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1、荧光分析法第一节 概 述 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光(fluorescence)。 由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同，利用这个特性可以进的波长和发射光的波长也不同，利用这个特性可以进行物质的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，它所发行物质的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同，测量物质的荧光强度可对其进射的荧光强度就不同，测量物质的荧光强度可对其进行定量测定。行定量测定。 荧光分析法（荧光
2、分析法（fluorescence analysis）就是利）就是利用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。析的方法。 荧光分析法具有灵敏度高，比分光光度法高103104倍。线性范围宽，方法简便快速且选择性较好等多优点。近20年来，各式各样新型荧光分析仪不断问世，荧光分析法发展迅速，应用面日益拓宽，尤其是在生物试样的分析及生命科学研究方面（如DNA序列分析等）展现出广阔的前景。一、荧光的产生一、荧光的产生物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。分子吸收能量后，从基态最
3、低振动能级跃迁到第一电子激发分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约大约1010-15 -15 s s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态。可以通过以下几种途径释放能量返回基态。1. 1. 振动驰豫振动驰豫2. 2. 内转换内转换3. 3. 荧光荧光4. 4. 系间窜跃系间窜跃5. 5. 磷光磷光第一节 基本原理（一）荧光的检测 光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样
4、品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。 （二）激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。 1. 激发光谱 保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即
5、激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。 激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。2. 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。 三、影响荧光产生及荧光强度的因素影响荧光产生及荧光强度的因素（一）物质产生荧光的必要条件（一）物质产生荧
6、光的必要条件 一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构及所处的环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件： 1. 物质分子必须有强的紫外吸收（有*跃迁）； 2. 物质具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency）。荧光效率也称荧光量子产率，用f 表示。 可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常，kF 由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。（二）影响荧光及其强度的因素。（二）影响荧光及其强度的因素。跃跃迁迁类类型型：如如上上所所述述，物物质质必必须须在在紫紫外外可可见见区区有有强强吸吸收收和
7、和高高荧荧光光效效率率才才能能产产生生荧荧光光。具具有有 * * 跃跃迁迁的的分分子子才才有有强强吸吸收收。 * * 跃迁的跃迁的 大。大。共共轭轭效效应应：大大多多数数能能产产生生荧荧光光的的物物质质都都含含有有芳芳香香环环或或杂杂环环，具具有有共共轭轭的的 * 跃跃迁迁。其其共共轭轭程程度度愈愈大大，荧荧光光效效率率也也愈愈大大，且且最最大大激激发发和和发发射射波波长长都都向向长长波波长长方方向向移移动动，如如苯苯、萘萘、蒽三种物质。蒽三种物质。刚刚性性平平面面结结构构：当当荧荧光光分分子子共共轭轭程程度度相相同同时时，分分子子的的刚性和共平面性越大，荧光效率越大。刚性和共平面性越大，荧光
8、效率越大。 取代基团取代基团温度温度溶剂溶剂pH值值荧光熄灭荧光熄灭 由由于于荧荧光光物物质质分分子子间间或或与与其其它它物物质质相相互互作作用用，引引起起荧荧光光强强度度显显著著下下降降的的现现象象叫叫做做荧荧光光熄熄灭灭（quenchingquenching）或或猝猝灭灭。引引起起荧荧光光熄熄灭灭的的物物质质称称为为荧荧光光熄熄灭灭剂剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。 造成荧光熄灭的原因有多种：造成荧光熄灭的原因有多种：（1 1）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而
9、使荧光熄灭；）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭；（2 2）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物；）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物；（3 3）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态；）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态；（4）当当荧荧光光物物质质浓浓度度较较大大时时，激激发发态态分分子子和和基基态态分分子子发发生生碰碰撞撞，产产生生荧荧光光自自熄灭现象。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；熄灭现象。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；（5）溶溶液液中中溶溶解解的的氧氧分分子子能能引引起起几几乎乎所所有有的
10、的荧荧光光物物质质产产生生不不同同程程度度的的荧荧光光熄熄灭。灭。 荧光熄灭是荧光分析的不利因素。但是如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减小和熄灭剂的浓度呈线性关系，则可以利用这一性质建立熄灭剂的荧光分析法，称为荧光熄灭法。荧光熄灭法比直接荧光法更灵敏、更有选择性。例如铝-桑色素配合物的荧光强度因微量氟离子的存在而引起荧光熄灭，利用这种性质可测定样品中微量氟离子的含量，这时溶液的荧光强度和氟离子浓度成反比。 第二节第二节 定性定量分析定性定量分析一、荧光强度与溶液浓度的关系一、荧光强度与溶液浓度的关系 分光光度法是测定物质对光的吸收程度；荧光分光光度法是测定物质对光的吸收程度；荧光
11、分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后，物质分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后，物质本身所发射的荧光强度。当溶液中的荧光物质被入本身所发射的荧光强度。当溶液中的荧光物质被入射光激发后，可以在各个方向观察到荧光，由于激射光激发后，可以在各个方向观察到荧光，由于激发光一部分可透过溶液，所以在透射光方向观察荧发光一部分可透过溶液，所以在透射光方向观察荧光是不适宜的，一般是在与透射光垂直的方向观察光是不适宜的，一般是在与透射光垂直的方向观察荧光。荧光。 测定荧光强度时，要选择两个不同的波长：一测定荧光强度时，要选择两个不同的波长：一个是物质吸收的光，即激发光的波长；另一个是被个是物质吸收的光，即激
12、发光的波长；另一个是被激发物质发射的光，即荧光的波长。激发物质发射的光，即荧光的波长。在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度I If f与入射光的强度与入射光的强度IoIo、荧光量子效率、荧光量子效率f f 以及荧以及荧光物质的浓度光物质的浓度c c等有关，可表示为等有关，可表示为I If f=K=Kf fIobcIobc。 （式中（式中K K为比例常数，为比例常数，与仪器性能有关，与仪器性能有关，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，b b为液层厚度）。由此可见，当仪为液层厚度）。由此可见，当仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射
13、光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度的强度时，荧光强度 I If f与荧光物质的浓度与荧光物质的浓度c c成正比。（对于某种荧光物质成正比。（对于某种荧光物质的稀溶液，在一定的频率及强度的激发光照射下，当溶液的浓度足够小的稀溶液，在一定的频率及强度的激发光照射下，当溶液的浓度足够小使得对激发光的吸光度很低时，所测溶液的荧光强度才与该荧光物质的使得对激发光的吸光度很低时，所测溶液的荧光强度才与该荧光物质的浓度成正比。）浓度成正比。）当当abc0.05（即溶液很稀）时，（即溶液很稀）时，对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，即对一定的荧光物质的稀溶液（即对
14、一定的荧光物质的稀溶液（abc0.05），），在一定的温度下，当激发光的波长、强度和液在一定的温度下，当激发光的波长、强度和液层厚度都固定后，其荧光强度与该溶液的浓度层厚度都固定后，其荧光强度与该溶液的浓度成正比。这是荧光分析定量的基础。成正比。这是荧光分析定量的基础。第三节 仪器一、仪器的构造及原理仪器类型很多，基本结构相似，一般包括五部分：激仪器类型很多，基本结构相似，一般包括五部分：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。1. 光源 能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。二、仪器类型二、仪器类型 1
15、. 1. 光电荧光计光电荧光计 用滤光片作单色器（激发滤用滤光片作单色器（激发滤光片和荧光滤光片），溴钨灯或高压汞灯作光光片和荧光滤光片），溴钨灯或高压汞灯作光源，光电管为检测器。源，光电管为检测器。2. 2. 荧光分光光度计荧光分光光度计 用氙灯作光源、光栅作用氙灯作光源、光栅作单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激发光谱和荧光光谱。发光谱和荧光光谱。仪器光路示意图仪器光路示意图闪烁闪烁闪烁闪烁XeXe灯灯灯灯狭缝狭缝狭缝狭缝反光镜反光镜反光镜反光镜光栅光栅光栅光栅激激激激发发发发单单单单色色色色器器器器发发发发射射射射单单单单色色色色器器器器滤光片
16、滤光片滤光片滤光片反光镜反光镜反光镜反光镜棱镜棱镜棱镜棱镜 光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管（参比信号）（参比信号）（参比信号）（参比信号）液池液池液池液池 光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管（样品信号）（样品信号）（样品信号）（样品信号）参参参参比比比比检检检检测测测测器器器器 WGY-10型荧光分光光度计具有双单色器，可以记录物质型荧光分光光度计具有双单色器，可以记录物质的激光光谱和荧光光谱。采用计算机完成仪器的系统控制和数的激光光谱和荧光光谱。采用计算机完成仪器的系统控制和数据采集。其工作原理如下：据采集。其工作原理如下： 由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照
17、由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收集后。经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相集后。经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相应的电信号，经放大器放大反馈入应的电信号，经放大器放大反馈入A/D转换单元，将模拟电信转换单元，将模拟电信号转换成相应的数字量。并通过显示器或打印机显示记录下被号转换成相应的数字量。并通过显示器或打印机显示记录下被测样品的图谱。这就是荧光光度计的基本工作原理。测样品的图谱。这就是荧光光度计的基本工作原理。WGY-10荧光分光光度计仪
18、器的使用荧光分光光度计仪器的使用点击电脑桌面“WGY-10荧光分光光度计”的图标进入“WGY-10”友好界面。（此时分别进行激发光珊检零，激发光珊检索为起始波长，激发光珊检索为起始波长等一系列检索）约3分钟点击菜单栏“发射”图标先固定发射波长为400 nm，出现“正在检索发射波长，请稍等”如荧光强度大于50，负高压选95，荧光强度小于50，则选100工作模式：激发扫描起始波长：250终止波长：350负高压为：100（95）点击“单程”输入通道号，出现激发光谱（通道1）然后点击“读取数据”进入“自动寻峰”保存txt文件 清除当前（建立）在曲线上找最大激发波长297 nm 再选定激发波长297nm
19、（正在检索激发波长） 工作模式：发射扫描起始波长：350终止波长：500负高压为：100（90）点击“单程”输入通道号，出现发射光谱（通道2）然后点击“读取数据”进入“自动寻峰”保存txt文件 清除当前（建立）在曲线上找最大激发波长397 nm点击文件，选择保存。再选定发射波长397nm，起始波长改为250nm点击“单程”选择通道2。则出现水杨酸溶液的光谱图（含激发光谱和发射光谱）点击保存文本文件，在点确定，输入文件名，“保存”点击“工作”再点“定量测量”出现“定量测量-标准曲线”,点击“编辑”，修改浓度单位ug/mL，确定点击“添加”依次输入浓度0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0再分
20、别点击“本底测量”、“单项测量”最后点击“计算标准曲线”最后“样品测量”。后期作图1.打开origin软件x.txt找到已保存的文件（两个通道）AddOK 点击 Add AddOK。出现光谱图2.双击X AXTS TITLE，出现对话框，改为x/nm,双击y Ax改为y/F.点击 图标，移动鼠标到峰点，再点T图标，再点左键，输入数值297nm重复再输入另一峰值重复输入excitation emission 即成3.再点击File(电脑左上方) （save project）点击，输入文件名，点保存。4最后点击Edit(在File后)，点击copy page,即可复制在word文档。这件完整的图形
21、即可在用U盘拷贝了。第五节 荧光分析法的应用（一）（一） 有机物的荧光分析有机物的荧光分析 （二）（二） 无机元素的荧光分析无机元素的荧光分析（三）在生命科学中的应用三）在生命科学中的应用 荧光分析测定邻、间荧光分析测定邻、间-羟基苯甲酸混合物中羟基苯甲酸混合物中的二组分析含量的二组分析含量一，目标要求一，目标要求1.学习荧光分析法的基本理论和操作学习荧光分析法的基本理论和操作;2.用荧光分析法进行多组分含量的测定。用荧光分析法进行多组分含量的测定。二，原理二，原理 某些具有某些具有-电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该
22、物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为荧光分析法，而常把被测物称为荧光建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。在稀溶液中，荧光强度物质。在稀溶液中，荧光强度It与入射光的强度与入射光的强度Io、荧光量子效率、荧光量子效率f 以及荧光物质以及荧光物质的浓度的浓度c等有关，可表示为等有关，可表示为If=KfIobc。 式中式中K为比例常数，与仪器性能有关，为比例常数，与仪器性能有关，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，
23、b为液层厚度。由此可见，当仪器的参数固定后，以最大激发波为液层厚度。由此可见，当仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度 If与荧光物质的浓度与荧光物质的浓度c成正比。成正比。在中性水溶液中，邻在中性水溶液中，邻-羟基苯甲酸（水杨酸）生成分子内氢键（羟基苯甲酸（水杨酸）生成分子内氢键（ ）增加分子）增加分子的刚性而有较强荧光，而间的刚性而有较强荧光，而间-羟基苯甲酸则无荧光。在羟基苯甲酸则无荧光。在PH的碱性溶液中，二者在的碱性溶液中，二者在310nm附近的紫外光照射下则均会发生荧光，且邻附近的紫外光
24、照射下则均会发生荧光，且邻-羟基苯甲酸的荧光强度与其在羟基苯甲酸的荧光强度与其在PH5.5时相同。因此，在时相同。因此，在PH5.5时可测定水杨酸的含量，间时可测定水杨酸的含量，间-羟基苯甲酸不干扰。另羟基苯甲酸不干扰。另取同量试样溶液调取同量试样溶液调PH到到12，从测得的荧光强度中扣除水杨酸产生的荧光即可求出，从测得的荧光强度中扣除水杨酸产生的荧光即可求出间间-羟基苯甲酸的含量。在羟基苯甲酸的含量。在012ug/ml范围内荧光强度与二组分浓度均呈线性关系。范围内荧光强度与二组分浓度均呈线性关系。对对-羟基苯甲酸在此条件下无荧光，因而不干扰测定。羟基苯甲酸在此条件下无荧光，因而不干扰测定。三
25、，仪器及试剂三，仪器及试剂WGY-10型荧光分光光度计（天津）容量瓶（25 ml）分度吸量管5 ml 2 ml邻-羟基苯甲酸标准溶液：称取水杨酸0.1500g溶解并定容于1L容量瓶中。间-羟基苯甲酸标准溶液：称取间羟基苯甲酸0.1500g溶解并定容于1L容量瓶中。醋酸-醋酸钠缓冲溶液：称取47g NaAc和6g 醋酸配成1LPH5.5的缓冲溶液。NaOH溶液：0.1mol/L未知液四，实验内容四，实验内容（1）、配制标准系列和未知溶液）、配制标准系列和未知溶液：1、分别移取水杨酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于25ml 容量瓶中，各加入2.5ml PH5.5的醋酸盐缓
26、冲溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀。2、取0.6ml未知液两份于25ml 容量瓶中，各加入2.5ml PH5.5的乙酸缓冲溶液，分别用去离子水稀释至刻度，摇匀。3.分别移取间羟基苯甲酸羟基苯甲酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于25ml 容量瓶中，各加入3.0ml0.1mol/L溶液， ，用去离子水稀释至刻度，摇匀。4.取0.6ml未知液两份于25ml 容量瓶中，各加入3.0ml0.1mol/L溶液，分别用去离子水稀释至刻度，摇匀。（2）、激发光谱和发射光谱的测绘）、激发光谱和发射光谱的测绘用（1）中的第四份溶液测绘各自的激发光谱和发射光谱。先固定发射波长为400nm在
27、250350nm进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱。再固定激发波长为 ex （最大激发波长），在350500 nm 进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱。（3）、根据（2）中得到的光谱图确定一组（ex和em），使之对二组分都是较高的灵敏度。在该组波长下测定（1）中1、2各溶液的荧光强度。五、数据处理五、数据处理 以荧光强度为纵坐标，分别以水杨酸的浓度和间以荧光强度为纵坐标，分别以水杨酸的浓度和间-羟基苯甲酸羟基苯甲酸的浓度为横坐标制作工作曲线。根据的浓度为横坐标制作工作曲线。根据PH5.5的未知溶液的荧光的未知溶液的荧光强度可在水杨酸的工作曲线上确定未知液中水杨酸的浓度；根强度可在水杨酸的工
28、作曲线上确定未知液中水杨酸的浓度；根据据PH为为12的未知液的荧光强度与的未知液的荧光强度与PH为为5.5的未知液的荧光强的未知液的荧光强度之差值可在间度之差值可在间-羟基苯甲酸的浓度。羟基苯甲酸的浓度。六、思考题六、思考题1、在、在PH为为5.5的水溶液中，邻的水溶液中，邻-羟基苯甲酸（羟基苯甲酸（Pka1=3.00，Pka2=12.38）和间）和间-羟基苯甲酸（羟基苯甲酸（Pka1=4.05,Pka2=9.85）的）的存在形式如何？存在形式如何？2、物质的荧光强度与哪些因素有关？、物质的荧光强度与哪些因素有关？PH5.5时水杨酸溶液的光谱示图时水杨酸溶液的光谱示图 PH12 间间-羟基苯甲酸溶液的光谱示图羟基苯甲酸溶液的光谱示图38 以上有不当之处，请大家给与批评指正，谢以上有不当之处，请大家给与批评指正，谢谢大家！谢大家！
