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1、双酶切及连接双酶切及连接目录原理类型命名法实验注意事项连接常见问题及对策IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如双链，产生平头末端。例如EcoEcoRV RV 的识别位置是：的识别位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT ATC 35 GAT ATC 33 CTA TAG 5 3 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过这种末端同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：v用用属属名名的的头头一一个个字字
2、母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称，如如E. E. colicoli 用用EcoEco表示，所以用斜体字。表示，所以用斜体字。v用用一一个个字字母母代代表表菌菌株株或或型型，如如流流感感嗜嗜血血菌菌( (Heamophilus Heamophilus influenzaeinfluenzae)Rd)Rd菌菌株株用用d d，即即HinHind d。v如如果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株，具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰酶酶，则则以以罗罗马马数数字字表表示示，如如HinHind, d, HinHindd，HinHindd等。等。
3、 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法实验材料及仪器 高速离心机，电炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪头，Ep管，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，质粒DNA双酶切双酶切无菌水无菌水0.8L10x缓冲液2L质粒16LBgl I0.6LSal II0.6L共20L 按如下体系加入到0.5ml离心管中加体系离心37 水浴1h跑电泳结果结果与分析结果与分析 质粒的双酶切没有出现结果但质粒的双酶切没有出现结果但marker出了出了条带说明胶没有问题，而条带说明胶没有问题，而PCR的酶切产物的酶切产物出现了较好的实验结果。出现了较
4、好的实验结果。内切酶：内切酶：n不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；n 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；n内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定。内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定。n同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；n 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。对内切酶的污染。五、
5、注意事项五、注意事项五、注意事项五、注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切连接反应DNA分子的体外连接（重组）是指外源分子的体外连接（重组）是指外源DNA片段和载体片段和载体DNA分子在体外通过分子在体外通过DNA连接酶共价连接。连接酶共价连接。DNA酶切片段的联接是两酶切片段的联接是两DNA片段相邻的片段相邻的5磷酸和磷酸和3羟基间可由联接酶催化形成磷酸羟基间可由联接酶催化形成磷酸二酯键，即能完成联接反应。二酯键，即能完成联接反应。连接体系10Buffer2.5L载体1LDNA10LT4酶1L无菌水10.5L共25L1.1.内切酶失活内切酶失活2.2.DNA
6、DNA不纯，含有不纯，含有SDSSDS，酚，酚，EDTAEDTA等内切酶抑制因子等内切酶抑制因子3.3.条件不适（试剂、温度）条件不适（试剂、温度）4.4.DNADNA酶切位点上的碱基被甲酶切位点上的碱基被甲基化基化5.5.DNADNA酶切位点上没有甲基化酶切位点上没有甲基化（如（如Dpn IDpn I）6.6.DNADNA位点上存在其它修饰位点上存在其它修饰7.7.DNADNA不存在该酶识别顺序不存在该酶识别顺序1.1.标准底物检测酶活性标准底物检测酶活性2.2.将将DNADNA过柱纯化，乙醇沉淀过柱纯化，乙醇沉淀DNADNA3.3.检查反应系统是否最佳检查反应系统是否最佳4.4.换用对换用
7、对DNADNA甲基化不敏感的同裂酶甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒酶解，重新将质粒DNADNA转化至转化至dcm-dcm-，dam-dam-基因型的细菌菌株基因型的细菌菌株5.5.换用不同切割非甲基化位点的同裂换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化酶消化DNADNA（如（如San3A ISan3A I代替代替Dpn I)Dpn I)，重新将质粒转至，重新将质粒转至dcm+ dam+dcm+ dam+菌株菌株中扩增中扩增6.6.将将DNADNA底物与底物与DANDAN混匀进行切割验混匀进行切割验证证7.7.换用其它的酶切割换用其它的酶切割DNADNA或过量酶消或过量酶消化进行验证化进行验证六、
8、六、六、六、限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析q问题一：问题一：DNADNA完全没有被内切酶切割完全没有被内切酶切割原原 因因对对策策1.1.内切酶活性下降内切酶活性下降2.2.内切酶稀释不正确内切酶稀释不正确3.3.DNADNA不纯，反应条件不佳不纯，反应条件不佳4.4.内切酶识别的内切酶识别的DNADNA位点上的碱位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰基被甲基化或存在其它修饰5.5.部分部分DNADNA溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上6.6.内切酶溶液粘度大，取样不准内切酶溶液粘度大，取样不准7.7.酶切后酶切后DNAD
9、NA粘末端退火粘末端退火8.8.由于反应溶液、温度、强烈振由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性荡使内切酶变性9.9.过度稀释使酶活性降低过度稀释使酶活性降低10.10.反应条件不适反应条件不适11.11.识别位点两侧插入了可影响酶识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序切效率的核酸顺序1.1.用用5-105-10倍量过量消化倍量过量消化2.2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.3.同上同上4.4.同上同上5.5.反应前离心数秒反应前离心数秒6.6.将内切酶稀释，增大取样体积将内切酶稀释，增大取样体积7.7.电泳前将样品置电泳前将样品置6565保温保温5-105-10分分钟，取出后置冰浴骤冷钟，取出后置冰浴骤冷8.8.使用标准反应缓冲液及温度，避使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡免强烈振荡9.9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏不能贮藏10.10.使用最佳反应体系使用最佳反应体系11.11.加大酶量加大酶量5-105-10倍倍q问题二：问题二：DNADNA切割不完全切割不完全 原原因因对对策策六、六、六、六、限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析谢谢谢谢结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！21
