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1、实实 验验 五五动物肝脏中动物肝脏中DNA的制备和鉴定的制备和鉴定学时：学时：6 62007.4.272007.4.271 1、掌握动物组织总、掌握动物组织总DNADNA的提取方法及其原理。的提取方法及其原理。2 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。3 3、学习核酸染色的方法。、学习核酸染色的方法。 一、实验目的：一、实验目的：二、实验原理二、实验原理:要获得纯的要获得纯的DNADNA样品，必须考虑以下几点：样品，必须考虑以下几点：如何选材，如何破碎组织细胞？如何选材，如何破碎组织细胞？如何除去蛋白质？如何除去蛋白质？( (在真核细胞内，在真核
2、细胞内，DNADNA与蛋白质结合成核蛋与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离白的形式存在。因此，分离DNADNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。白质。) )设法除去设法除去RNARNA的污染；的污染；防止防止DNADNA酶的降解作用；酶的降解作用； （一）动物肝脏（一）动物肝脏DNA制备原理制备原理选选材材 要提取动物组织要提取动物组织DNADNA，一般选择细，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。研磨：研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石将剪碎
3、的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。用。组织捣碎器：组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转温过高，通常是转1010秒秒2020秒，停秒，停1010秒秒2020秒，可反复多次。秒，可反复多次。压榨法：压榨法：在在1000101000105 5Pa200010Pa2000105 5Pa Pa 的高压下使几十毫升的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，
4、细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。细胞破碎方法细胞破碎方法机械物理法：反复冻融法：反复冻融法：将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至1515到到2020，然后放于室温，然后放于室温( (或或40)40)迅速融化，由于细胞内形迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。碎。超声波处理法：超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。细胞器。使用时注意降温，防止过热。冷热交替法：冷热交替法：在在909
5、0左右维持数分钟，立即放入冰左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。被破碎。细胞破碎方法细胞破碎方法机械物理法有机溶剂处理法：有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDSSDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。研磨法联合使用。溶胀法：溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由
6、于存在渗透压差，溶剂分子浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。细胞破碎方法细胞破碎方法化学方法(三三)除去除去RNA的方法的方法 脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白在浓在浓NaClNaCl（1-2mol1-2molL L）溶液中）溶液中溶解度很大，但在溶解度很大，但在0.14mol0.14molL NaClL NaCl溶液中溶解度很低，溶液中溶解度很低，而而核糖核蛋白核糖核蛋白则溶于则溶于0.14mol0.14molL NaClL NaCl溶液中，利用溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋
7、白这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。分离开来。(四四)除去蛋白质的方法除去蛋白质的方法用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而相中间，而DNADNA溶于上层水相。用两倍体积溶于上层水相。用两倍体积 9595乙醇溶液可乙醇溶液可将将DNADNA钠盐沉淀出来。钠盐沉淀出来。用十二烷基硫酸钠（用十二烷基硫酸钠（SDSSDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取从
8、生物材料中提取DNADNA。纯的纯的DNA样品的获得样品的获得为了防止为了防止DNADNA酶的降解，提取时可加入适量酶的降解，提取时可加入适量EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNADNA酶的活性。酶的活性。加入加入RNARNA酶降解剩余的酶降解剩余的RNARNA，获得纯的，获得纯的DNADNA。保保存存：将将DNADNA于于滤滤纸纸上上干干燥燥，溶溶于于1mlTE1mlTE中中低低温保存。温保存。（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：l琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳是用电泳是用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电作
9、为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。l琼脂糖琼脂糖英文名英文名agarose，是从是从琼脂琼脂中提取出来的，由中提取出来的，由半半乳糖乳糖和和3.6-3.6-脱水脱水- -L- L- 半乳糖半乳糖相互结合的相互结合的链状多糖链状多糖。琼脂糖琼脂糖和琼脂和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶多孔的凝胶，电，电泳中具有泳中具有分子筛效应分子筛效应。但。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少琼脂糖含硫
10、酸根比琼脂少，电渗电渗作用作用降低，因而分离效果明显提高。降低，因而分离效果明显提高。lDNADNA分子分子在在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（中向正极移动（电荷效应电荷效应）。lDNA分子泳动速率的大小除与分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关分子的带电量有关外，还与外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的的分子筛效应分子筛效应）。）。l电泳时，用电泳时，用溴酚蓝溴酚蓝做前沿指示剂，用做前沿指示剂，用溴化乙啶溴化乙啶（ethidiumbromide，EB）指示指示DNA样品在凝胶中
11、的样品在凝胶中的确切位置。确切位置。l溴化乙啶溴化乙啶是一种荧光染料，可插入是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的双螺旋结构的两个碱基对之间，与两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。激发下发出橙黄色的荧光。l荧光荧光来自两方面，一是核酸吸收来自两方面，一是核酸吸收260260nmnm的紫外光，并的紫外光，并将能量传给将能量传给EB；二是二是EB本身吸收波长为本身吸收波长为302302nmnm和和360360nmnm的紫外光。这两方面的能量最终激发的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出发出波长为波长为590590nmnm的红橙色荧
12、光。的红橙色荧光。l溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含放在含EB的溶液中浸泡的溶液中浸泡.l溴化乙啶检测溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出的灵敏度很高，可检出10ng甚至甚至更少的更少的DNA。琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系凝胶中，凝胶中，DNA片段迁移率与片段迁移率与DNA分子大小分子大小(碱基对的对数碱基对的对数)成反比成反比(20kb)，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动因此通过已知大小的标准物移动的距
13、离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。距离时行比较，便可测出未知片段的大小。（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型不同构型DNA的移动速度次序为：闭环的移动速度次序为：闭环DNA直线直线DNA开环的双链开环的双链环状环状DNA.（3）不同大小的不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。分离。琼脂糖浓度琼脂糖浓度/%/%0.30.60.70.91.21.52.0线状线状DNADNA大小大小/ /kbkb60-520-110-0.87-0.56-0.43-0.22-0.1注：注：DNADN
14、A片段在片段在5-5005-500bpbp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）进进行电泳分离。行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：（1 1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离快、分离DNADNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。（2 2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。高，重复性好。（3 3）琼脂糖透明无紫外吸
15、收，电泳过程和结果可直接用紫外）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。光检测及定量测定。（4 4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。成干膜可长期保存。因此，因此，琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一，中常用实验方法之一， DNADNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。荧光染料荧光染料EB染色染色后，在紫外灯后，在紫外灯(305n
16、m)下观下观察到的电泳结果：察到的电泳结果： * * 荧光染料荧光染料EBEB染色的原理和优点是什么？染色的原理和优点是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即即3,8-3,8-二二氨氨基基-5-5-乙乙基基-6-6-苯苯基基菲菲锭锭溴溴盐盐( (Ethidium Ethidium Bromide)Bromide)。 EBEB是是一一种种扁扁平平分分子子，它它可可以以嵌嵌入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。 激激发发的的荧荧光光的的能能量量来来源源于于两两个个方方面面：一一是是核核酸酸吸吸收收2 260nm60nm的的紫紫外外
17、线线后后将将能能量量传传递递给给EBEB，二二是是EBEB本本身身吸吸收收302302nmnm和和360360nmnm的的紫紫外外线线的的能能量量。这这两两方方面面的的能能量量最最终终激激发发EBEB发射波长为发射波长为590590nmnm的可见光（红橙区）。的可见光（红橙区）。 2 2、优点：、优点：（1 1）染色比较简便、快捷，一般在）染色比较简便、快捷，一般在10101515minmin就可反应。就可反应。（2 2）EBEB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB灵敏度高，可检测出灵敏度高，可检测出1010ngn
18、g或更少的或更少的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的检测。的检测。（5 5）EBEB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。灯检测电泳的进程和效果。（6 6）EB-DNAEB-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的荧光比游离的发出的荧光比游离的EBEB强强1010倍，倍， 因此不需洗净凝胶中游离的因此不需洗净凝胶中游离的EBEB也可检测出也可检测出DNADNA的条带。的条带。3 3、缺点：、缺点： 溴溴化化乙乙啶啶是是一一种种强强的的致致突突变变剂剂，在在操操作作
19、和和配配制制试试剂剂时时应应戴戴手手套套。含含溴溴化化乙乙啶啶的的溶溶液液不不能能直直接接倒倒入入下下水水道道，应应进行处理。进行处理。（1 1）每）每100100mlml溶液中加入溶液中加入100100mgmg粉状活性炭；粉状活性炭；（2 2）室温下放置）室温下放置1 1小时，不时的摇动；小时，不时的摇动；（3 3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；（4 4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。* *溴溴化化乙乙啶啶在在260260分分解解，在在标标准准条条件件下下进进行行焚焚化化后后不不会会有有危危险性。险性。(
20、一一)材料：动物肝脏材料：动物肝脏(二二)试剂：试剂：（1）0.14molLNaCl0.15molLEDTA-Na溶液：溶液：（2）20SDS溶液：溶液：（3）氯仿一异戊醇氯仿一异戊醇(24:1)混合液：混合液：（4）95乙醇溶液。乙醇溶液。（5）80乙醇溶液乙醇溶液。（6）pH8.0TE缓缓冲冲液液：10mmolLTrisHCI，lmmolLEDTANa，其中含其中含RNA酶酶20ugmL。二、实验材料、试剂和仪器二、实验材料、试剂和仪器:（7）电泳缓冲液：电泳缓冲液：Tris-硼酸硼酸EDTA（50TBE）pH8.0。（8）加样缓冲液：加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（溴酚蓝（BPB）40%蔗
21、糖。蔗糖。（9）溴化乙啶（溴化乙啶（EB）溶液：溶液：10g/ml。（10）琼脂糖凝胶：浓度为琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。(三三)仪器仪器（1）稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪（2）可调微量移液器可调微量移液器（3）水平电泳槽水平电泳槽（4）暗箱紫外透射仪等。暗箱紫外透射仪等。移液器的使用移液器的使用自动取液器的构造自动取液器的使用吸入液体吸入液体排出液体排出液体使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。三、实验步骤：三、实验步骤：1 1取新鲜动物肝，称取取新鲜动物肝，称取2 2g g，切成小块，加切成小块，加入入4 4
22、ml 0.14molml 0.14molL NaClL NaCl0.15mol0.15molL L EDTAEDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加4 4mlml清洗转入离心管中清洗转入离心管中，以以40004000r rminmin的转速的转速离心离心 10 10minmin。2 2在上述沉淀物中加入在上述沉淀物中加入4 4mLmL 0.14 0.14molmolL NaClL NaCl0.15mol0.15molL EDTAL EDTA溶液，然后在溶液，然后在6060下，滴加下，滴加 20 20SDSSDS溶液溶液3 35 5滴滴，边加边摇动，再摇动边加边摇动，
23、再摇动 10 10minmin，使核酸与蛋白质分离。使核酸与蛋白质分离。3. 3. 加加固固体体氯氯化化钠钠0.40.4g g混混匀匀，使使其其最最终终浓浓度度达达到到l.4moll.4molL L，水浴水浴3030minmin。 4 4加等体积的氯仿一异加等体积的氯仿一异戊醇，混匀，摇动戊醇，混匀，摇动5 5minmin，以，以40004000r rminmin的转速离心的转速离心1010minmin。离心管内的物质分离心管内的物质分为三层，上层为含为三层，上层为含DNADNA的水的水相层，下层为氯仿一异成醇相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白混合物，中间层为变性蛋白凝胶。凝胶。
24、5 5吸出上清液，加入吸出上清液，加入2 2倍体积倍体积9595乙醇溶液（预乙醇溶液（预冷），产生沉淀。冷），产生沉淀。6.6.再再以以40004000r rminmin的的转转速速离离心心溶溶液液1010minmin，弃弃去去上清液上清液 ( (沉淀用沉淀用8080乙醇溶液离心洗涤乙醇溶液离心洗涤) )。7 7将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入干燥后，加入200200ul ul 电极缓冲液电极缓冲液，使使DNADNA充分溶解，充分溶解，待用。待用。 8.8.凝胶板的制备：凝胶板的制备：（1 1）取取琼琼脂脂糖糖0.7 0.7 g g，加加
25、11TBETBE缓缓冲冲溶溶液液100100mlml，于于沸沸水水浴浴中中至熔化，制成至熔化，制成0.7%0.7%的琼脂糖胶液。的琼脂糖胶液。（2 2）胶胶床床两两头头贴贴上上防防水水胶胶带带，形形成成8 8mmmm高高的的挡挡墙墙，压压紧紧胶胶带带，置水平台面上。置水平台面上。（3 3）插入梳子，梳齿下端离板底插入梳子，梳齿下端离板底0.50.51 1mmmm。（4 4）在胶床上滴加在胶床上滴加2 23 3滴滴 0.5 0.5g/g/mLmL的的EBEB溶液溶液。（5 5）将将6060凝凝胶胶不不间间断断倒倒入入胶胶床床，高高3 34 4mmmm，避避免免气气泡泡，摇摇匀，匀，室温下凝固。室
26、温下凝固。（6 6）完完全全凝凝固固后后，撕撕掉掉胶胶带带，置置于于电电泳泳槽槽中中，加加入入电电泳泳缓缓冲冲液液，高高于于胶胶面面1 12 2mmmm，从从一一头头轻轻轻轻斜斜拉拉出出梳梳子子，除除去去产产生生的气泡。的气泡。9.9.加样：加样： 将将样样品品DNADNA溶溶液液与与加加样样缓缓冲冲液液以以5 5 ：1 1的的体体积积比比混混合合，用用微微量量移移液液器器加加样样，每每加加完完一一个个样样品品，冲冲洗洗三三次次。加加样样量量151520 20 l l （加加样样时时应应防防止止碰碰坏坏样样品品孔孔周周围围的的凝凝胶胶面面以以及及穿穿透透凝凝胶底部）。胶底部）。10.10.电泳
27、：电泳： 为为了了获获得得电电泳泳分分离离DNADNA片片段段的的最最大大分分辨辨率率，电电场场强强度度不不应应高高于于5 5V/cmV/cm（两两电电极极间间的的距距离离）开开始始时时用用较较高高电电压压(80(80V)V)，样样品品一一进进入入胶胶内内则则将将电电压压调调至至5 5V/cm V/cm 。当当染染料料前前沿沿移移至至底底边边1-21-2mmmm时，电泳毕。时，电泳毕。11. 11. 观察观察 关关闭闭电电源源，取取出出胶胶床床，在在紫紫外外检检测测仪仪下下观观察察凝凝胶胶中中的的DNADNA（红橙色荧光）。红橙色荧光）。五、思考题：五、思考题： 1 1、用用荧荧光光染染料料E
28、BEB染染色色的的原原理理和和优优缺缺点是什么？点是什么？ 2 2、绘制、绘制DNADNA电泳图谱。电泳图谱。核酸提取过程中的注意事项：核酸提取过程中的注意事项：（1 1）避避免免过过酸酸过过碱碱或或高高温温环环境境，合合适适的的T T：0 044， pH4-9pH4-9；（2 2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；（3 3）防防止止核核酸酸酶酶的的降降解解作作用用，可可加加入入抑抑制制剂剂EDTAEDTA，柠柠檬檬酸钠；酸钠；（4 4）整整个个操操作作步步骤骤应应尽尽量量简简化化，缩缩短短实实验验过过程程，减减少少核核酸酸变性、降解、机械切割的机会。变性、降解、机械切割的机会。
