的抗血清滴度为工作滴度。所对应的抗血清滴度为工作滴度。所对应的抗血清滴度为工作滴度。所对应的抗血清滴度为工作滴度。 3939三、三、RIA的分离方法的分离方法指分离标记抗原抗体复合物（指分离标记抗原抗体复合物（指分离标记抗原抗体复合物（指分离标记抗原抗体复合物（B B）和游离标记抗原）和游离标记抗原）和游离标记抗原）和游离标记抗原（F F）的方法。）的方法。）的方法。）的方法。根据使用的分离剂不同可以分为：根据使用的分离剂不同可以分为：根据使用的分离剂不同可以分为
23、：根据使用的分离剂不同可以分为：非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法如吸附、过滤、沉淀等。如吸附、过滤、沉淀等。如吸附、过滤、沉淀等。如吸附、过滤、沉淀等。 特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离的方法如双抗体法等。的方法如双抗体法等。的方法如双抗体法等。的方法如双抗体法等。4040（一）分离方法
24、的要求（一）分离方法的要求分离完全、快速。分离完全、快速。分离完全、快速。分离完全、快速。不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原不使抗原不使抗原不使抗原- -抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、受环境因素（温度、受环境因素（温度、受环境因素（温度、PHPH值等）的影响小。值等）的影响小。值等）的影响小。值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。
25、操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。4141（二）非特异性分离方法（二）非特异性分离方法1 1、吸附法：、吸附法：、吸附法：、吸附法：利用表面活性物质将反应液中的中小分子，即游利用表面活性物质将反应液中的中小分子，即游利用表面活性物质将反应液中的中小分子，即游利用表面活性物质将反应液中的中小分子，即游离部分离部分离部分离部分F F吸附，离心后将大分子吸附，离心后将大分子吸附，离心后将大分子吸附，离心后将大分子B B留在上清夜中达留在上清夜中达留在上清夜中达留在上清夜中达到分离的目的。到分离的目的。到分离的目的。到分离的目的。常用的表面
26、活性物质是葡聚糖凝胶和活性碳颗粒。常用的表面活性物质是葡聚糖凝胶和活性碳颗粒。常用的表面活性物质是葡聚糖凝胶和活性碳颗粒。常用的表面活性物质是葡聚糖凝胶和活性碳颗粒。 42422 2、过滤法：、过滤法：、过滤法：、过滤法： 用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而留在滤膜上，达到分离的目的。留在滤膜上，达到分离的目的。留在滤膜上，达到分离的目的。留在滤膜上，达到分离的目的。 常用常用常用常用0.220.22 mm的醋酸纤维薄膜。的醋酸纤维薄膜。的醋酸纤维薄膜。的醋酸纤
27、维薄膜。43433、沉淀法：、沉淀法：在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一层水分子膜在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一层水分子膜在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一层水分子膜在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一层水分子膜所包被，使其能够溶解在溶液里。所包被，使其能够溶解在溶液里。所包被，使其能够溶解在溶液里。所包被，使其能够溶解在溶液里。在溶液中加入一定量的沉淀剂如聚乙二醇，乙醇等可以破在溶液中加入一定量的沉淀剂如聚乙二醇，乙醇等可以破在溶液中加入一定量的沉淀剂如聚乙二醇，乙醇等可以破在溶液中加入一定量的沉淀剂如聚乙二醇，乙醇等可以破坏大分子的水包膜，使大分子互相靠拢，形成更
28、大的分子坏大分子的水包膜，使大分子互相靠拢，形成更大的分子坏大分子的水包膜，使大分子互相靠拢，形成更大的分子坏大分子的水包膜，使大分子互相靠拢，形成更大的分子而沉淀下来。而沉淀下来。而沉淀下来。而沉淀下来。4444（三）特异性分离方法（三）特异性分离方法1 1、双抗体法：、双抗体法：、双抗体法：、双抗体法： 用待测抗原的抗体（第一抗体，用待测抗原的抗体（第一抗体，用待测抗原的抗体（第一抗体，用待测抗原的抗体（第一抗体，Ab1Ab1）作为抗原去免疫）作为抗原去免疫）作为抗原去免疫）作为抗原去免疫另一种属的动物而产生新的抗体（第二抗体，另一种属的动物而产生新的抗体（第二抗体，另一种属的动物而产生新
29、的抗体（第二抗体，另一种属的动物而产生新的抗体（第二抗体，Ab2Ab2），），），），Ab2 Ab2 可以和可以和可以和可以和Ab1Ab1特异性结合而形成更大的特异性结合而形成更大的特异性结合而形成更大的特异性结合而形成更大的Ag-Ab1-Ab2Ag-Ab1-Ab2三联复合物三联复合物三联复合物三联复合物而沉淀。而沉淀。而沉淀。而沉淀。 此法特异、高效、非特异结合低、重复性好。此法特异、高效、非特异结合低、重复性好。此法特异、高效、非特异结合低、重复性好。此法特异、高效、非特异结合低、重复性好。 45452、固相法：、固相法： 将第二抗体用一定的方法涂在试管等容器的将第二抗体用一定的方法涂在试
30、管等容器的将第二抗体用一定的方法涂在试管等容器的将第二抗体用一定的方法涂在试管等容器的内壁上，然后直接在试管内进行反应，平衡后抗原内壁上，然后直接在试管内进行反应，平衡后抗原内壁上，然后直接在试管内进行反应，平衡后抗原内壁上，然后直接在试管内进行反应，平衡后抗原抗体复合物连接在试管壁上，直接将上清液倒掉后抗体复合物连接在试管壁上，直接将上清液倒掉后抗体复合物连接在试管壁上，直接将上清液倒掉后抗体复合物连接在试管壁上，直接将上清液倒掉后就可以测定试管的放射性，十分方便。就可以测定试管的放射性，十分方便。就可以测定试管的放射性，十分方便。就可以测定试管的放射性，十分方便。46463、磁性微粒分离技
31、术、磁性微粒分离技术是一种新兴的分离技术。是一种新兴的分离技术。是一种新兴的分离技术。是一种新兴的分离技术。磁性微粒是用高分子材料和金属离子如磁性微粒是用高分子材料和金属离子如磁性微粒是用高分子材料和金属离子如磁性微粒是用高分子材料和金属离子如FeFe3 3OO4 4为原料，聚合为原料，聚合为原料，聚合为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层则均匀地包裹高分子而成的一种以金属离子为核心，外层则均匀地包裹高分子而成的一种以金属离子为核心，外层则均匀地包裹高分子而成的一种以金属离子为核心，外层则均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。聚合体的固相微粒。聚合体的固相微粒。聚合体的固相微粒。 4747使
32、用时磁性微粒经过特异性抗体包被制成的免疫磁性微粒以使用时磁性微粒经过特异性抗体包被制成的免疫磁性微粒以使用时磁性微粒经过特异性抗体包被制成的免疫磁性微粒以使用时磁性微粒经过特异性抗体包被制成的免疫磁性微粒以悬浮液状态存在于反应溶液中，在反应中与抗原结合形成复悬浮液状态存在于反应溶液中，在反应中与抗原结合形成复悬浮液状态存在于反应溶液中，在反应中与抗原结合形成复悬浮液状态存在于反应溶液中，在反应中与抗原结合形成复合体后，当受外加磁场吸引的作用磁性微粒可快速沉降而自合体后，当受外加磁场吸引的作用磁性微粒可快速沉降而自合体后，当受外加磁场吸引的作用磁性微粒可快速沉降而自合体后，当受外加磁场吸引的作用
33、磁性微粒可快速沉降而自行分离，无需离心沉淀，因而使操作过程大为简化。行分离，无需离心沉淀，因而使操作过程大为简化。行分离，无需离心沉淀，因而使操作过程大为简化。行分离，无需离心沉淀，因而使操作过程大为简化。 4848磁化分离技术的突出优点是：磁化分离技术的突出优点是：磁化分离技术的突出优点是：磁化分离技术的突出优点是： （1 1）非特异结合率低；）非特异结合率低；）非特异结合率低；）非特异结合率低； （2 2）磁化固相颗粒在反应系统呈悬浮状态，便于和抗原结合，）磁化固相颗粒在反应系统呈悬浮状态，便于和抗原结合，）磁化固相颗粒在反应系统呈悬浮状态，便于和抗原结合，）磁化固相颗粒在反应系统呈悬浮状
34、态，便于和抗原结合，缩短了反应平衡时间；缩短了反应平衡时间；缩短了反应平衡时间；缩短了反应平衡时间； （3 3）磁化颗粒表面积大，制成的固相抗体可含较多的抗体量；）磁化颗粒表面积大，制成的固相抗体可含较多的抗体量；）磁化颗粒表面积大，制成的固相抗体可含较多的抗体量；）磁化颗粒表面积大，制成的固相抗体可含较多的抗体量； （4 4）利用磁性分离架，不用抽吸，分离完全，操作简便。）利用磁性分离架，不用抽吸，分离完全，操作简便。）利用磁性分离架，不用抽吸，分离完全，操作简便。）利用磁性分离架，不用抽吸，分离完全，操作简便。4949四、测量仪器四、测量仪器1. 射线探测器（射线探测器（免疫计数器）免疫计
35、数器） ： 射线射线2.液体闪烁计数器液体闪烁计数器(liquid scintillation counter) ： 射线射线5050五、五、RIA的优点的优点1 1、灵敏度高：、灵敏度高：、灵敏度高：、灵敏度高： 一般化学分析法的检出极限为一般化学分析法的检出极限为一般化学分析法的检出极限为一般化学分析法的检出极限为1010-3-31010-6-6g g，而，而，而，而RIARIA通常为通常为通常为通常为1010-9-9(ng)(ng)、1010-12-12(pg)(pg)，甚至，甚至，甚至，甚至1010-15-15 (fg) (fg)、1010-18-18 (ag) (ag) 51512、
36、特异性强：、特异性强： RIARIA是基于抗原抗体免疫结合反应，由于抗原是基于抗原抗体免疫结合反应，由于抗原是基于抗原抗体免疫结合反应，由于抗原是基于抗原抗体免疫结合反应，由于抗原抗体免疫反应专一性强。良好的特异性抗体，能识别抗体免疫反应专一性强。良好的特异性抗体，能识别抗体免疫反应专一性强。良好的特异性抗体，能识别抗体免疫反应专一性强。良好的特异性抗体，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。 被测物被测物被测物被测物-抗原抗原抗原抗原
37、52523、应用范围广：、应用范围广：据不完全统计，目前至少已有据不完全统计，目前至少已有据不完全统计，目前至少已有据不完全统计，目前至少已有300300多种生物活性物质已建立多种生物活性物质已建立多种生物活性物质已建立多种生物活性物质已建立了了了了RIARIA。它几乎能应用于所有激素的分析（包括多肽类和固。它几乎能应用于所有激素的分析（包括多肽类和固。它几乎能应用于所有激素的分析（包括多肽类和固。它几乎能应用于所有激素的分析（包括多肽类和固醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原
38、、醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析。等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析。等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析。等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析。近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有近年来由于小分
39、子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于RIARIA的的的的探测极限，都可建立适当的探测极限，都可建立适当的探测极限，都可建立适当的探测极限，都可建立适当的RIARIA法。法。法。法。 53534、操作简便，商品化程度高：、操作简便，商品化程度高：RIARIA所需试剂品种不多，便于制成配套试剂盒；所需试剂品种不多，便于制成配套试剂盒；所需试剂品种不多，便于制成配套试剂盒；所需试剂品种不多，便于制成配套试剂盒； 加样
40、程序简单加样程序简单加样程序简单加样程序简单, ,一次能分析大量标本；一次能分析大量标本；一次能分析大量标本；一次能分析大量标本； 反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化； RIARIA属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。操作简便，成本低。血清、血浆、体液、组织匀浆等样品操作简便，成本低。血清、血浆、体液、组织匀浆等样品操作简便，成本低。血清、血
41、浆、体液、组织匀浆等样品操作简便，成本低。血清、血浆、体液、组织匀浆等样品不加提纯就可直接测量。不加提纯就可直接测量。不加提纯就可直接测量。不加提纯就可直接测量。 5454六、六、RIA的质量控制的质量控制一个理想的、没有误差的一个理想的、没有误差的一个理想的、没有误差的一个理想的、没有误差的“ “完美完美完美完美” ”测定，应该是标本样品的测定，应该是标本样品的测定，应该是标本样品的测定，应该是标本样品的分析物无论是在一次测定中的任何位置，无论是重复测定几分析物无论是在一次测定中的任何位置，无论是重复测定几分析物无论是在一次测定中的任何位置，无论是重复测定几分析物无论是在一次测定中的任何位置
42、，无论是重复测定几次，甚至在不同实验室所测得的结果都是一样的，而且所测次，甚至在不同实验室所测得的结果都是一样的，而且所测次，甚至在不同实验室所测得的结果都是一样的，而且所测次，甚至在不同实验室所测得的结果都是一样的，而且所测值就是这个样品的真值。值就是这个样品的真值。值就是这个样品的真值。值就是这个样品的真值。 但是，在实际工作中，这种理想的测定是不可能达到的。但是，在实际工作中，这种理想的测定是不可能达到的。但是，在实际工作中，这种理想的测定是不可能达到的。但是，在实际工作中，这种理想的测定是不可能达到的。 任任任任何一种分析方法都会产生误差。何一种分析方法都会产生误差。何一种分析方法都会
43、产生误差。何一种分析方法都会产生误差。5555一个完善的质量控制体系应包括两个环节：一个完善的质量控制体系应包括两个环节：一个完善的质量控制体系应包括两个环节：一个完善的质量控制体系应包括两个环节： 1 1、生产厂家应该建立严格的质量检测程序。、生产厂家应该建立严格的质量检测程序。、生产厂家应该建立严格的质量检测程序。、生产厂家应该建立严格的质量检测程序。 2 2、实验室应该有严格的质量控制体系。包括实验室、实验室应该有严格的质量控制体系。包括实验室、实验室应该有严格的质量控制体系。包括实验室、实验室应该有严格的质量控制体系。包括实验室内部质量控制（室内质控）和实验室间的质量控制内部质量控制（
44、室内质控）和实验室间的质量控制内部质量控制（室内质控）和实验室间的质量控制内部质量控制（室内质控）和实验室间的质量控制（室间质控）。（室间质控）。（室间质控）。（室间质控）。5656（一）误差的分类和来源：（一）误差的分类和来源： 根据来源不同的误差，可以把实验中产生的误根据来源不同的误差，可以把实验中产生的误根据来源不同的误差，可以把实验中产生的误根据来源不同的误差，可以把实验中产生的误差分为两类：差分为两类：差分为两类：差分为两类：系统误差系统误差随机误差随机误差57571 1、系统误差：、系统误差：、系统误差：、系统误差： 是由于试剂、仪器或操作方法上一个固定的缺陷而是由于试剂、仪器或操
45、作方法上一个固定的缺陷而是由于试剂、仪器或操作方法上一个固定的缺陷而是由于试剂、仪器或操作方法上一个固定的缺陷而造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的正确性。造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的正确性。造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的正确性。造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的正确性。系统误差引起的测定结果的偏差是固定的偏大或偏系统误差引起的测定结果的偏差是固定的偏大或偏系统误差引起的测定结果的偏差是固定的偏大或偏系统误差引起的测定结果的偏差是固定的偏大或偏小。小。小。小。系统误差是可以避免的。系统误差是可以避免的。系统误差是可以避免的。系统误差是可以避免的。58582、随机误差：、
46、随机误差：是由于实验过程中各种偶然因素造成同一样品多是由于实验过程中各种偶然因素造成同一样品多是由于实验过程中各种偶然因素造成同一样品多是由于实验过程中各种偶然因素造成同一样品多次测定的结果不一致。次测定的结果不一致。次测定的结果不一致。次测定的结果不一致。误差的出现是随机的，与真实值的偏离是双向性误差的出现是随机的，与真实值的偏离是双向性误差的出现是随机的，与真实值的偏离是双向性误差的出现是随机的，与真实值的偏离是双向性的，可大可小。的，可大可小。的，可大可小。的，可大可小。 随机误差无法避免。随机误差无法避免。随机误差无法避免。随机误差无法避免。5959（二）质量控制（二）质量控制 质量控
47、制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。水平。水平。水平。具体作用有：具体作用有：具体作用有：具体作用有：1 1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定
48、测定结果的取舍。2 2识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。3 3改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。 6060（三）（三）RIA质量控制指标质量控制指标包括实验室内部质量控制和实验室间的质量控制。包括实验室内部质量控制和实验室间的质量控制。包括实验室内部质量控制和实验室间的质量控制。包括实验室内部质量控制和实验室间的质量控制。实验室内部的质量控制侧重于对检测质量的控制，保证从样品实验室内部的质量控制侧重于对检测质量的控制，保证从样品实验
49、室内部的质量控制侧重于对检测质量的控制，保证从样品实验室内部的质量控制侧重于对检测质量的控制，保证从样品收集到发出结果报告的整个过程中能及时发现各种误差，并分收集到发出结果报告的整个过程中能及时发现各种误差，并分收集到发出结果报告的整个过程中能及时发现各种误差，并分收集到发出结果报告的整个过程中能及时发现各种误差，并分析原因，找出纠正的方法。析原因，找出纠正的方法。析原因，找出纠正的方法。析原因，找出纠正的方法。质量控制的指标包括：质量控制的指标包括：质量控制的指标包括：质量控制的指标包括：精密度、准确度、灵敏度、特异性、稳定性精密度、准确度、灵敏度、特异性、稳定性精密度、准确度、灵敏度、特异
50、性、稳定性精密度、准确度、灵敏度、特异性、稳定性61611、精密度（、精密度（precision）：）：精密度是指在一定条件下，同一实验方法对同一样品多次重精密度是指在一定条件下，同一实验方法对同一样品多次重精密度是指在一定条件下，同一实验方法对同一样品多次重精密度是指在一定条件下，同一实验方法对同一样品多次重复测定所得到的结果之间的离散程度，即结果的一致性。复测定所得到的结果之间的离散程度，即结果的一致性。复测定所得到的结果之间的离散程度，即结果的一致性。复测定所得到的结果之间的离散程度，即结果的一致性。主要反映随机误差的大小。主要反映随机误差的大小。主要反映随机误差的大小。主要反映随机误差
51、的大小。主要用变异系数或绘制精密度图的方法来评价。主要用变异系数或绘制精密度图的方法来评价。主要用变异系数或绘制精密度图的方法来评价。主要用变异系数或绘制精密度图的方法来评价。62622、准确度（、准确度（accuracy）：）：是指测量值与真值的符合程度，其偏离真值的误差就叫做是指测量值与真值的符合程度，其偏离真值的误差就叫做是指测量值与真值的符合程度，其偏离真值的误差就叫做是指测量值与真值的符合程度，其偏离真值的误差就叫做偏差。偏差。偏差。偏差。在实际工作中我们用设置质控样品、测定回收率或进行健在实际工作中我们用设置质控样品、测定回收率或进行健在实际工作中我们用设置质控样品、测定回收率或进
52、行健在实际工作中我们用设置质控样品、测定回收率或进行健全性评价的方法来判断准确度。全性评价的方法来判断准确度。全性评价的方法来判断准确度。全性评价的方法来判断准确度。 6363（1）质量控制样品）质量控制样品质量控制样品是含有已知剂量待测物的血清样本。质量控制样品是含有已知剂量待测物的血清样本。质量控制样品是含有已知剂量待测物的血清样本。质量控制样品是含有已知剂量待测物的血清样本。质控样品和待测样品为同一种物质，具有相同的生物和免质控样品和待测样品为同一种物质，具有相同的生物和免质控样品和待测样品为同一种物质，具有相同的生物和免质控样品和待测样品为同一种物质，具有相同的生物和免疫活性。疫活性。
53、疫活性。疫活性。质控样品的浓度应准确定量并有合理的浓度范围。通常是质控样品的浓度应准确定量并有合理的浓度范围。通常是质控样品的浓度应准确定量并有合理的浓度范围。通常是质控样品的浓度应准确定量并有合理的浓度范围。通常是根据待测物在人体血清内的正常浓度制定高、中、低三个根据待测物在人体血清内的正常浓度制定高、中、低三个根据待测物在人体血清内的正常浓度制定高、中、低三个根据待测物在人体血清内的正常浓度制定高、中、低三个剂量水平的质控样品。剂量水平的质控样品。剂量水平的质控样品。剂量水平的质控样品。使用时将质控样品分置在待测样品的不同位置中同时检测。使用时将质控样品分置在待测样品的不同位置中同时检测。
54、使用时将质控样品分置在待测样品的不同位置中同时检测。使用时将质控样品分置在待测样品的不同位置中同时检测。6464（2）回收率的测定：）回收率的测定： 设置回收管和对照管，在对照管中加入待测样品，回收管设置回收管和对照管，在对照管中加入待测样品，回收管设置回收管和对照管，在对照管中加入待测样品，回收管设置回收管和对照管，在对照管中加入待测样品，回收管中加入等量待测样品和已知量的分析物，经过反应后计算其回中加入等量待测样品和已知量的分析物，经过反应后计算其回中加入等量待测样品和已知量的分析物，经过反应后计算其回中加入等量待测样品和已知量的分析物，经过反应后计算其回收率。收率。收率。收率。 一般的回
55、收率的要求是一般的回收率的要求是一般的回收率的要求是一般的回收率的要求是9090110110。6565（3）健全性评价：）健全性评价：主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品稀释曲用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品稀释曲用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品稀释曲用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品稀释曲线，如果样品与标准品免疫活性相同，得到的曲线应该是线，如果样品与标准品免疫
56、活性相同，得到的曲线应该是线，如果样品与标准品免疫活性相同，得到的曲线应该是线，如果样品与标准品免疫活性相同，得到的曲线应该是一组平行的曲线，所以又称为平行性实验。一组平行的曲线，所以又称为平行性实验。一组平行的曲线，所以又称为平行性实验。一组平行的曲线，所以又称为平行性实验。 66663、灵敏度（、灵敏度（sensitivity）：）：是指是指是指是指RIARIA方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在统计学方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在统计学方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在统计学方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在统计学上区别开来的抗原最低剂量，即该上区别开来的抗原最低剂量，即该上区
57、别开来的抗原最低剂量，即该上区别开来的抗原最低剂量，即该RIARIA方法的最小可检测方法的最小可检测方法的最小可检测方法的最小可检测量。量。量。量。确定灵敏度的方法主要有：确定灵敏度的方法主要有：确定灵敏度的方法主要有：确定灵敏度的方法主要有： 同一样品同一样品同一样品同一样品1010次测量结果的次测量结果的次测量结果的次测量结果的B/B0B/B09090的剂量的平均值作为的剂量的平均值作为的剂量的平均值作为的剂量的平均值作为最小可测量。最小可测量。最小可测量。最小可测量。 以以以以1010次测量结果的次测量结果的次测量结果的次测量结果的B0B0管结合率均值减去管结合率均值减去管结合率均值减去
58、管结合率均值减去2SD2SD（标准差）的（标准差）的（标准差）的（标准差）的结合率的剂量对应值为最小可测量。结合率的剂量对应值为最小可测量。结合率的剂量对应值为最小可测量。结合率的剂量对应值为最小可测量。67674 4、特异性：、特异性：、特异性：、特异性： 方法的特异性主要取决于抗体的特异性。方法的特异性主要取决于抗体的特异性。方法的特异性主要取决于抗体的特异性。方法的特异性主要取决于抗体的特异性。 用抗用抗用抗用抗体的交叉反应率来表示。体的交叉反应率来表示。体的交叉反应率来表示。体的交叉反应率来表示。5 5、稳定性：、稳定性：、稳定性：、稳定性： 测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各个
59、测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各个测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各个测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各个参数的稳定性来间接反映。参数的稳定性来间接反映。参数的稳定性来间接反映。参数的稳定性来间接反映。 如标准曲线的斜率和截距，零标准管结合率的如标准曲线的斜率和截距，零标准管结合率的如标准曲线的斜率和截距，零标准管结合率的如标准曲线的斜率和截距，零标准管结合率的75%75%、50%50%、25%25%处的剂量值处的剂量值处的剂量值处的剂量值(ED(ED7575、EDED5050、EDED2525等等等等) )。 6868七、七、RIA的方法学的方法学（一）反应方式：（一）反
60、应方式：（一）反应方式：（一）反应方式：1 1、平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、标、平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、标、平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、标、平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、标记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。优点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体有相同优点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体有相同优点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体有相同优点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体有相同的反应几率，操作方便，精密度较好，稳定性好。的反应
61、几率，操作方便，精密度较好，稳定性好。的反应几率，操作方便，精密度较好，稳定性好。的反应几率，操作方便，精密度较好，稳定性好。缺点：反应时间长，灵敏度较差缺点：反应时间长，灵敏度较差缺点：反应时间长，灵敏度较差缺点：反应时间长，灵敏度较差69692 2、顺顺顺顺序序序序加加加加样样样样法法法法：先先先先将将将将非非非非标标标标记记记记抗抗抗抗原原原原与与与与抗抗抗抗体体体体温温温温育育育育反反反反应应应应一一一一定定定定时时时时间间间间（6 62424小小小小时时时时），形形形形成成成成抗抗抗抗原原原原抗抗抗抗体体体体复复复复合合合合物物物物后后后后，然然然然后后后后再再再再加加加加入入入入标
62、标标标记记记记抗抗抗抗原原原原短短短短时时时时间间间间（1 14 4小小小小时时时时）温温温温育育育育后后后后中中中中止止止止反反反反应。应。应。应。优优优优点点点点：使使使使非非非非标标标标记记记记抗抗抗抗原原原原与与与与抗抗抗抗体体体体结结结结合合合合的的的的几几几几率率率率比比比比标标标标记记记记抗抗抗抗原原原原高高高高，提提提提高高高高了了了了非非非非标标标标记记记记抗抗抗抗原原原原的的的的竞竞竞竞争争争争能能能能力力力力，提提提提高高高高了了了了方方方方法法法法的的的的灵敏度。灵敏度。灵敏度。灵敏度。 7070（二）反应介质：（二）反应介质：（二）反应介质：（二）反应介质：1 1、缓
63、冲液：、缓冲液：、缓冲液：、缓冲液：(pH(pH值：值：值：值：7.47.47.87.8) )缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液为为为为RIARIA提提提提供供供供一一一一个个个个适适适适合合合合的的的的反反反反应应应应环环环环境境境境，是是是是RIARIA成成成成败败败败的的的的关关关关键键键键。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液，常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液，常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液，常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液，Tris-HCLTris-HCL缓冲液等。缓冲液等。缓冲液等。缓冲液等。2 2、离子强度：、离子强度：、离子强度：、离子强度：0.050.050.10.1mol/lmol/l离离离离子子子子强强强强
64、度度度度过过过过高高高高会会会会抑抑抑抑制制制制抗抗抗抗原原原原抗抗抗抗体体体体反反反反应应应应，过过过过低低低低会会会会降降降降低低低低缓缓缓缓冲冲冲冲能能能能力力力力，引起反应系统引起反应系统引起反应系统引起反应系统PHPH值的变化，同样会影响抗原抗体反应。值的变化，同样会影响抗原抗体反应。值的变化，同样会影响抗原抗体反应。值的变化，同样会影响抗原抗体反应。 71713、添加剂：、添加剂：0.50.5牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、抗体的吸附。抗体的吸附。抗体的吸附。抗体
65、的吸附。0.010.01mol/l EDTAmol/l EDTA钠盐：多功能的螯合剂，可以去除钠盐：多功能的螯合剂，可以去除钠盐：多功能的螯合剂，可以去除钠盐：多功能的螯合剂，可以去除样品中的钙镁离子。样品中的钙镁离子。样品中的钙镁离子。样品中的钙镁离子。0.050.05叠氮钠：防腐剂。叠氮钠：防腐剂。叠氮钠：防腐剂。叠氮钠：防腐剂。 7272（三）反应的温度和时间（三）反应的温度和时间温度升高，抗原抗体结合的亲和力要下降，温度每温度升高，抗原抗体结合的亲和力要下降，温度每温度升高，抗原抗体结合的亲和力要下降，温度每温度升高，抗原抗体结合的亲和力要下降，温度每升高升高升高升高1010，抗原抗体
66、结合达到平衡的速度约提高一，抗原抗体结合达到平衡的速度约提高一，抗原抗体结合达到平衡的速度约提高一，抗原抗体结合达到平衡的速度约提高一倍，达到平衡的时间缩短，反应时间缩短。倍，达到平衡的时间缩短，反应时间缩短。倍，达到平衡的时间缩短，反应时间缩短。倍，达到平衡的时间缩短，反应时间缩短。温度降低，亲和常数提高，增加了反应的灵敏度。温度降低，亲和常数提高，增加了反应的灵敏度。温度降低，亲和常数提高，增加了反应的灵敏度。温度降低，亲和常数提高，增加了反应的灵敏度。 7373（四）操作基本步骤（四）操作基本步骤RIARIA的操作一般包括加样、孵育、分离、测量和数据处理的操作一般包括加样、孵育、分离、测
67、量和数据处理的操作一般包括加样、孵育、分离、测量和数据处理的操作一般包括加样、孵育、分离、测量和数据处理5 5个部分。个部分。个部分。个部分。 1. 1.加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。2. 2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是孵育：根据不同的
68、分析对象孵育的温度和时间不同，一般是3737。3. 3.分离：选择好的分离方法进行分离。分离：选择好的分离方法进行分离。分离：选择好的分离方法进行分离。分离：选择好的分离方法进行分离。4. 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。测量：测量游离或结合物部分的放射性。测量：测量游离或结合物部分的放射性。测量：测量游离或结合物部分的放射性。5. 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。 7474免疫放射分析免疫放射分析immunoradiometric assay,
69、IRMA7575*Ab+Ag-*Ab + *AbAg（B）（F）在体外条件下在体外条件下, 利用利用Ag与过量的与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术。量的一种超微量分析技术。基本原理7676基本原理基本原理免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应，是用过量的免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应，是用过量的免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应，是用过量的免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应，是用过量的放射性标记抗体来测定样品中的抗原，其中标记抗体是过量放射性标记抗体来测定样品
70、中的抗原，其中标记抗体是过量放射性标记抗体来测定样品中的抗原，其中标记抗体是过量放射性标记抗体来测定样品中的抗原，其中标记抗体是过量的，抗原全部是非标记的。的，抗原全部是非标记的。的，抗原全部是非标记的。的，抗原全部是非标记的。 将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗体与抗原结合，反将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗体与抗原结合，反将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗体与抗原结合，反将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗体与抗原结合，反应平衡后，用分离方法除去多余的抗体，测量抗原应平衡后，用分离方法除去多余的抗体，测量抗原应平衡后，用分离方法除去多余的抗体，测量抗原应平衡后，用分离方法除去多余的
71、抗体，测量抗原- -标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体复合物的放射性。利用抗原复合物的放射性。利用抗原复合物的放射性。利用抗原复合物的放射性。利用抗原- -标记抗体复合物的放射性活度与标记抗体复合物的放射性活度与标记抗体复合物的放射性活度与标记抗体复合物的放射性活度与抗原剂量之间的函数关系来测定待测抗原的量。抗原剂量之间的函数关系来测定待测抗原的量。抗原剂量之间的函数关系来测定待测抗原的量。抗原剂量之间的函数关系来测定待测抗原的量。 7777IRMA的基本方法的基本方法根据根据根据根据IRMAIRMA的分离方法一般可以分为：的分离方法一般可以分为：的分离方法一般可以分为：的分离方法一般可以分为：
72、1 1、双抗夹心法、双抗夹心法、双抗夹心法、双抗夹心法: :（最常用）（最常用）（最常用）（最常用） 将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体先于抗原反应，形成固相抗体抗原复合物，再与标记抗体反先于抗原反应，形成固相抗体抗原复合物，再与标记抗体反先于抗原反应，形成固相抗体抗原复合物，再与标记抗体反先于抗原反应，形成固相抗体抗原复合物，再与标记抗体反应，形成固相抗体抗原标记抗体复合物附着在管壁上，倾应，形成固相抗体抗原标记抗体复合物附着在
73、管壁上，倾应，形成固相抗体抗原标记抗体复合物附着在管壁上，倾应，形成固相抗体抗原标记抗体复合物附着在管壁上，倾去上清液直接测量反应容器的放射性。去上清液直接测量反应容器的放射性。去上清液直接测量反应容器的放射性。去上清液直接测量反应容器的放射性。 78787979 2 2、标记第三抗体法：、标记第三抗体法：、标记第三抗体法：、标记第三抗体法： 用双抗夹心法中的第二抗体（标记抗体）作为抗原免疫其用双抗夹心法中的第二抗体（标记抗体）作为抗原免疫其用双抗夹心法中的第二抗体（标记抗体）作为抗原免疫其用双抗夹心法中的第二抗体（标记抗体）作为抗原免疫其他的动物获得的抗体为第三抗体。反应后得到固相抗体抗原他
74、的动物获得的抗体为第三抗体。反应后得到固相抗体抗原他的动物获得的抗体为第三抗体。反应后得到固相抗体抗原他的动物获得的抗体为第三抗体。反应后得到固相抗体抗原第二抗体标记第三抗体的复合物。第二抗体标记第三抗体的复合物。第二抗体标记第三抗体的复合物。第二抗体标记第三抗体的复合物。 一般第三抗体是由兔抗鼠一般第三抗体是由兔抗鼠一般第三抗体是由兔抗鼠一般第三抗体是由兔抗鼠IgGIgG的抗血清制成的，对于所有的抗血清制成的，对于所有的抗血清制成的，对于所有的抗血清制成的，对于所有使用小鼠使用小鼠使用小鼠使用小鼠IgGIgG作为第二抗体的反应系统都能形成抗原抗体复合作为第二抗体的反应系统都能形成抗原抗体复合
75、作为第二抗体的反应系统都能形成抗原抗体复合作为第二抗体的反应系统都能形成抗原抗体复合物，又称为通用性标记抗体。物，又称为通用性标记抗体。物，又称为通用性标记抗体。物，又称为通用性标记抗体。 80803 3、生物素亲和素系统：、生物素亲和素系统：、生物素亲和素系统：、生物素亲和素系统： 一个抗体分子可以连接多个生物素分子，而每一个生物素一个抗体分子可以连接多个生物素分子，而每一个生物素一个抗体分子可以连接多个生物素分子，而每一个生物素一个抗体分子可以连接多个生物素分子，而每一个生物素分子都可以连接一个亲和素且连接很紧密。用放射性核素标记分子都可以连接一个亲和素且连接很紧密。用放射性核素标记分子都
76、可以连接一个亲和素且连接很紧密。用放射性核素标记分子都可以连接一个亲和素且连接很紧密。用放射性核素标记亲和素，可以使这个亲和素，可以使这个亲和素，可以使这个亲和素，可以使这个IRMAIRMA系统的灵敏度大大提高。系统的灵敏度大大提高。系统的灵敏度大大提高。系统的灵敏度大大提高。 8181IRMA和和RIA的区别的区别 1 1、反应机制不同：、反应机制不同：、反应机制不同：、反应机制不同： RIARIA是竞争性反应；是竞争性反应；是竞争性反应；是竞争性反应；IRMAIRMA是非竞争性反应是非竞争性反应是非竞争性反应是非竞争性反应2 2、反应试剂：、反应试剂：、反应试剂：、反应试剂： RIARIA
77、主要试剂有三种，标记的是抗原；主要试剂有三种，标记的是抗原；主要试剂有三种，标记的是抗原；主要试剂有三种，标记的是抗原； IRMAIRMA主要试剂只有两种，标记的是抗体。主要试剂只有两种，标记的是抗体。主要试剂只有两种，标记的是抗体。主要试剂只有两种，标记的是抗体。 82823 3、分离方法不同：、分离方法不同：、分离方法不同：、分离方法不同： IRMAIRMA需要需要需要需要2 2个或个或个或个或2 2个以上的抗原决定簇；个以上的抗原决定簇；个以上的抗原决定簇；个以上的抗原决定簇； RIARIA只需要一个抗原决定簇。只需要一个抗原决定簇。只需要一个抗原决定簇。只需要一个抗原决定簇。4 4、剂
78、量关系：、剂量关系：、剂量关系：、剂量关系： 待测抗原复合物的放射性在待测抗原复合物的放射性在待测抗原复合物的放射性在待测抗原复合物的放射性在RIARIA中于待测抗原的量呈负相关；中于待测抗原的量呈负相关；中于待测抗原的量呈负相关；中于待测抗原的量呈负相关； 在在在在IRMAIRMA中呈正相关。中呈正相关。中呈正相关。中呈正相关。 83835 5、反应中的、反应中的、反应中的、反应中的NSBNSB： 在在在在RIARIA主要影响高剂量反应；主要影响高剂量反应；主要影响高剂量反应；主要影响高剂量反应； 在在在在IRMAIRMA中主要影响低剂量反应。中主要影响低剂量反应。中主要影响低剂量反应。中主
79、要影响低剂量反应。 拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSBIRMA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线RIA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线8484RIARIAIRMAIRMA竞争性抗原抗体结合反应竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗原采用标记抗体采用标记抗体三种主要反应试剂三种主要反应试剂二种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是限量的所用抗体是过量的所用抗体是过量的AgAbAgAb的量与待测的量与待测AgAg的量呈负相关的量呈负相
80、关 AgAbAgAb的量与待测的量与待测AgAg的量呈正相关的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡慢反应到达平衡快反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素低剂量区无不确定因素IRMA与与RIA工作原理的主要区别工作原理的主要区别8585IRMA在实际应用中的特点在实际应用中的特点标记物的稳定性好：标记的是抗体标记物的稳定性好：标记的是抗体标记物的稳定性好：标记的是抗体标记物的稳定性好：标记的是抗体IgGIgG蛋白分子，含有多个蛋白分子，含有多个蛋白分子，含有
81、多个蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。反应动力学：非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应动力学：非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应动力学：非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应动力学：非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。8686灵敏度：理
82、论上比灵敏度：理论上比灵敏度：理论上比灵敏度：理论上比RIARIA高出高出高出高出1010100100倍。但是要求有良好的倍。但是要求有良好的倍。但是要求有良好的倍。但是要求有良好的分离方法的保证。分离方法的保证。分离方法的保证。分离方法的保证。特异性：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较特异性：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较特异性：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较特异性：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较高。高。高。高。加样误差：由于抗体是过量的，所以在加样误差：由于抗体是过量的，所以在加样误差：由于抗体是过量的，所以在加样误差：由于抗体是过量的，所以在I
83、RMAIRMA的加样误差主的加样误差主的加样误差主的加样误差主要来自抗原一个环节。而要来自抗原一个环节。而要来自抗原一个环节。而要来自抗原一个环节。而RIARIA的抗体、待测抗原、标记抗的抗体、待测抗原、标记抗的抗体、待测抗原、标记抗的抗体、待测抗原、标记抗原都可能产生加样误差。原都可能产生加样误差。原都可能产生加样误差。原都可能产生加样误差。8787优点：是非竞争性反应，灵敏度明显高于优点：是非竞争性反应，灵敏度明显高于优点：是非竞争性反应，灵敏度明显高于优点：是非竞争性反应，灵敏度明显高于RIARIA。缺点：需要特殊的分离方法。缺点：需要特殊的分离方法。缺点：需要特殊的分离方法。缺点：需要
84、特殊的分离方法。 由于由于由于由于IRMAIRMA中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体作为分离剂，因此在作为分离剂，因此在作为分离剂，因此在作为分离剂，因此在IRMAIRMA系统中需要两种抗体，至少需要两系统中需要两种抗体，至少需要两系统中需要两种抗体，至少需要两系统中需要两种抗体，至少需要两个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。 8888
