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1、课本知识回顾 基因工程又叫做 或 。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 提取出来，加以 ，然后放到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。基因拼接技术基因拼接技术DNA重组技术重组技术基因基因修饰改造修饰改造定向地定向地DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀” “分子缝合针分子缝合针” “分子运输车分子运输车” 限制酶限制酶DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n n主要是从主要是从 的一种酶。的一种酶。n n识别双链识别双链DNA 分子的某种分子的某种 并且使每一
2、条链中并且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的n n 断开。断开。n n形成两种末端形成两种末端原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端粘性末端平末端平末端二、二、二、二、 “ “分子缝合针分子缝合针分子缝合针分子缝合针” ” DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体通常有三种:在进行基因工程操
3、作中,真正被用作载体的质粒都是在 基础上进行过 的质粒质粒噬菌体衍生物噬菌体衍生物动植物病毒动植物病毒天然质粒天然质粒人工改造人工改造基因基因的结构的结构 原核细胞的基因结构原核细胞基因原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的编码区下游的DNA序列，虽不序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等序列，如启动子、终止子等原核
4、细胞的基因结构 RNA聚合酶的作用是催化聚合酶的作用是催化DNA转录为转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNA聚合酶沿聚合酶沿DNA分子移动，并分子移动，并与与DNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNA。真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开
5、来，成为一种断裂的形式。为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子外显子，一般不，一般不能够编码蛋白质的序列叫做能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子。真核细胞的基因结构真核细胞基因真核细胞基因编码区编码区（间隔、不连续）（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质外显子：能编码蛋白质的的DNA序列序列内含子：不能编码蛋白内含子：不能编码蛋白质的质的DNA序列序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子动子、终止子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是连续的连续的
6、编码区是间隔编码区是间隔的、不连续的的、不连续的相同点相同点都由能够编码蛋白质的编都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非码区和具有调控作用的非编码区组成的编码区组成的基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。调节基因。（2）没有转译产物的基因：如）没有转译产物的基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因。基因。（3）不能转录的）不能转录的DNA片段：如操纵基因。片段：如操纵基因。启动子与终止子 启动子是在非编码区内紧靠转录起点，启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导
7、引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点，终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNA模模板链上脱离下来，使转录终止。板链上脱离下来，使转录终止。基因工程的基本操作流程获取目的基因n从基因文库中获取从基因文库中获取n利用利用PCR技术扩增技术扩增n利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成基因组文库和部分基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库部
8、分基因文库基因组文库和部分基因文库cDNA合成过程 n第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。n第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链链降解，使之变成单链的降解，使之变成单链的DNA。n第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。 利用PCR技术扩增目的基因原理原理:DNA双链复制双链复制前提前提:要有一段已知要有一段已
9、知目的基因的脱目的基因的脱氧核苷酸序列，氧核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。构建表达载体表达载体的组成表达载体的组成1.目的基因目的基因2.启动子启动子3.终止子终止子4.标记基因标记基因基因工程载体的构建需要考虑哪些因素 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产。基因的产物如果是一个糖
10、蛋白，那么该基因在原核生物细菌物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要
11、选择种子中特异表达如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。正的转基因生物。 将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法将目的基因导入受体细胞（动物细胞）n显微注射法显微注射法将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）nCa2+处理处理目的基因的检测与鉴定n检测检测:n是否插入目的基因是否插入目的基因n是否转录是否转录n是否翻译是否翻译n鉴定鉴定:n功能活性鉴定功能活性鉴定n抗性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归
12、纳步骤归纳: 基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译基因操作的基本步骤1、基因工程又叫做基因工程又叫做 _ _ 或或_。基因工程基因工程基因拼接技术基因拼接技术DNA重组技术重组技术2、基本工
13、具：、基本工具： “分子手术刀分子手术刀” “分子缝合针分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体3、基本操作步骤：基本操作步骤：运载体运载体运载体运载体 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 1 1、目的基因的获取、目的基因的获取 2 2、基因表达载体的构建（核心）、基因表达载体的构建（核心）3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定 黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一种限制性内切酶只能一种限制性内切酶只能识别识别双
14、链双链DNA分子的某种特分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开（断开（切割切割DNA分子）分子）来源：来源：主要从原核细胞分离主要从原核细胞分离 作用：作用： 作用结果：作用结果：作用结果：作用结果：EcoRI重难点剖析重难点剖析基因工程的基因工程的“专用工具专用工具”平未端（平未端（SmaI）及粘性未端）及粘性未端（EcoRI）1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：Ecoli DNA连接酶连接酶（黏性末端）（黏性末端）T4 DNA连接酶连接酶 （黏性末端和平末端）（黏性末端
15、和平末端）磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的个重组的DNA分子就形成了。分子就形成了。 DNA DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针” 分子运载车分子运载车运载体运载体（1 1） 作用：作用：将目的基因送入受体细胞将目的基因送入受体细胞（2 2） 具备的条件：具备的条件：a.a.能自我复制能自我复制. .b.b.有切割位点有切割位点. .c.c.有标记基因有标记基因. .d.d.对受体细胞无害对受体细胞无害. .质粒、噬菌体、动植物病
16、毒质粒、噬菌体、动植物病毒（3 3）种类：）种类：质粒质粒细菌拟细菌拟核核DNADNA外能外能自主自主复制复制的很小的的很小的环环状状DNADNA分子分子（一）目的基因的提取（一）目的基因的提取目的基因：主要是目的基因：主要是_ 。获取方法：获取方法：1、_中获取目的基因中获取目的基因2、人工合成法：化学方法合成、人工合成法：化学方法合成DNA片段（片段（DNA合成仪）合成仪）3、 PCR反应扩增反应扩增DNA基本操作步骤基本操作步骤从基因文库从基因文库编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因 原理：原理：DNADNA复制复制 过程：加热过程：加热DNADNA解链解链 冷却引物结合到互补冷却引
17、物结合到互补DNADNA链链 互补链合成互补链合成 条件条件 ：耐高温：耐高温DNADNA聚合酶聚合酶 基因文库的构建基因文库的构建提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库某种生物的某种生物的mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库逆转录逆转录（二）基因表达载体构建二）基因表达载体构建1、基因表达载体由、基因表
18、达载体由_、_、_、_四部分组成。四部分组成。目的基因目的基因启动子启动子标记基因标记基因 终止子终止子2、启动子作用：、启动子作用：3、标记基因的作用：、标记基因的作用：RNA聚合酶识别和结合的位点聚合酶识别和结合的位点 鉴别受体细胞中是否含有目的基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因 筛选出含目的基因的细胞筛选出含目的基因的细胞（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目的基因，使其产生 _。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶重组质粒形成过程:导入植物导入植
19、物 细胞：细胞：（三）将目的基因导入受体细胞导入动物导入动物 细胞：细胞：导入微生物细胞：导入微生物细胞：受体细胞受体细胞 导入方法导入方法体细胞体细胞 受精卵受精卵受精卵受精卵 显微注射法显微注射法Ca2处理法处理法农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法将目的基因导入微生物细胞 原核生物原核生物繁殖繁殖_、多为、多为_细细胞、遗传物质相对较胞、遗传物质相对较_，故早期，故早期常作为受体细胞。常作为受体细胞。大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞用用Ca2+处理处理感受态细胞感受态细胞重组表达载体重组表达载体DNA溶于缓冲液溶于缓冲液混合混合转入转入快快单单少少目的基因是否插入转基目的基因是否插入转基因生物染色体的因生物染色体的DNA：（四）目的基因的检测与鉴定四）目的基因的检测与鉴定目的基因是否表达目的基因是否表达：目的基因是否转录目的基因是否转录：方法方法: : DNADNA分子杂交分子杂交方法方法: : 分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗原抗体杂交抗原抗体杂交鉴定鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测检测
