应用微生物学1、2

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1、应用微生物学教学计划及参考书本课程30学时2学分（每周两学时）无教材参考书：1、姜成林等编 微生物资源开发利用2001.42、岑沛霖等编 工业微生物学 2000.63、杨柳燕等编 环境微生物技术2003.84、李虞庚 冯世功 编译石油微生物学1991.55、徐积恩 朱明珍编抗 生 素1982.86、柳忠辉 吕昌龙主编免疫学常用实验技术2002. 8绪论第一节 应用(经济)微生物学的诞生与发 展第二节 应用微生物资源第三节 应用微生物资源的发掘、驯化 和应用第一节 应用（经济）微生物学 的诞生与发 展一、概念：（一）、应用（经济）微生物： 是指在国民经济国民经济中得到广泛应用广泛应用并能产生显著

2、显著 经济效益经济效益的微生物。 主要包括两大部分：、当前有使用价值、能制造出较高经济效益的微生物。、具有较高开发潜力的微生物。（二）、应用微生物学：是对应用微生物的基础理论、应用技术、微生物产品及制品的生产、应用等一系列问题进行研究的科学。二、诞生与发展（一）感性认识阶段 微生物学已有300多年历史，在微生物学的史前阶段，人们对微生物只有感性认识。（二）理性认识阶段 随着光学显微镜，特别是电子显微镜的发明，对微生物的认识已上升到理性认识阶段。 随着微生物生理学、微生物生物化学和分子生物学及分子遗传学的发展，对微生物的认识也不断地深化，使有害微生物得到有效控制，有益微生物得到充分利用，逐步形成

3、了“经济微生物”的概念。 特别是采用生物工程新技术以后，经济微生物资源进一步得到充分利用，为社会创造出的物质财富也更加丰厚，这就是目前国内外在应用科技应用科技上重点开发经济微生物的原因。三、应用微生物学涉及的领域 微生物学的迅速发展及应用，导致经经济微生物济微生物在国民经济发展中发挥了巨大的作用，因而产生了经济（应用）微生经济（应用）微生物学物学。 近年来，国外以经济微生物学为内容的书连续出版了8卷(卷1：酒精饮料；卷2：初级代谢产物；卷3：次生代谢产物；卷4：微生物生物量；卷5：微生物酶和生物转换；卷6：微生物腐蚀；卷7一卷8：食品微生物学)。由此可见这是一个新兴的科学领域，涉及的面十分广泛

4、，发展极其迅速，世界各国都非常重视。 随着我国国民经济和生物工程的发展，必将更迅猛地推动经济微生物学的研究和发展，会有更多的人认识到它的重要性。 随着分支学科工业微生物学、食品微生物学、农业微生物学和医学微生物学等学科的发展。也必将推动经济微生物学的更快发展。（一） 应用（经济）微生物学涉及的领域主要有： 医药、食品工业、农业、化工原料、环保、冶金、采油等领域。 并在以上各领域中得到了广泛应用, 且给人们带来了巨大的经济利益。第二节 应用（经济）微生物资源 微生物是人类赖以生存的重要资源之一，在食品、医药、化工等许多领域得到了广泛应用，而且发挥着巨大的作用。自古以来，我国人民就知道利用曲酿酒、

5、酿造调味品；面醪可制作面食（馒头、面包）；酸性矿水能浸出铜矿；沤肥能提高速效养分；豆科植物的根瘤能肥田；疯狗脑可防治狂犬病；“人痘可防天花、等等。这些都是利用经济微生物造福于人类的例证。一、 应用（ 经济）微生物的种类： 主要包括细菌、放线菌、霉菌和酵母菌四大类群。 自然界中微生物资源是非常丰富的，但迄今为止，已经发现的微生物仅占总数的10左右，在工、农、医诸方面被利用已获得经济效益的微生物则更少，只有数百种。 因此，研究和开发经济微生物资源的任务非常艰巨，但潜力很大，前景广阔。 利用高新科学技术发掘新的微生物资源，改造老的微生物资源，必将对经济微生物学的发展起着明显的推动效应。 二、 经济微

6、生物在工、农、医的应用： 应用非常广泛，有的是直接利用菌体(如酵母片、菌体蛋白、活性干酵母、微生物农药、微生物肥料和食用菌等)； 有的则是利用其代谢产物(如乙醇、柠檬酸、氨基酸和抗生素等)和分泌的酶类(如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和果胶酶等)。（一）、细菌的应用 细菌资源可供生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇和发酵食品； 可用于氨基酸、有机酸、糖类、核甘酸、维生素和抗生素的发酵； 还可用于甾体物质转化，生物农药及肥料的生产以及湿法冶金、采油等。 （二）、放线菌的应用 放线菌的资源主要用于生产抗生素在已发现的1000多种抗生素中，由放线菌产生的占23。此外，在氨基酸、核甘酸和酶制剂的生产以及甾体物质的转化等

7、方面放线菌也有重要的作用。 （三）、酵母菌的应用 酵母的资源利用从本世纪50年代后期开始，已由酒精发酵力强的发酵型酵母转向发酵力弱或无发酵力的氧化型酵母。 如：食用、药用和饲料酵母，以及生产多元醇、油脂、有机酸、维生素和酶制剂的酵母等。（四）、霉菌的应用 霉菌的资源主要用于酶制剂、抗生素、有机酸、氨基酸和核酸等的生产。 近几年国外又开始兴起利用霉菌生产油脂，如最近日本工业技术院化学技术研究所分离到一种被孢霉产油酯的能力比以往菌种高7倍，他们已设计出年产油脂7000t的成套工艺设备。发酵罐容积为1000t。（五）、担子菌的资源利用 担子菌的资源利用正愈来愈引起人们的重视。如多糖、橡胶物质和抗癌药

8、物的开发。 近来日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入研究，发现有一种“1，3一葡萄糖甘酶”具有抗癌作用。且香菇含有的多糖类物质 也具有抗癌作用。 我国把猴头的菌丝体制成片剂在临床上用于治疗胃癌、贲门癌和食道癌，有效率达69.3，若再配伍其他中草药有效率可提高到82.8。（六）、其他微生物资源应用 可利用蓝细菌生产蛋白质(如螺旋蓝细菌的菌体蛋白质可达70)、脂肪以及处理废水获得能源； 利用原生动物监测活性污泥的质量和工业废水中的有毒物质等等。第三节 经济微生物资源的发掘、驯化和应用 要想获得有价值的经济微生物种类，必须从自然界中发掘出来、经过驯化再应用到生产上。一、应用（经济）微生物

9、的发掘 微生物资源开发利用 的程序通常由：总体设计、找到目的菌、效果试验、申请专利、菌种改良及发酵工艺研究、报批、生产、市场等相互关联的过程所组成。现就部分要点作一般介绍。(一)、总体设计 总体设计是微生物资源开发利用的首要任务。 1、市场是核心。 包括现有市场、 潜在市场、 竞争对手、自己的市场开拓能力、开发的策略、工作基础、已具备的条件、自己的优势和劣势、合作伙伴的力量及诚信度、投资大小、投资周期及风险等。2. 创新是灵魂 一套好的总体设计往往要有几套方案，根据情况变化而随机应变。 避免开发目标与别人相重， 保证能及时改变战略，力争别处领先。 (二)、找到目的菌1.菌种来源： 可来自两方面

10、。 一是来自菌种保藏中心：目前至少有 58个国家共建立了 484个菌种保藏中心，已保藏菌种80多万株，很多是典型菌株。 二是自己分离菌种：就是要根据开发目标: 选择取样地域、取样环境。如： 土壤 海洋 极端环境。 未知微生物是最值得开发的资源。2.模型设计（1）筛选模型的概念：筛选模型是用于证明某种物质具有生物活性、的实验方法，这些实验方法是寻找和发现新物质，新菌种的重要条件之一。（2） 筛选模型的标准： 准确、微量、快速、简便（3） 模型设计： 可根据 作用机制、 代谢途径的靶位、 酶反应机制、 基因操作过程的各种调控因子、目的化合物的类型等来设计。 模型设计是微生物开发最活跃的领域。3.一

11、菌多筛 不仅有利于找到目的菌、增加了菌种的利用率和入选率，更重要的是有可能找到用途更大的非目的菌，（比如具有某种活性的菌）。 这就需要开发人员： 全局在胸、看的深远全局在胸、看的深远、通晓相关领域的动态。同时还需要制定几套筛选几套筛选方案。4.高通量筛选和组合生化相结合 高通量筛选： 是将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样、培养后，用计算机记录结果，并进行分析，使筛选从繁重的劳动中解脱出来，实现了快速 、准确、微量，一周可筛选成千上万个样品。 组合生化： 是用已知已知有用化合物或已知骨架的化合物分别与不同的微生物共培养不同的微生物共培养，然后分析不同培养时间化合物的结构及其活性 的变

12、化（发生修饰或转化），从而极大地增加了化合物的多样性，相应增加了获得理想化合物的可能性。 若把组合生化与高通量筛选结合起来，筛选的效能将大大提高，找到优越化合物的可能性剧增。（三）、申请专利1.申请专利的时机： 一般应在确定某种新活性、新用途、或新化合物时立即申请。 新菌种也可申请专利，不同国家有不同规定： 美国：新菌种发表后就不能再申请专利。 西欧国家：发表一年内可以申请专利。 所以在新菌种被接受可以发表时（到发表还有约三个月到半年时间）立即申请专利最为合适。2.什么情况下不必申请专利？ 如果别人仿制了你的技术，而你又无法弄到明确的证据，那么你就要靠保密手段来保护知识产权。3.聘请法律顾问或

13、专利申请代理人。（四）、菌种改良和基因工程1.传统的理化诱变技术 是目前普遍采用的方法，使菌种发生突变，存优去劣，容易施行、易见成效。 2.基因工程技术 是研究目的物的基因结构及基因调控、表达的方式，进行基因重组、转殖，使之高效表达。本技术将变成常规技术，成为微生物资源开发利用的强大武器。（五）、微生物资源开发利用的重大课题1.微生物资源种类的探索：未知微生物的分离是微生物资源开发利用的重要前提和基础。 2.生物固氮 尤其是非豆科粮食作物的固氮是最值得研究的重大课题。 3.微生物药物的开发 仍然是当今的重大任务。 随着开发进程的不断深入，开发领域的不断扩大，新技术的发展和渗透，微生物资源开发利

14、用将会日新月异，新思维、新产品、新用途、新领域将层出不穷。使微生物资源将更好的为人类造福。二、经济微生物的应用 发掘、驯化的微生物只有经过生产实践的检验才能证实它是否具有经济效益，也只有通过在生产上应用才能发挥它的经济价值。若要使经济微生物实现应用，必须使之成为微生物产品。微生物产品的生产如下图所示。菌种源菌种源接种接种培养基培养基培养培养分离分离培养液培养液死细胞生物量死细胞生物量细胞细胞死细胞破碎死细胞破碎膜分离澄清膜分离澄清离心离心离心离心离心离心 产品稳定产品稳定产品稳定产品稳定产品稳定产品稳定脱水脱水脱水脱水脱水脱水干产品干产品新鲜产品新鲜产品干产品干产品新鲜产品新鲜产品干产品干产品

15、新鲜产品新鲜产品贮存、使用贮存、使用第一章第一章 药用微生物的开发及应用药用微生物的开发及应用 微生物在自然界中几乎是无处不有微生物在自然界中几乎是无处不有,无处不在无处不在.并并且种类多且种类多,繁殖快繁殖快,因此因此,它们具有产生各种各样具有它们具有产生各种各样具有不寻常化学结构和不寻常生物学活性化合物的无限不寻常化学结构和不寻常生物学活性化合物的无限潜力潜力,这些化合物在医药上的应用是微生物资源开发这些化合物在医药上的应用是微生物资源开发应用的一个重要方面。应用的一个重要方面。 自古以来自古以来,微生物药物就用于防病治病微生物药物就用于防病治病,特别是近特别是近一百多年来一百多年来,经过

16、几代人的努力经过几代人的努力,这类药物通过工业这类药物通过工业化化生产大量投放市场生产大量投放市场,对于保障人类健康起到了不可估对于保障人类健康起到了不可估量的作用。量的作用。本章主要介绍以下几方面的内容：本章主要介绍以下几方面的内容：第一节、药用微生物资源开发利用的历史第一节、药用微生物资源开发利用的历史第二节、药用微生物的来源和分离方法第二节、药用微生物的来源和分离方法第三节第三节 、微生物药物的研究与开发、微生物药物的研究与开发第四节、微生物药物的生产第四节、微生物药物的生产第一节第一节药用微生物资源开发利用的历史药用微生物资源开发利用的历史一一.微生物之间的拮抗现象微生物之间的拮抗现象

17、二二.第一个实用抗生素第一个实用抗生素青霉素的发青霉素的发现现三三.链霉素的发现与新抗生素开发的活跃期链霉素的发现与新抗生素开发的活跃期四四.半合成抗菌素的发展半合成抗菌素的发展五五.微生物药物应用范围的扩大微生物药物应用范围的扩大六六.药用微生物发展的趋势药用微生物发展的趋势一、微生物之间的微生物之间的拮抗现象 一种微生物的生长微生物的生长如果造成对周围其他微生物周围其他微生物生长的抑制生长的抑制,这种现象就叫做拮抗现象拮抗现象。 也可以说也可以说:一种微生物在生命活动过程中一种微生物在生命活动过程中,通过通过其其产生的某种代谢产物或改变环境条件产生的某种代谢产物或改变环境条件,能够抑制别种

18、能够抑制别种微生物的生长繁殖微生物的生长繁殖,或毒害甚至使别种微生物致死的或毒害甚至使别种微生物致死的现象。现象。 在医学上用抗生素治疗感染等疾病抗生素治疗感染等疾病,就是依据依据微生物之间的拮抗现象进行的，那么,这种现象是谁在什么时间发现的呢？（一）拮抗现象的发现（一）拮抗现象的发现1、世界上最早最早报告的拮抗现象拮抗现象 1874年,W.Roberts发现某种霉菌霉菌能抑制细菌细菌的生长。是世界上最早最早报告的拮抗现象拮抗现象2、巴斯德（1822-1895）指出可利用拮抗现拮抗现象治疗感染症象治疗感染症 1877年,巴斯德发现炭疽杆菌炭疽杆菌培养物被杂菌杂菌污染污染后其对人体的感染力下降感

19、染力下降,并指出可利用拮抗现象治疗感染症。治疗感染症。3、拮抗现象的本质的揭示拮抗现象的本质的揭示 1887年,进一步发现：绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌产生的水溶性物质能够抑制包括葡萄球菌在内的各葡萄球菌在内的各种细菌种细菌的生长，从而揭示了拮抗现象的本质。揭示了拮抗现象的本质。 4、拮抗作用物质的获得拮抗作用物质的获得 1889年： 从一种细菌的培养液中细菌的培养液中提取得到对炭疽杆菌炭疽杆菌有拮抗作用拮抗作用的物质；还由一种青霉的培养液中分离精制得到后来被命名为:霉酚霉酚酸酸的抗菌活性物质抗菌活性物质。5、世界上首次利用拮抗现象治疗感染症的实例。 1899年，O.low报告局部应用假单胞菌的培

20、假单胞菌的培养液治愈了皮肤感染症养液治愈了皮肤感染症，这是世界上首次利这是世界上首次利用拮抗现象治疗感染症的实例。用拮抗现象治疗感染症的实例。 从以上可以看出从以上可以看出,拮抗现象拮抗现象的发现是漫长漫长的,自1874年-1899年25年的时间,经过十几位科十几位科学家的艰苦努力学家的艰苦努力对这一现象才有了初步初步的认识,但没有真正得到抗生素但没有真正得到抗生素。二、第一个使用抗生素二、第一个使用抗生素-青霉素的发青霉素的发现现 1.青霉素的第一次发现青霉素的第一次发现: 1928年年,英国学者Fleming(1881-1955),在研究葡葡萄球菌萄球菌的变异时,发现一个培养皿在污染了霉菌

21、(后来被确认为点青霉)的菌落周围出现了无葡萄球菌生长的透明抑菌圈透明抑菌圈. Fleming用这一霉菌的培养滤液进行了动物抗感染试验,获得了确切的疗效,而未见对宿主兔子的白血球产生影响.他把存在于点青霉培养滤液中产生这一抗菌作用的有效物质叫做青霉素青霉素(Penicilin). 但由于点青霉产生青霉素的能力很弱能力很弱,当时未能将这一物质分离出来（只知道在酸酸性条件下可将其萃取到脂类脂类溶剂中）,加上那时抗菌磺胺药物磺胺药物的应用正处于十分盛行十分盛行的时代,因而这一发现长期未能得到人们的重视。 2.青霉素的第二次发现青霉素的第二次发现 在Fleming 首次发现青霉素首次发现青霉素10年后年

22、后， 1938年,英国牛津大学的生理学家 H.W.Florey开始了对微生物产生的抗菌物质微生物产生的抗菌物质进行系统的研究.在E.B.Chain等化学家化学家的协助下,于1940年成功的获得了较为纯净的青霉素,用于对葡萄葡萄球菌和链球菌球菌和链球菌感染的实验动物进行治疗,产生了意想不到的效果.其有效剂量低于当时的任何抗感染药物,而未出现任何副作用。这就是后人所说的对青霉素的第二次发现。对青霉素的第二次发现。 由于当时英国正处于第二次世界大战英国正处于第二次世界大战的前沿,缺乏青霉素产业化的环境环境,故将这一研究工作移到了美国美国。在美国国家的支持下,以制药公司制药公司为中心的青霉素研究取得了

23、很大进展很大进展。 筛选获得了被称为产黄青霉的高产菌株;并且改良了培养方法(由固体固体发酵改成了液体液体深层发酵,）从而很快开始了大规模工业化大规模工业化生产. 1941年,青霉素开始用于救治二战的伤病员救治二战的伤病员,进一步证明了它的无以伦比的疗效,被当时的人们誉为黄色的魔物 ,主要是因为当时的提取纯度不是很高,使产品带有产生菌的黄色色素产生菌的黄色色素 . 由于青霉素这一划时代抗生素的发现,Fleming,Florey和Chain同时获得1945年诺诺贝尔医学生理学奖。贝尔医学生理学奖。 在这一研究中开发的大规模通气大规模通气,搅拌培搅拌培养方法养方法也为后来各种抗生素和其他发酵产品的工

24、业化生产打下坚实的基础。坚实的基础。三三.链霉素的发现与新抗生素链霉素的发现与新抗生素开发的活跃期开发的活跃期 1939-1941年年, 几乎与第二次青霉素发现几乎与第二次青霉素发现的的同时同时,抗细菌的抗生素抗细菌的抗生素:短杆菌肽和短杆菌酪短杆菌肽和短杆菌酪肽肽先后被从土壤先后被从土壤革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌培养液中分离培养液中分离得到得到;并且还从灰黄青霉培养液中获得了抗真并且还从灰黄青霉培养液中获得了抗真菌的抗生素菌的抗生素-灰黄霉素灰黄霉素. 于是于是,美国著名土壤学家瓦克斯曼美国著名土壤学家瓦克斯曼(SlemanA.Waksman)(1888-1973)对以上抗对以上抗生素的研

25、究工作表现了极大的兴趣生素的研究工作表现了极大的兴趣,因此因此,他他对对土壤中一类新的微生物土壤中一类新的微生物放线菌放线菌的拮抗特性的拮抗特性进行了系统的研究进行了系统的研究,发现发现许多放线菌能产生抗许多放线菌能产生抗生素生素.并于：并于： 1940年年,发现了放线菌素发现了放线菌素 1942年年,发现了链丝菌素发现了链丝菌素19431943年年, ,他又由他又由鸡咽喉鸡咽喉中分离得到了一株中分离得到了一株灰色灰色链霉菌链霉菌, ,从中分离得到了不仅从中分离得到了不仅抗革兰氏阳性细抗革兰氏阳性细菌菌, ,而且抗革兰氏阴性细菌而且抗革兰氏阴性细菌, ,特别是对特别是对结核杆结核杆菌菌有效的有

26、效的广谱抗生素广谱抗生素链霉素链霉素. . 大家都知道大家都知道:青霉素只对革兰氏阳性细菌和青霉素只对革兰氏阳性细菌和少部分革兰氏阴性球菌有抗菌活性少部分革兰氏阴性球菌有抗菌活性.由于当时由于当时结核病对人类的威胁很大结核病对人类的威胁很大,因而因而,链霉素链霉素的发的发现现在社会上引起了很大反响。在社会上引起了很大反响。瓦克斯曼瓦克斯曼也因此也因此获得了获得了1952年的年的诺贝尔医学生理学奖诺贝尔医学生理学奖. . 青、链霉素青、链霉素的发现并使用化的发现并使用化,极大的推动了极大的推动了抗生素研究的发展抗生素研究的发展,各种各种新抗生素新抗生素不断的被发不断的被发现现,使使抗生素在抗感染

27、治疗抗生素在抗感染治疗中发挥着日益重要中发挥着日益重要的作用。的作用。 针对青霉素对革兰氏阴性杆菌无活性；链针对青霉素对革兰氏阴性杆菌无活性；链霉素对链球菌和破伤风杆菌作用弱的缺点，霉素对链球菌和破伤风杆菌作用弱的缺点，在在19471950年又先后开发了更具有广谱年又先后开发了更具有广谱抗菌作用的抗菌作用的:氯霉素氯霉素 ( (对肠伤寒有特效对肠伤寒有特效) ) 金霉素、土霉素金霉素、土霉素( (对当时流行的对当时流行的斑疹伤寒及对耐磺胺药的痢疾杆菌引起的斑疹伤寒及对耐磺胺药的痢疾杆菌引起的赤痢疗效显著赤痢疗效显著).). 但是，随着抗生素的广泛使用但是，随着抗生素的广泛使用 ，开始出现，开始

28、出现对抗生素对抗生素耐药耐药的病原菌。的病原菌。 于是于是,从从19521957年又相继发现了：年又相继发现了： 红霉素红霉素, ,白霉素白霉素 ( (对青霉素耐药菌有效对青霉素耐药菌有效) ) 卡那霉素卡那霉素 ( (对链霉素耐药菌有效对链霉素耐药菌有效) ) 并且并且, ,针对滥用广谱抗生素造成的真菌交针对滥用广谱抗生素造成的真菌交叉感染叉感染( (如如: :曲霉病和念珠菌病曲霉病和念珠菌病) )开发了：开发了： 制霉菌素和两性霉素制霉菌素和两性霉素B,B,等抗真菌抗生素等抗真菌抗生素 截止到截止到19591959年底，已发现的抗生素达年底，已发现的抗生素达10001000多种多种, ,在

29、临床上使用的约在临床上使用的约4040余种。因此，这一余种。因此，这一时期被誉为时期被誉为抗生素研究的全盛期抗生素研究的全盛期, ,抗感染化抗感染化疗也进入了辉煌的抗生素时代疗也进入了辉煌的抗生素时代. .四四.半合成抗生素的发展半合成抗生素的发展 进入进入1960年以后年以后,抗生素时代似乎从它的顶峰跌抗生素时代似乎从它的顶峰跌落落下来下来, 对抗生素大部分筛选工作都是重复过去已有对抗生素大部分筛选工作都是重复过去已有的的发现发现,寻找新抗生素变的越来越困难；已有的抗生素寻找新抗生素变的越来越困难；已有的抗生素也由于日益增加的也由于日益增加的耐药性问题耐药性问题和不断显现的和不断显现的副作用

30、副作用(如：如：链霉素链霉素, ,卡那霉素卡那霉素的的致聋致聋;四环素四环素使牙变黑使牙变黑四四环素牙环素牙)问题而困扰着医药卫生界。问题而困扰着医药卫生界。 但是科学家们仍在不断地探索,不断地调整思路。用化学的方法化学的方法对老抗生素进行改造改造，得到了很多疗效好，副作用小的半合成抗生素。 1.青霉素活性母核的发现：青霉素活性母核的发现： 经过科学家的不断努力，1958年发现了： 青霉素的活性母核青霉素的活性母核 -6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-APA) 头孢菌素的活性母核头孢菌素的活性母核-7-氨基头孢烯酸氨基头孢烯酸(7-ACA) 以上两种活性母核活性母核可由青霉素和头孢菌素C裂解裂

31、解得到得到. 20世纪80年代以及近些年，由青霉素青霉素进行化学扩环化学扩环分别获得了: 7-氨基脱乙酰氧头孢烯酸(7-ADCA) 氯甲基头孢苄酯(GCLE) 两种母核。 用化学方法对这些母核重新装配不同的侧链,则获得了许许多多具有: 扩大抗生谱、增强抗菌活力 、改善药物代谢动力学 、 耐酸耐酶 、 抑制耐药菌等新特性的各种半合成青霉素和半合成头孢菌素，从而使抗生素时代再现出柳暗花明又一村的新局面。 目前，半合成青霉素和半合成头孢菌素的品种已不下于70个，产量和销售量均占据了抗生素的大半壁江山大半壁江山。2. 新的含新的含-内酰胺环抗生素的发现内酰胺环抗生素的发现： 1970-1980年，又先

32、后发现了微生物产生的： 头霉素头霉素(7 -甲氧基头孢菌素）、甲氧基头孢菌素）、 碳青霉碳青霉烯、单环烯、单环-内酰胺内酰胺 等新的含等新的含-内酰胺环内酰胺环的抗生素，并相应开发出各种能够用于临床的抗生素，并相应开发出各种能够用于临床的半合成产品，使的半合成产品，使半合成半合成-内酰胺抗生素内酰胺抗生素家家族进一步扩大。族进一步扩大。 3.其他半合成抗菌素的发展：其他半合成抗菌素的发展： 在半合成-内酰胺抗生素取得巨大成功的鼓舞下：半合成卡那霉素 、半合成四环素、半合成红霉素 等得到长足的发展，特别是半合成红霉素，因其药效和药动学的显著改善而更加引起世人注目。 直到现在，用半合成方法改造已有

33、的抗生素仍是开发临床上有效抗生素的重要途径。五、微生物药物应用范围的扩大五、微生物药物应用范围的扩大 1. 微生物产生的抗肿瘤物质：微生物产生的抗肿瘤物质： 嗜癌菌素 、放线菌素D、肉瘤霉素、丝裂霉素、色霉素、道诺霉素、 新制癌霉素、博来霉素、 阿霉素 等 一个接一个的被发现，目前多数仍在临床上使用。 人们把具有抗癌活性的微生物代谢产物也归为抗生素。 2. 微生物产生的酶抑制剂：微生物产生的酶抑制剂： 大家都知道：生物体内每时每刻都在进行的物质代谢（生物化学变化）均是在酶的催化下进行的。因此，酶的紊乱是引起各种非感染性疾病的重要原因。如： 非淋巴细胞白血病、高胆固醇血症、 糖尿病、高血脂、高血

34、糖、肥胖等疾病。对人类健康的危害日益显得突出。（ 1）. 乌苯美司 是细胞表面氨肽酶B的抑制剂。 因其具有免疫调节作用而用于某些 癌症如：非淋巴细胞性白血病的辅助治疗。（ 2）. 洛伐他定、普伐他定、辛伐他定（半合成）是肝脏-羟基- -甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂。 肝脏-羟基- -甲基戊二酰可生成：甲羟戊酸是合成胆固醇的中间物质。 因此以上三种微生物药物可用于治疗高胆固醇血症。（3）. 阿卡糖 、奥洛里糖、米格列醇是唾液腺和胰腺-葡萄糖苷酶的抑制剂。可用于治疗糖尿病。 （4）. 奥里司他奥里司他胰脂酶的抑制剂。胰脂酶的抑制剂。可用于可用于 减肥和控制高血脂、高血糖。减肥和控制高血脂、高血糖

35、。 3. 免疫抑制剂的应用：如：免疫抑制剂的应用：如： 抗真菌抗生素抗真菌抗生素环孢菌素环孢菌素A在在1970年被发年被发 现和证明还有免疫抑制作现和证明还有免疫抑制作 用。自用。自80年代中期已成功年代中期已成功 地应用于：地应用于：防治器官移植防治器官移植 后的免疫排异反应。后的免疫排异反应。 后来又发现： 藤霉素 雷帕霉素 也具有同样的免疫抑制作用， 且活性较强、副作用较轻，引 起医学界的广泛瞩目。4.4.免疫激活剂的应用：（用于免疫力低下的免疫激活剂的应用：（用于免疫力低下的人）人） 裂褶菌素、云芝多糖、香菇多糖、一些病原细菌的灭活细胞、破壁灵芝粉（液）等已在临床上用来进行抗癌、抗病毒

36、的辅助治疗；或用于治疗慢性支气管炎慢性支气管炎及创伤性溃创伤性溃疡。疡。 上述（抗微生物和抗癌活性物质）以外的微生物药物，被称为微生物产生的药理活性物质，也叫作广义抗生素。六、药用微生物研究开发的趋势六、药用微生物研究开发的趋势1、非抗生素类非抗生素类生物活性化合物的数量持续增数量持续增加加，使药用微生物的应用范围不断扩展应用范围不断扩展。2、抗微生物活性化合物的作用靶由细菌扩大作用靶由细菌扩大到其他微生物到其他微生物。(如：真菌、病毒、原虫以及微生物以外的生物如：寄生蠕虫、昆虫 等）。3、被发现的药用微生物种类不断扩大种类不断扩大。4、重组DNA技术的应用5、老抗生素老抗生素及其半合成衍生物

37、半合成衍生物不断发现新的生物学活性、开发新的应用。第二节、药用微生物的来源和分离第二节、药用微生物的来源和分离方法方法一、来源：一、来源：二、具有医药品生产价值的微生物：二、具有医药品生产价值的微生物：三、药用微生物的分离：三、药用微生物的分离：一、来源（一）土壤中的微生物（一）土壤中的微生物（二）海洋中的微生物（二）海洋中的微生物（三）热带地区的微生物（三）热带地区的微生物 （四）极端环境中的微生物（四）极端环境中的微生物（五）基因重组微生物（五）基因重组微生物 （一）、土壤中的微生物（一）、土壤中的微生物1、土壤中各种微生物的数量：、土壤中各种微生物的数量： 土壤土壤是微生物资源的宝库。是

38、微生物资源的宝库。 1g普通土壤中大约含有：普通土壤中大约含有：1亿个细菌亿个细菌 1千万个放线菌孢子千万个放线菌孢子 1百万个真菌孢子百万个真菌孢子2、微生物在土壤中的一般分布规律：、微生物在土壤中的一般分布规律：（1）含有机氮较多有机氮较多的中性中性及微碱性微碱性土壤中： 细菌细菌和放线放线菌占多数。（2）含有机氮少的酸性土壤中有机氮少的酸性土壤中：真菌真菌较多。（3）真菌真菌多生活在土壤表层土壤表层。（4）细菌放线菌可延伸到土层深处（细菌放线菌可延伸到土层深处（1米米）（5）近植物根系较多、远则较少。近植物根系较多、远则较少。（二）海洋中的微生物（二）海洋中的微生物 1、海水的特点：（1

39、）盐分含量高。（2）水温低。（3）有机质含量少。（4）海底承受的水压高。 2、海洋中微生物的特性：、海洋中微生物的特性：（1）嗜压（或耐压）（2）嗜盐（或耐盐）（3）低营养要求（4）可在低温下生长 3、海洋微生物的分布特点：、海洋微生物的分布特点：（1）沿海岸比外海密度高（特别是江河入口及近海养殖场海域）（2）海面20-25米之上，微生物密度高，随 水深增加则密度下降，至海底淤泥又急剧升高。（3）砂砾海底数量偏低，1千米以上的海底中主要为嗜压细菌，其他微生物很少。（4）浅海水中的微生物对明胶、酪蛋白等蛋白质的分解力高于对淀粉的分解力。（三）热带地区的微生物（三）热带地区的微生物 1、 热带地区

40、的特点：热带地区的特点： （1）高温、高湿。 （ 2）自然环境复杂、多变。2、热带地区微生物资源的数量热带地区微生物资源的数量 热带地区热带地区生存的生物极具多样性，也蕴藏着丰富的微生物资源。如： 热带雨林只占地球面积的3.3，而生长着的生物种类却在50 以上。 所以，从热带雨林 、热带深草原、 热带沼泽等地的土壤、水流及动植物中分离药用微生物的前景是十分诱人的。（四）极端环境中的微生物（四）极端环境中的微生物 高温 、高压、高盐、高寒、强酸 、强碱 等条件下生长的微生物，也有着重要的开发价值。 不同的生境，生长着不同的微生 物。在特定的环境中可以找到特定的药用微生物。（五）基因重组微生物（五

41、）基因重组微生物1、在生产生物活性蛋白方面应用、在生产生物活性蛋白方面应用 ： 这类微生物首先在生产人体内固有的微量生物活性蛋白方面取得 了突破。如，将人类产生： 生长激素 红细胞生成素 胰岛素 等基因导入细菌或酵母菌一 类的微生物中进行表达，利用微生物 生长快、易培养的优点，大量生产这类活性蛋白，用于因体内缺失这类蛋白所致疾病的治疗。 这类重组蛋白类药物又称为基因工程药物。 2、在抗生素和药理活性物质生产方面、在抗生素和药理活性物质生产方面的应用：的应用： 在这方面也取得了很大进展，并创立了组合生物合成这门新的学科。 组合生物合成是将生产不同抗生素或药 理活性物质中间体的基因 重组到一种微生

42、物中，使生 物合成途径重新组合，生产 迄今自然界还没有的新抗生 素或药理活性物质。如下图： 将将放线菌紫素放线菌紫素产生菌的产生菌的梅得霉素梅得霉素产生菌中产生菌中萘醌环羟化萘醌环羟化基因基因导入导入重组重组微生物微生物获获得得新抗生素新抗生素产生产生梅得紫素梅得紫素A A梅得紫素梅得紫素B B 也可应用组合生物合成技术提高已有抗生素的产量或有效组分含量，或生产半合成抗生素中间体。 目前，已经工业化或接近工业化的成果是由重组微生物直接生产： 7-氨基脱乙酰氧头孢烯酸（7-ADCA） 7-氨基头孢烯酸 （7-ACA） 以及提高抗生素提高抗生素如： 红霉素 头孢菌素 青霉素 等的产量产量。二、具有

43、医药品生产价值的微生物二、具有医药品生产价值的微生物1、自然界已发现的药用微生物类群分布：、自然界已发现的药用微生物类群分布： 类群 产生抗生素和药理 所占比例 活性物质大致数量 细菌 1100 11.7 放线菌 6400 68.1 真菌 1900 20.2 合计 9400 100 从土壤中随机 产生的新抗生素和 分离的放线菌： 药理活性物质占 链霉菌属占 80-90 70 左右 稀有放线菌占 10-20 30 左右2、不同的微生物产生不同的抗生素如：、不同的微生物产生不同的抗生素如： 芽孢杆菌属芽孢杆菌属的细菌产生的抗生素几乎都是多肽类抗生素。 链霉菌属或小单孢菌属链霉菌属或小单孢菌属产生的

44、抗生素几乎都是大环内酯和多烯大环类抗生素。 3、多数情况下：一类微生物可产生多种抗生素；一种抗生素也可由多种微生物产生。 4、研究过的药用微生物占自然界已知属、研究过的药用微生物占自然界已知属、种的数量：种的数量： 细菌、放线菌为： 20-25 真 菌为： 10-15 因此，具有医药品生产价值的微生物，今后还会有相当大的开发潜力开发潜力。三、药用微生物的分离三、药用微生物的分离 从自然界分离具有不同特性的不同类群微生物，是研究它们产生的抗生素和药理活性物质的第一步。自然界生存着无数的微生物，它们中什么样的属种能够产生什么样的有用物质，目前尚无一定规律，从中分离有用的菌种，就像从大海捞针一样。

45、因此，分离药用微生物因此，分离药用微生物： 首先要有数量，既每年都要成千上万地对自然界的微生物进行分离； 还要有好的方法，能够识别和分离那些不常见的和人工难以培养的微生物属种。 （一）土样的采集和预处理（一）土样的采集和预处理、土样的采集：、土样的采集： 要尽可能的选择：各种不同地理和生态环境的土壤及不同深度的土层。2、土样的预处理：、土样的预处理：分离的微生物不同，处理的方法亦不同。 （1）物理法）物理法: A、风干法：、风干法： 简单风干的方法可以大部分排除不产芽孢的细菌，特别是革兰氏阴性细菌；而增加产孢子放线菌的检出机会。 B、干热法：、干热法： 放线菌的孢子耐干热，将风干的土样在干燥状

46、态下加热到120，可杀死不产芽孢的细菌却仍保留放线菌的孢子。 注意：放线菌的孢子不耐湿热，加热的极限温度为45-50，小单孢菌可以加热到 60-75 （2）化学法：）化学法： 采用化学处理方法必须考虑所要分离的微生物对所用化学药品的抗性及对不同养分的需要。 主要是通过分离培养基进行调节。（二）分离培养基（二）分离培养基1、分离、分离细菌细菌用的培养基：用的培养基： 一般采用普通肉膏琼脂肉膏琼脂培养基。 在培养基中： 加入亚胺环己酮或其它抗真菌药物，可抑制霉菌的生长。 加入多粘菌素可抑制革兰氏阴性菌的生长。2、分离放线菌的培养基、分离放线菌的培养基 一般采用: (1)高氏1号培养基 (2) 葡萄

47、糖-天冬素琼脂培养基： 葡萄糖 10 g 天冬素 0.5g K2HPO4 0.5g 琼脂 15-20g pH 7.0 蒸馏水 1000ml 抑制不同杂菌加入不同药品抑制不同杂菌加入不同药品 （1） 加入制霉菌素或亚胺环己酮抑制霉抑制霉菌。菌。 （2）不加蛋白胨和氨基酸可限制芽孢杆菌限制芽孢杆菌的发芽。 （3）胶体壳多糖琼脂培养基可使孢囊菌属放线菌优先生长；也被用来选择性地分离小单小单孢菌。孢菌。 （4） 用用腐殖酸腐殖酸作为碳源、氮源，辅以各作为碳源、氮源，辅以各种种维生素维生素，可以分离得到，可以分离得到多种不同属多种不同属的放线的放线菌，而且菌，而且孢子孢子生长良好。生长良好。 典型培养基

48、典型培养基配方为：配方为： 腐殖酸腐殖酸1.0g（溶于溶于10ml0.2mol/LNaOH溶液中溶液中） Na2HPO4 0.5g、KCl 1.7g 、MgSO47H2O 0.05g、FeSO47H2O 0.01g、CaCO30.02g、亚胺环己酮亚胺环己酮50mg、复合维生素溶液、复合维生素溶液10ml（内内含盐酸硫胺素、核黄素、盐酸比多醇、肌醇、泛酸含盐酸硫胺素、核黄素、盐酸比多醇、肌醇、泛酸钙、对氨基苯甲酸、烟酸各钙、对氨基苯甲酸、烟酸各0.5mg;0.5mg;生物素生物素0.25mg0.25mg，过滤除菌）过滤除菌），琼脂琼脂18g、加蒸馏水至、加蒸馏水至1000ml、pH7.2。 分

49、离海洋放线菌可采用以下两种培养基：分离海洋放线菌可采用以下两种培养基：（1）可溶性淀粉10 g 酪蛋白1g 海水海水 500ml 蒸馏水500ml 琼脂 15 -20g pH 7.4 -7.6 （2）蛋白胨 5g 磷酸铁 0.1g 酵母提取物 1g 海水海水 1000ml 琼脂 15-20g pH 7.4-7.6 加入某些特定的抗菌剂可以分离得到一些特殊的放线菌属、种，如马杜拉放线菌、小单孢菌等。 采用贫乏培养基可以减慢生长快减慢生长快的微生物的生长速度，给生长慢生长慢的微生物留下一些生生长空间长空间，故分离的菌落种类菌落种类一般多于丰富的培养基。 分离平板培养基表面的表面的水分有利于革兰氏阴

50、性细菌的生长和扩散，影响放线菌孢子的发芽和生长。因此，分离平板培养基配制好后，应在37下孵育一段时间，待表面不存在肉眼可分辨的水雾后才可使用。3、分离真菌的培养基、分离真菌的培养基： 一般采用查氏培养基。加氯霉素、或四环素或其它抗细菌抗生素，可以排除大部分细菌的生长。 大家应该注意的是大家应该注意的是： 不存在能够分离各种微生物的万能培养基。为了尽可能获得更多属、种的微生物 ，应当同时使用多种分离培养基。（三）分离方法（三）分离方法1、水悬浮稀释法、水悬浮稀释法稀释混合平板法（稀释混合平板法（湿法分离）湿法分离）2、干土喷射法、干土喷射法：（：（干法分离）干法分离） 用一种特制的喷土器特制的喷

51、土器将研碎的干土样直接喷射到分离平板上，根据： 土样的多少、喷射距离的远近、 喷射角度 、 来调节每个平板的喷射量。 此种方法比湿法分离，简单、方便，不同的喷射角度还有可 能分离得到不同的放线放线菌。菌。 但对喷射量的掌握要经过一段时间的经验一段时间的经验摸索。摸索。3、孢子飞扬法：、孢子飞扬法： 是将土样放在一种瓶口刚好能倒扣在一个瓶口刚好能倒扣在一个分离平板的特制瓶中分离平板的特制瓶中，剧烈振荡使孢子飞扬，撞在分离平板上，进行分离培养。可分离得到许多典型的放线菌属许多典型的放线菌属。4、微孔滤膜法：、微孔滤膜法： 在分离培养基表面覆盖孔径为覆盖孔径为0.45 m的的微微孔滤膜孔滤膜，然后将

52、土样接种到滤膜上将土样接种到滤膜上，在室温下培养一段时间。 丝状放线菌可以透过滤孔丝状放线菌可以透过滤孔，深入到下面的培养基中生长，而单细胞细，深入到下面的培养基中生长，而单细胞细菌停留在滤膜表面。揭取滤膜菌停留在滤膜表面。揭取滤膜后继续培养，琼脂平板上长出得差不多全是放线菌菌落。 这是选择性这是选择性 的分离放线菌的一种十分简的分离放线菌的一种十分简便的方法便的方法（四）、培养时间和温度（四）、培养时间和温度 分离的目标菌不同目标菌不同，培养时间和温度不同培养时间和温度不同。 一般 ： 细细 菌：菌：37 3-5天天 真真 菌：菌：25-28 5-10天天 放线菌：放线菌：28-30 2-4

53、周周 （五）菌种纯化（五）菌种纯化 平板上长出的各种单菌落如果过于密集，平板上长出的各种单菌落如果过于密集，为防止不同菌落之间相互污染，需要将菌落为防止不同菌落之间相互污染，需要将菌落挑出后再进行平板分离。确认获得比较纯的挑出后再进行平板分离。确认获得比较纯的单菌落后，接种斜面，进行代谢产物的筛选单菌落后，接种斜面，进行代谢产物的筛选和短期保存。和短期保存。第三节第三节 微生物药物的研究与开发微生物药物的研究与开发一、微生物药物研究开发的一般程序一、微生物药物研究开发的一般程序二、微生物药物的筛选方法二、微生物药物的筛选方法三、微生物药物的安全性与有效性评价三、微生物药物的安全性与有效性评价一

54、、微生物药物研究开发的一般程序一、微生物药物研究开发的一般程序 以从自然界分离各种微生物菌株开始的微生物药物的研究与开发，是一个漫长漫长的过程，主要包括以下步骤：样品采集样品采集平板分离平板分离斜面培养斜面培养摇瓶发酵摇瓶发酵一次筛选一次筛选有无活性有无活性小发酵罐发酵小发酵罐发酵 提取提取粗提物粗提物（20-50 ）二次筛选二次筛选有无活性有无活性 纯度纯度（纯度）（纯度）90 稳定性研究稳定性研究 是否稳定是否稳定其他模型筛选其他模型筛选 放弃放弃化学修饰或放弃化学修饰或放弃动物药效学研究动物药效学研究理化性质和化学结构研究理化性质和化学结构研究无无 无无有有产生菌鉴定产生菌鉴定长期保存长

55、期保存是否新化合物是否新化合物是否有效是否有效是否新药理活性是专利申请专利申请否否否是是否否放弃放弃是是放弃放弃毒理研究毒理研究药动学和药代学研究药动学和药代学研究制剂研究制剂研究 是否符合要求是否符合要求否否化学修饰或放弃化学修饰或放弃是是工艺研究工艺研究专利申请专利申请是是临床试验临床试验是否安全有效是否安全有效否否放弃放弃是报批生产报批生产上市上市否否是是（23年）年）（36年）年）二、微生物药物的筛选方法二、微生物药物的筛选方法 得到产药物的微生物产药物的微生物后，还要从这些微生物的代谢产物中把我们所需要的药物筛选出来药物筛选出来 。 药物筛选药物筛选是指应用精心设计的各种模型， 在浩

56、如烟海的成千上万个代谢产物千上万个代谢产物中中，将所需要的药理活性物质药理活性物质鉴别出来的过程。是新药研究是新药研究的最初过程和关键步骤的最初过程和关键步骤 ，其目的是发现新药。，其目的是发现新药。 （一）、药物筛选（一）、药物筛选模型：1、 药物筛选药物筛选模型的概念： 药物筛选模型药物筛选模型是用于证明某种物质具有药药理活性理活性(生物活性、治疗作用生物活性、治疗作用) 的实验方法实验方法，这些实验方法是寻找和发现药物的重要条件实验方法是寻找和发现药物的重要条件之一。之一。 人们在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极作用。每一种模型都每

57、一种模型都源于一种新技术的诞生。这些模型各有利源于一种新技术的诞生。这些模型各有利弊，要根据具体的试验选择合适的模型弊，要根据具体的试验选择合适的模型 。2、模型、模型的标准的标准： 一个好的筛选模型要求能够：简单、快速、灵敏、特异地检出需要的活性物质，同时可以有效地排除已知化合物。并且所有的并且所有的模型都必须满足进行高通量筛选的需要模型都必须满足进行高通量筛选的需要。（适合于大规模筛选）3、模型的种类：、模型的种类：（1）、微生物学模型: 是最简单、曾经应用最广泛、最简单、曾经应用最广泛、 最适合于高最适合于高通量筛选的模型通量筛选的模型。 并且在抗菌物质 的筛选中发挥过极其重要的作用，在

58、其他药理活性物资的筛选中也有过一定的价值。 （2）、整体动物模型：是最直观有效的模型、整体动物模型：是最直观有效的模型 整体动物模型就是以动物作为药物筛选的动物作为药物筛选的观察对象，以动物对药物的反应，证明某些观察对象，以动物对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值物质的药理作用，评价其药用价值。 由于正常动物正常动物并不能充分反应药物在病理条件下的治疗作用，在药物筛选中应用更多的是动物病理模型动物病理模型。理想的动物模型应具备的基理想的动物模型应具备的基本条件是病理机制与人类疾病的相似性、病理本条件是病理机制与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性。表现的稳定性

59、和药物作用的可观察性。 整体动物筛选模型的最大优点最大优点是可以从动物身上直观地反应出药物的治疗效果、不良反应以及毒副作用。由动物模型获得的筛选由动物模型获得的筛选结果，对预测被筛选样品的临床效果、毒副结果，对预测被筛选样品的临床效果、毒副作用和应用前景具有十分重要的价值作用和应用前景具有十分重要的价值。 整体动物筛选法的缺点整体动物筛选法的缺点：由于动物的特殊性，决定了药物筛选过程主要依赖于手工操手工操作，而且只能对有限的样品进行筛选，使动作，而且只能对有限的样品进行筛选，使动物模型筛选新药具有明显的局限性，效率物模型筛选新药具有明显的局限性，效率低、成本高。低、成本高。（3）、组织器官水平

60、的筛选模型）、组织器官水平的筛选模型 随着现代医学和现代药理学的发展，采用动物的组织、器官制备的药物筛选模型越来越多，如离体血管实验，心脏灌流实验、组离体血管实验，心脏灌流实验、组织培养实验织培养实验等方法。通过观察药物对特定组织或器官的作用，可以分析药物作用原理和可能具有的药理作用。组织、器官水平的筛组织、器官水平的筛选模型可以反映生理条件下的药物作用，也选模型可以反映生理条件下的药物作用，也可以制备成病理模型，观察药物对病理条件可以制备成病理模型，观察药物对病理条件下组织器官的作用。应用组织器官模型筛选下组织器官的作用。应用组织器官模型筛选药物，是药物筛选技术的一大进步。药物，是药物筛选技

61、术的一大进步。 离体组织器官模型的优点离体组织器官模型的优点：降低了筛选样品的降低了筛选样品的用量；降低劳动强度，扩大筛选规模；减少动物用量；降低劳动强度，扩大筛选规模；减少动物用量，特别是有些模型仅使用一小部分组织器官用量，特别是有些模型仅使用一小部分组织器官，同一时间内可以进行多样品的筛选，提高了筛，同一时间内可以进行多样品的筛选，提高了筛选效率，降低了筛选成本；减少了影响药物作用选效率，降低了筛选成本；减少了影响药物作用的因素，易于评价药物作用。的因素，易于评价药物作用。 组织器官水平的筛选模型进行药物筛选也存在明显的缺点缺点：规模小、效率低、反应药物作用有规模小、效率低、反应药物作用有

62、限、不易实现一药多筛。此外，人工操作技术要限、不易实现一药多筛。此外，人工操作技术要求高等也是影响其在药物筛选中应用的主要原因求高等也是影响其在药物筛选中应用的主要原因之一。之一。（4）、）、生化模型生化模型： 随着疾病的生化机理被不断阐明，生化模随着疾病的生化机理被不断阐明，生化模型开始用于药理活性物质的筛选。型开始用于药理活性物质的筛选。 但因许多生化反应目前在体外难以进行，但因许多生化反应目前在体外难以进行，使这一方法的应用也有一定的局限。使这一方法的应用也有一定的局限。（5 5）、细胞、分子水平药物筛选模型）、细胞、分子水平药物筛选模型 由于近年来分子生物学技术和细胞生物学技术的快速发

63、展，分子药理学研究也不断深入，新的药物作用靶点、功能蛋白质、基因表达的变化，生物活性成分等不断发现，为药物筛选提供了大量新的靶点，这些新的靶点为新药筛选提供了新的信息和机会。 细胞分子水平药物筛选模型的应用为自动化操作奠定为自动化操作奠定了基础了基础，使药物筛选由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系， 形成了高高通量通量药物筛选。药物筛选。 高通量药物筛选的优点高通量药物筛选的优点：实现了药物筛选的规规模化模化，较大限度地利用了药用物质资源，提高了药较大限度地利用了药用物质资源，提高了药物发现的概率，同时提高了发现新药的质量；筛选物发现的概率，同时提高了发现新药的

64、质量；筛选实验是在微量筛选系统中完成的，样品用量一般在实验是在微量筛选系统中完成的，样品用量一般在微克级微克级( g) ，节省了样品资源，节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础，同时节省了实验材料，降低了单节省了实验材料，降低了单药筛选成本药筛选成本；高通量药物筛选为高度自动化操作减为高度自动化操作减少了操作误差的发生，降低了劳动强度，而且提高少了操作误差的发生，降低了劳动强度，而且提高了药物筛选的效率和结果的准确性；具有多学科理了药物筛选的效率和结果的准确性；具有多学科理论和技术结合的特点。论和技术结合的特点。 高通量药物筛选的缺点：高通量药物筛选的缺点：高通量筛选所采用的主要是分子、

65、细胞水平分子、细胞水平的体外实验模型体外实验模型，任何模任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用型都不可能充分反映药物的全面药理作用；用于高通量筛选的模型总是有限的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。 药物筛选模型是发现新药的重要条件。新模型药物筛选模型是发现新药的重要条件。新模型的建立将会带动新型药物的出现。分子生物学、细的建立将会带动新型药物的出现。分子生物学、细胞生物学、计算机科学的发展，特别是人类基因组胞生物学、计算机科学的发展，特别是人类基因组计划的完成，为医药研究带来了良好的机遇，也为计划的完成，为医药研究带来了良好的机遇，也为建立新的药物筛

66、选模型，提供了理论、技术、材料建立新的药物筛选模型，提供了理论、技术、材料等多方面的优势条件。因此，我们应充分利用各学等多方面的优势条件。因此，我们应充分利用各学科的发展技术建立更多新的筛选模型，促进新药的科的发展技术建立更多新的筛选模型，促进新药的发现。发现。（二）、药物筛选的种类（二）、药物筛选的种类 1 1、- -内酰胺类抗生素的筛选内酰胺类抗生素的筛选-内酰胺类抗生素:是指化学结构中含有-内酰胺环并具有抗细菌活性的一类天然和天然和合成化合物的总称。合成化合物的总称。 作用机理：特异性的抑制细菌细胞壁的 合成。因此，对无细胞壁结无细胞壁结 构的哺乳动物细胞几乎没有构的哺乳动物细胞几乎没有

67、 毒性。毒性。（1）、）、 - -内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素超敏感菌株超敏感菌株的应的应用：用：超敏感菌株的制备：N-甲基甲基-N-硝基亚硝基胍硝基亚硝基胍三步诱变三步诱变超敏感突变株超敏感突变株铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 出发菌株出发菌株头胞菌素头胞菌素C对对超敏感菌株超敏感菌株的最低抑制浓度的最低抑制浓度： 出发菌株出发菌株: 1000g/ml 超敏感突变株： 0.05g/ml 该突变株对-内酰胺以外的抗生素敏感性无明显变化，故可用于特异性地检出-内酰胺类抗生素。（2）、检菌细胞形态变异的应用： 由于-内酰胺类抗生素抑制细胞壁的合成，从而可使细菌发生各种形态变化，如： 细胞延长 部分突起

68、形成原生质球 等 这一特性可用来筛选-内酰胺类抗生素和 其他细胞壁合成抑制剂。筛选方法如图筛选方法如图：发酵液发酵液离心离心上清液上清液小纸片小纸片大肠杆菌平板大肠杆菌平板1ml0.5ml大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液+青霉素酶青霉素酶37培养培养24小时小时肉眼及显微镜观察纸片周围肉眼及显微镜观察纸片周围大肠杆菌生长及形态变异情况大肠杆菌生长及形态变异情况显微镜观察原生质球的形成显微镜观察原生质球的形成 采用这一方法，先后发现了很有价值的7-甲氧基头孢菌素甲氧基头孢菌素头霉素头霉素；第一个碳青霉烯类抗生素噻烯霉素噻烯霉素，以及非-内酰胺类细菌细胞壁合成抑制剂磷霉磷霉素。素。（3）、）、 - -内内

69、酰胺酶抑制活性的检测 众所周知：某种酶底物的类似物往往就是该酶的抑制剂。而-内酰胺酶抑制剂本身就可能是在某些方面结构与底物有所不同的- -内酰胺类化合物内酰胺类化合物。 因此- -内酰胺酶抑制活性的检测有可内酰胺酶抑制活性的检测有可能成为筛选新的能成为筛选新的- -内酰胺抗生素的重要内酰胺抗生素的重要途径。途径。 方法如下方法如下： 将沾取微生物发将沾取微生物发酵液的滤纸片酵液的滤纸片加入含青霉素加入含青霉素G和青霉素酶并混和青霉素酶并混入金黄色葡萄球入金黄色葡萄球菌的平板上菌的平板上产生抑菌产生抑菌圈说明有圈说明有酶抑制剂酶抑制剂不产生抑不产生抑菌圈则无菌圈则无酶抑制剂酶抑制剂 也可将-内酰

70、胺酶产生菌，如： 对青霉素耐药青霉素耐药的产气克雷伯氏菌产气克雷伯氏菌直接用做检菌，这样平板中不需加入-内酰胺酶。 还可以用被- -内酰胺酶水解后产生颜色内酰胺酶水解后产生颜色的的- -内酰胺化合物内酰胺化合物如：硝色芬作为底物，在琼脂平板上或试管内根据颜色的变化来检测- -内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂。 （4）、 -内酰胺酶诱导活性的检测 -内酰胺抗生素既然是-内酰胺酶的底物，就有可能诱导某些革兰氏阳性或革兰氏阴菌产生-内酰胺酶。因此，可利用能在： 水解后产生颜色的一种头胞菌素作底物，通过检测诱导的-内酰胺酶活性对-内酰胺抗生素进行筛选。方法如下：检菌检菌：地衣形芽孢杆菌 (SC9262)

71、此菌在不与不与- -内酰胺抗生素接触时内酰胺抗生素接触时只产生很少量的难以检出的-内酰胺酶；而当有- -内酰胺内酰胺化合物存在时化合物存在时，便产生大量 可用生色头孢菌素生色头孢菌素检测到的-内酰胺酶。菌液制备菌液制备：将检菌接种到装有300ml肉汤的500ml的摇瓶中，置于150r/min的摇床上于28 培养过夜。 检测：检测： 在冷却到50的检测用琼脂中，加入 20%（体积分数）的菌液，摇匀后注入培养皿中,凝固成检测平板，加入沾有待筛选发酵液的小纸片，于37培养2-3小时，然后在平板表面喷洒少量生色头孢菌素溶液，若纸片周围很快显示出一圈因生色头孢菌素水解形成的红色，既说明发酵液中含有诱导-

72、内酰胺酶生成的-内酰胺化合物。 这一方法对-内酰胺化合物有很高的检出特异性，迄今只发现一种细菌产生的-内酯呈假阳性。 检出灵敏度比形态变异法高好几个数量级，比超敏感菌株法高15倍（见表）各种检测方法对青霉素各种检测方法对青霉素G G钾的检出限钾的检出限 检测方法检测方法 检出极限检出极限/ng1、 地衣芽孢杆菌-内 酰胺酶活性诱导 1 2、大肠杆菌超敏感菌株 153、 细胞形态变异（1） 细胞延长 200 （2）形成原生质球 3000 上述方法联合应用，在-内酰胺抗生素的筛选中取得了相当大的成功。 2、其他抗细菌抗生素的筛选、其他抗细菌抗生素的筛选（1）、氨基糖苷抗生素）、氨基糖苷抗生素 是一

73、类碱性水溶性抗生素。 作用机理作用机理：作用于细菌蛋白质的合成 破坏细胞质膜 抑制DNA的早期合成 因此，呈广谱抗菌活性，对抗酸性葡萄球菌、革兰氏阴性细菌等有较好的杀菌或抑菌 作用。氨基糖苷抗生素产生菌氨基糖苷抗生素产生菌 产生菌很多，有：链霉菌、小单胞菌、链霉菌、小单胞菌、其他稀有放线菌、细菌等。其他稀有放线菌、细菌等。 抗生素产生菌一般对本身产生的抗生素具有耐药性，而且在同类抗生素之间呈交叉耐药性，氨基糖苷抗生素也不例外。 因此，可以从对氨基糖苷抗生素耐对氨基糖苷抗生素耐药的菌株中筛选得到新的氨基糖苷抗药的菌株中筛选得到新的氨基糖苷抗生素产生菌。生素产生菌。 也可以用对氨基糖苷抗生素高度敏

74、感高度敏感的突变株作检菌；或者通过检测使氨基的突变株作检菌；或者通过检测使氨基糖苷抗生素失活的酶的抑制剂，或诱导糖苷抗生素失活的酶的抑制剂，或诱导剂等筛选得到新的氨基糖苷抗生素。剂等筛选得到新的氨基糖苷抗生素。（2）、大环内酯抗生素和安沙抗生素）、大环内酯抗生素和安沙抗生素 这两类抗生素均为脂溶性、抗革兰氏阳性脂溶性、抗革兰氏阳性菌、低毒、可以口服，后者还有抗癌和抗病菌、低毒、可以口服，后者还有抗癌和抗病毒活性。毒活性。 大环内酯抗生素大环内酯抗生素抑制细菌蛋白质蛋白质的合成，几乎都由链霉菌或小单孢菌产生。 安沙抗生素安沙抗生素抑制细菌核酸的合成，产生菌主要为链霉菌，其次是诺卡氏菌和小单孢菌。

75、 以上两种抗生素产生菌以上两种抗生素产生菌也都对自身自身产生的抗生素表现出耐药性耐药性，并且也在同同类抗生素类抗生素中具有交叉耐药性交叉耐药性，因此，这两类抗生素都可以从耐药的各种放线菌耐药的各种放线菌中筛选。中筛选。 凡呈交叉耐药性，脂溶性及对革兰氏阳性细菌有抗菌活性的化合物，都可以初步确定是这两类抗生素。（3）、糖肽类抗生素糖肽类抗生素 这类抗生素目前在临床上使用的主要是万古霉素和替考拉宁。 它们的抑菌机理同-内酰胺抗生素一样：抑制细菌细胞壁的合成抑制细菌细胞壁的合成。 由于它们对厌氧菌厌氧菌及耐甲氧西林耐甲氧西林的金金黄色葡萄球菌黄色葡萄球菌有效；且与其他抗生素几且与其他抗生素几乎都不发

76、生交叉耐药，因而在抗感染化乎都不发生交叉耐药，因而在抗感染化疗中具有重要的临床价值。疗中具有重要的临床价值。 但这类抗生素肾毒性较强，同时为了延缓对其耐药细菌的产生和传播产生和传播，应尽量防止滥用，故一般只作为三线用药，即抗感染的最后一道防线来使用。这类抗生素可由各种微生物产生，凡是在筛选中遇到与其它抗生素几乎不发生与其它抗生素几乎不发生交叉耐药交叉耐药，化学性质介于脂溶性和水溶性之间的抗菌物质，大部分可被确认为这一类抗生素。3、抗真菌抗生素的筛选、抗真菌抗生素的筛选（1）、超敏感检菌的应用）、超敏感检菌的应用 支原体对一些抗真菌抗生素的敏感度是一真菌抗生素的敏感度是一般酵母和霉菌的数千倍般酵

77、母和霉菌的数千倍，因而可以用支原体作为检菌进行抗真菌抗生素的筛选。（2）、对影响真菌形态分化的检测）、对影响真菌形态分化的检测 毛霉一类霉菌，平常成菌丝形态，但在某种条件下可以分化成酵母状；念珠菌等，平常为酵母状，在一定条件下形成假菌丝，故又称为假丝酵母假丝酵母。人和动物体内深部感染的真菌，多半呈这种二形性。见表：深部感染真菌的二形性深部感染真菌的二形性 病原真菌病原真菌 培养基上培养基上 病灶中病灶中白色念珠菌白色念珠菌 酵母状酵母状 酵母状或菌丝状酵母状或菌丝状夹膜组织胞浆菌夹膜组织胞浆菌 菌丝状菌丝状 酵母状酵母状德氏芽酵母德氏芽酵母 菌丝状菌丝状 酵母状酵母状申克侧孢申克侧孢 菌丝状菌

78、丝状 酵母状酵母状球囊孢酵母球囊孢酵母 菌丝状菌丝状 酵母状酵母状 病原真菌的这种形态变化，与感染后的发病与否及传染性的强弱有很密切的关系。 例如：白色念珠菌平常呈酵母形态，是感染 人类的强病原菌，而它的菌丝状突变株完全失去病原性；但病原性白色念珠菌的假丝状细胞比酵母状细胞具有更强的传染性。 因此，可以通过筛选能控制真菌这种因此，可以通过筛选能控制真菌这种形态形态分化分化的物质，有可能获得抑制真菌病原性或的物质，有可能获得抑制真菌病原性或传染性的抗真菌抗生素。传染性的抗真菌抗生素。 筛选操作可采用筛选操作可采用琼脂平板滤纸片法琼脂平板滤纸片法，培养培养基基应能应能稳定地稳定地使检菌成使检菌成一

79、种形态一种形态生长。生长。（3）、以引起检菌形态异常为指标 抗真菌药物和抗真菌抗生素能引起某些真菌发生菌丝膨胀、弯曲、异常分枝菌丝膨胀、弯曲、异常分枝等形态变化。因此，可利用这一现象进行抗真菌抗生素的筛选。 方法同上。（4）、壳多糖合成酶抑制剂的筛选）、壳多糖合成酶抑制剂的筛选 真菌细胞壁的化学构成大家都知道： 霉菌的细胞壁成分主要是：壳多糖和葡聚糖。 酵母菌主要为：甘露聚糖甘露聚糖、壳多糖和葡聚糖。 可以看出：他们的共同点都有壳多糖 因此，壳多糖生物合成的完全缺失对临床上 重要的病原真菌都是致死的。所以，以壳多糖的生物合成为作用靶，有可能筛选得到高效、低毒的抗真菌抗生素。 筛选方法主要有以下

80、几种：筛选方法主要有以下几种：用放射性标记的壳多糖前体N-乙酰葡糖胺作为壳多糖合成酶的底物，测定被筛发酵测定被筛发酵液对放射活性掺入酶催化反应产物壳多糖的液对放射活性掺入酶催化反应产物壳多糖的抑制情况。抑制情况。以带有荧光的壳多糖前体1-二甲基萘-5-磺酰N-乙酰葡糖胺作为底物，用荧光显微镜观察检菌白色念珠菌细胞壁的荧光反应，确确定被筛发酵液对这一荧光反应的抑制作用。定被筛发酵液对这一荧光反应的抑制作用。 （5）、葡聚糖和甘露聚糖合成酶抑制剂的筛选选 这类抑制剂一般用放射性标记的葡聚糖或放射性标记的葡聚糖或甘露聚糖为底物，进行酶法筛选。甘露聚糖为底物，进行酶法筛选。4、抗病毒抗生素的筛选、抗病

81、毒抗生素的筛选（1）、体外细胞培养体系病毒感染检测法 适用于各种抗病毒抗生素各种抗病毒抗生素的筛选。方法有：蚀斑计数法蚀斑计数法细胞变性作用抑制法细胞变性作用抑制法红血球吸附抑制法红血球吸附抑制法荧光抗体法荧光抗体法酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法DNA杂合法杂合法（2）、以病毒诱导脱氧胸苷激酶活化的病毒）、以病毒诱导脱氧胸苷激酶活化的病毒DNA聚合酶为作用靶：聚合酶为作用靶： 这一靶酶的特异抑制剂可用于治疗疱疹治疗疱疹病毒感染。病毒感染。（3）、以）、以HIV逆转录酶为作用靶逆转录酶为作用靶 逆转录酶抑制剂可抑制造成艾滋病的人类免疫缺失症病毒(HIV)等逆转录病毒的生长，并可能预防这类病

82、毒引起的宿主细胞癌变。（4）、）、HIV蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 这类抑制剂能防止HIV母体蛋白质分裂母体蛋白质分裂，从而抑制病毒的复制和对新细胞的感染抑制病毒的复制和对新细胞的感染，有很强抗HIV-1和HIV-2病毒的活性。（5）、）、 -葡糖苷酶抑制剂葡糖苷酶抑制剂 本抑制剂能阻止病毒装配所需要的特异糖病毒装配所需要的特异糖蛋白的合成，从而产生抗病毒的作用。蛋白的合成，从而产生抗病毒的作用。（6）、神经氨酸苷酶抑制剂）、神经氨酸苷酶抑制剂 神经氨酸苷酶促进新形成的流感病毒粒子从宿主细胞中分离与扩散，因此该酶的抑制剂可以治疗流感病毒的感染流感病毒的感染。（7）、以程序性核蛋白体移码为作用靶

83、许多重要病毒都利用程序性核蛋白体移码产生它们的结构基因和酶基因产物，因此，可将这种移码作为筛选抗病毒药物的靶子。5、抗癌抗生素的筛选、抗癌抗生素的筛选（1）、体内筛选）、体内筛选 用可移植肿瘤、致癌病毒或化学致癌物质使实验动物生癌，直接进行抗癌抗生素的筛选，是多年来行之有效的方法。 但由于药物和癌细胞的特异性，各种不同的抗癌药物不可能对一种模型都有效；各种不同的肿瘤模型也不可能对一种抗癌药物都敏感。因此，有必要采用多种模型的适当组合，进行抗癌药物的筛选。（2）、体外筛选）、体外筛选 体外筛选体外筛选有很多模型，大体上可分为癌细胞组织培养法、生物化学法和分子生物学法三种。用的最多的是以程序性细胞

84、凋亡为指标的分子生物学筛选方法。 程序性细胞凋亡是生命个体保持细胞生长平衡，维持健康的重要生理功能。当细胞在DNA复制和分配过程中发生变异且修复功能不能发挥作用时，便可通过诱导程序性细胞凋亡除去变异的诱导程序性细胞凋亡除去变异的细胞，使癌症不会发生。细胞，使癌症不会发生。 癌细胞是由于缺失p53基因，或使p53基因变异，或使Rb基因编码的RB蛋白失活，或过量表达bcl-2和bcl-x基因，从而摆脱程序性细从而摆脱程序性细胞凋亡胞凋亡,使细胞的生命周期失控，得以无限增使细胞的生命周期失控，得以无限增殖而形成肿瘤（癌症）殖而形成肿瘤（癌症）。 因此，以癌细胞摆脱程序性细胞凋亡的癌细胞摆脱程序性细胞

85、凋亡的机制为靶子机制为靶子。可以进行抗癌药物的筛选。筛选方法包括： 致癌基因bcl2抑制剂抑制剂的筛选。 阻止抑癌基因p53变异变异或使变异变异p53基基因回复突变的化合物的筛选。因回复突变的化合物的筛选。 解除解除ras基因对程序性细胞凋亡抑制的化基因对程序性细胞凋亡抑制的化合物的筛选合物的筛选 。 诱导转化人乳头瘤病毒致癌基因的大鼠诱导转化人乳头瘤病毒致癌基因的大鼠神经胶质细胞程序性细胞凋亡的化合物的筛神经胶质细胞程序性细胞凋亡的化合物的筛选。选。 用以上方法已获得由链霉菌链霉菌产生的对小鼠肺癌等癌细胞有很强的抑制活性的化合物。 诱导转化人腺病毒致癌基因的大鼠神经诱导转化人腺病毒致癌基因的

86、大鼠神经胶质细胞程序性细胞凋亡的化合物的筛选。胶质细胞程序性细胞凋亡的化合物的筛选。 由复膜胞诺卡氏菌产生的由复膜胞诺卡氏菌产生的20员环大环内酯员环大环内酯化合物具有很强的这种活性。化合物具有很强的这种活性。 在上述筛选过程中，对诱导的程序性细胞在上述筛选过程中，对诱导的程序性细胞凋亡可通过凋亡可通过细胞的缩小细胞的缩小、染色质在核膜周围染色质在核膜周围凝聚凝聚、细胞表面由于微细纤毛的消失而光滑细胞表面由于微细纤毛的消失而光滑化、细胞的破碎化、细胞的破碎等形态学特征和等形态学特征和核小体单元核小体单元DNADNA的断裂的断裂（形成（形成DNA梯）等生物化学特征予梯）等生物化学特征予以判断。以

87、判断。6、抗寄生虫抗生素的筛选、抗寄生虫抗生素的筛选 寄生虫病包括由单细胞原生动物引起的原虫病(如疟疾和阿米巴痢疾)和由多细胞线虫、吸虫、绦虫感染的蠕虫病蠕虫病。 近年来，伴随着药物、不良环境和病毒(特别是HIV)感染引起的免疫功能低下和机会感染的增加,患寄生虫病的人数呈增加的趋势。现有的药物中，氯喹对疟疾、乙胺嗪和伊维菌素对丝虫病、吡喹酮对吸虫病有特效， 目前均在临床上广泛使用。 抗寄生虫药物的筛选分为：随机筛选和定靶筛选两种方法。 典型的随机筛选法是：体内直接筛选，如事先用某种线虫的幼虫感染小鼠，然后用混有微生物发酵液的饲料喂养，检查小鼠粪便中的成虫和虫卵数量。阿维菌素就是用这种方法筛选得

88、到的。 定靶筛选：随着对各种寄生虫生物化学与分子生物学研究所取得的进展，寄生虫与宿主之间不同的代谢体系和细胞功能已逐渐阐明，与寄生虫的生存和繁殖有密切关系的核酸和能量代谢酶，被认为是较为理想的药物作用靶位。其中核酸代谢的典型酶核酸代谢的典型酶与叶酸合成叶酸合成相关的二氢叶酸还原酶，是抗疟疾疟疾药物乙胺嘧啶对疟原虫和弓形虫的作用靶酶，而治疗耐药性疟疾以及弓形虫病、卡氏肺囊虫肺炎等机会感染的阿托夸酮，则以这些原虫的线粒体电子传递体系为作用靶作用靶7、免疫调节剂的筛选、免疫调节剂的筛选 免疫调节包括：免疫免疫抑制抑制和免疫免疫活化两个方面。 前者针对的是机体的过剩免疫，用于防治器官移植后的免疫排斥反

89、应免疫排斥反应和治疗自身免疫病；而后者的目的在于增强机体的免疫反应能力，产生对癌症和感染特别是病毒感染的抵抗力。 （1）免疫活化剂的筛选）免疫活化剂的筛选 筛选方法可以有以下几种： 将被筛样品注入实验小鼠体内，若干天后再注入某种免疫原物质、测定脾脏中抗体形成细胞的数量和血清中的红血球凝集价，两者均较对照升高者为体液性免疫活化剂. 用同一抗原在24周内对实验动物进行两次免疫接种，可引起免疫淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，造成接种处皮肤局部肿胀、发红，称为迟发性皮肤过敏反应，被筛样品如能增强这一反应，则为细胞性免疫活化剂。对实验小鼠注入被筛样品后，进行同种异同种异体肿瘤移植或同系肿瘤移植体肿瘤移植或同系

90、肿瘤移植，观察样品的单单独抗癌作用独抗癌作用或与常用抗癌药物的协同抗癌作协同抗癌作用。用。 对实验小鼠注入被筛样品后，接种病原细接种病原细菌或病毒菌或病毒，观察对感染的预防情况感染的预防情况。 用用生癌小鼠血清生癌小鼠血清注入实验小鼠体内，使实注入实验小鼠体内，使实验小鼠处于验小鼠处于免疫抑制状态免疫抑制状态，再用，再用、所述所述方法观察被筛样品对体液性免疫和细胞性免方法观察被筛样品对体液性免疫和细胞性免疫的恢复作用。疫的恢复作用。 对对溶血磷脂酶、氨肽酶溶血磷脂酶、氨肽酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽S S转转移酶移酶等有等有抑制作用抑制作用的化合物的化合物一般具有免疫活一般具有免疫活化功能化功能，故

91、可通过筛选这些酶的，故可通过筛选这些酶的抑制剂来获抑制剂来获得免疫活化剂。得免疫活化剂。（2）免疫抑制剂的筛选）免疫抑制剂的筛选 可以采用以上方法按相反的方向进行筛选，也可以选择下面的一些作用靶： 抑制免疫淋巴球的生长抑制免疫淋巴球的生长(抑制嘌吟代谢抑制嘌吟代谢)； 抑制抑制T细胞初期活化反应细胞初期活化反应(抑制细胞内信号抑制细胞内信号传递传递)； 促使淋巴球的程序性细胞凋亡促使淋巴球的程序性细胞凋亡。8、抗高血脂和高血糖物质的筛选、抗高血脂和高血糖物质的筛选 抗高血脂药物可以用胆固醇生物合成酶胆固醇生物合成酶、3-羟基羟基-3-甲基戊二酰辅酶甲基戊二酰辅酶A（ HMGCoA）还原酶、还原

92、酶、HMGCoA合成酶合成酶、角鲨烯合成角鲨烯合成酶酶、酰基酰基CoA。胆固醇酰基转移酶胆固醇酰基转移酶等作为靶子进行筛选，其中HMGCoA还原酶抑制还原酶抑制剂的研究开发取得最引人瞩目的成就最引人瞩目的成就。 对多糖水解酶和-葡糖苷酶抑制剂进行的筛选获得了抗高血糖药物； 而抑制醛糖还原酶的物质可用来治疗由高血糖引起的视网膜病。 9、其他药理活性物质的筛选、其他药理活性物质的筛选 对微生物产生的其他药理活性物质，主要在以下几个方面进行了筛选： （1）中枢神经系统药物）中枢神经系统药物 脯氨酰内肽酶抑制剂、神经生长因子激活脯氨酰内肽酶抑制剂、神经生长因子激活剂、神经生长因子生成促进剂、脱水吗啡拮

93、剂、神经生长因子生成促进剂、脱水吗啡拮抗剂、细胞内抗剂、细胞内Ca+浓度升高剂，等等。浓度升高剂，等等。 （2）循环系统药物）循环系统药物 血小板凝集抑制剂、血小板活化因子拮抗血小板凝集抑制剂、血小板活化因子拮抗剂、血管紧张素剂、血管紧张素拮抗剂、血管扩张剂、心拮抗剂、血管扩张剂、心房钠性利尿因子拮抗剂、内皮素受体拮抗房钠性利尿因子拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、环磷酸鸟苷磷酸二酯酶抑制剂，等等。剂、环磷酸鸟苷磷酸二酯酶抑制剂，等等。 （3）骨、关节系统药物）骨、关节系统药物 黄膘吟氧化酶抑制剂、胶原酶抑制剂、具黄膘吟氧化酶抑制剂、胶原酶抑制剂、具有有雌激素作用的物质雌二醇激活剂，等等；雌激素作用的

94、物质雌二醇激活剂，等等；（4）解热、镇痛、消炎药物）解热、镇痛、消炎药物 磷脂酶磷脂酶A2抑制剂、脂类过氧化物生成抑制抑制剂、脂类过氧化物生成抑制剂、剂、5-脂氧合酶抑制剂、抗补体物质、脂氧合酶抑制剂、抗补体物质、P物质物质受体拮抗剂，等等。受体拮抗剂，等等。（5）减肥药物）减肥药物 胰脂酶抑制剂等。胰脂酶抑制剂等。二、微生物药物的安全性二、微生物药物的安全性与有效性评价与有效性评价 一种具有生物学活性的微生物代谢产物，要想成为临床应用的药物，必须通过一系列安全性和有效性评价。 1、临床前评价、临床前评价 评价内容包括：（1）体外生物学活性）体外生物学活性 如对细菌、病毒、癌细胞、原虫、蠕虫、

95、酶细菌、病毒、癌细胞、原虫、蠕虫、酶、受体等的活性和作用机制活性和作用机制；以及pH、血清、组织、血清、组织培养液培养液等对其活性活性的影响。 （2）产成品的稳定性 原料药粉原料药粉及制剂制剂都要在规定的时间内考察对酸碱度、温度、湿度和光照的稳定性，以确定它的保存方法和保存期。（3）急性毒性 以不同剂量和不同给药途径对纯系小鼠或大鼠给药，在714天内观察并计算出使50实验动物死亡的给药剂量给药剂量，称为LD50。（4）亚急性毒性和长期毒性 以选定的临床给药途径和剂量对纯系大鼠、家兔和狗连续给药1个月(亚急性毒性)或36个月(长期毒性)，观察给药期间实验动物的神态、摄食、活动神态、摄食、活动等一

96、般状态以及体体重、摄食量、血和尿重、摄食量、血和尿的各项化验指标、心电心电图、血压、呼吸图、血压、呼吸等的变化及停药后的恢复情况，分析药物对心、肝、肾、肺心、肝、肾、肺和造血功能造血功能的影响。（5）三致和特殊毒性 三致试验考查的是对实验动物细胞、脏细胞、脏器和组织器和组织有无致癌和致突变作用，对给药后的雌性雌性动物生育的后代后代有无致畸形作用。 特殊毒性包括抗原性、听觉毒性、成瘾性等：（6）实验治疗 又称保护试验， 即对病理模型动物以不同给药途径和剂量，与有确切疗效的阳性对照药物比较治疗效果。（7）一般药理 用各种测量仪器测量仪器和化验指标化验指标分析药物对小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗等实

97、验动物中枢神经系统、循环系统、神经肌肉传中枢神经系统、循环系统、神经肌肉传导、平滑肌脏器导、平滑肌脏器等的影响。（8）药物代谢动力学 观测不同途径给药后血药浓度的变化，血药浓度高峰、达峰时间及高峰维持时间；与血浆蛋白血浆蛋白的结合，在各脏器和组织各脏器和组织中的分布分布及代谢代谢，代谢产物及其生物学活性生物学活性，排泄途排泄途径和速度径和速度等。 2 、 临床评价和副作用考察临床评价和副作用考察 一种新的微生物药物经临床前经临床前的各项动物药理试验确定其安全性和有效性之后，就可以申报临床试验。 承担临床试验的单位临床试验的单位，应选择医务力量强、医疗设施齐全、制度规范的大医院。 临床试验一般分

98、三期进行： 期临床试验：着重考察在安全用药剂量下，药物在健康应试者者体内的吸收、分布、代谢、排泄等药动学和药代学性质； 期临床试验：重点考察药物对主要适应症病例进行治疗的安全性安全性和有效有效性性，并研究最适给药最适给药方法和剂量； 期临床试验期临床试验：是以同类有确切疗效同类有确切疗效的药物为阳性对照的药物为阳性对照，随机分配随机分配，但病人病人和医生均不知情和医生均不知情的所谓“双盲”试验。 采取双盲试验法，可以排除人为的干排除人为的干扰和心理作用扰和心理作用，获得的数据比较客观、可靠。 在完成期临床试验并开始进行药物的试生产后，还应当追加期临床试验，重点考察出现的变态性过敏反应、精神和神

99、经症状、肾毒性、肝功能损害、胃肠道障碍、骨髓抑制(造血功能障碍)等副作用,统计各项副作用的发生率和停药后的恢复率和恢复所需时间，提出消除或减轻副作用的措施，在编写药品说明书药品说明书时予以详细记载详细记载。 3、化疗指数、化疗指数 化疗指数是评价一种药物安全性和有效性的综综合指标合指标，它以下式表示： 化疗指数药物最小有效剂量/药物最大耐受剂量 式中： 最小有效剂量是指出现明显疗效的最低给药剂量 最大耐受剂量指治疗对象对药物不呈现明显毒性反应的最大给药剂量。 显然，化疗指数越低，药物的安全性和有效性就越好。 例如，青霉素对感染链球菌病人的化疗指数为0.01-0.001，这是目前已知化疗指数最低

100、最低的药物之一。 4、对临床上使用的微生物药物的、对临床上使用的微生物药物的一般要求一般要求 ： 综合以上对药物安全性安全性和有效性有效性的评价，提出了以下微生物药物在临床上应用的必要条件： （1）化疗指数至少在0.3以下；（2）对特定的病原有选择性作用；（3）在体内容易和病原接触，且不易被血液、脓液、组织浸液、坏死组织等破坏；（4）用于全身给药时要求吸收确切，排泄较慢；（ 5）病原不易产生抗药性；）病原不易产生抗药性；（6）无致畸、致癌和其他重大毒性反）无致畸、致癌和其他重大毒性反应；应；（7）副反应不影响治疗，而且是可逆）副反应不影响治疗，而且是可逆的，停药后能恢复正常的，停药后能恢复正常

101、（8）长期给药在体内不积蓄，也无成瘾）长期给药在体内不积蓄，也无成瘾性。性。第四节、微生物药物的生产第四节、微生物药物的生产 自20世纪40年代青霉素青霉素实施工业化生产以来，微生物制药微生物制药已形成一门新型产业新型产业，在国民经济和医疗卫生事业中起着越来越重要的作用。由于它利用的主要是天然的可再生的天然的可再生的资源，符合世界各国普遍推行的可持续发展可持续发展战略，因而具有十分强大的生命力十分强大的生命力，将在人类历史的长河中继续不断地发挥它应有的作用。一、微生物药物生产的工艺流程一、微生物药物生产的工艺流程 1工艺流程工艺流程 微生物药物的生产微生物药物的生产从一支小小的冷冻干燥冷冻干燥

102、管管(或液氮管、沙土管或液氮管、沙土管)保藏菌种开始保藏菌种开始，经逐逐级级扩大培养扩大培养，最终在大型最终在大型(数十至数百立方米)发酵罐中进行较长时间(几天至十几天)的发酵，所需代谢产物的产量及其他指标达到一定要求后，用各种物理和化学方法各种物理和化学方法进行后处理后处理，按一定的质量要求质量要求将代谢产物提取和代谢产物提取和精制精制出来，再包装包装或制成各种制剂各种制剂出厂。以青霉素生产为例，这一工艺过程的简单描述如下 。 保藏菌种保藏菌种斜面菌种斜面菌种米孢子米孢子种子罐种子种子罐种子发酵发酵发酵液过滤发酵液过滤提取提取精制精制分包装分包装仓储和运输仓储和运输二、微生物药物生产的工艺特

103、点二、微生物药物生产的工艺特点（一）微生物药物的生产工艺具有的一些优（一）微生物药物的生产工艺具有的一些优缺点：缺点： 1、优点、优点：、主要使用可再生的农副产品作原料，不需精加工，价格便宜，原料可以代换，选择余地大。、反应条件温和，不需高温、高压、强酸、强碱。、发酵过程在水相中进行，不燃、不爆，一般无毒，无腐蚀性。、一台发酵罐，一步发酵工序可进行多种化学法难以进行的复杂反应。、反应产物的化学结构具有立体特异性。、可生产或转化具有复杂化学结构的化合物。、设备通用性强，一套设备可生产各种微生物药物。2 2、缺点、缺点：、原料不宜储存，价格波动大，原料转化率低，消耗大。、灭菌、通气、搅拌等耗能较多

104、。、反应速度慢，产物浓度低，产率低。、过程控制较复杂，生产难以连续化。、废水、废渣排放量大，处理困难。、产物种类多，后处理复杂，成本高。、辅助设备多，投资成本大。 根据以上分析，微生物工艺过程主要在生产立体复杂分子或特异性分子药物方面具有优势，而对于简单分子药物的生产，则在成本上难以同化学合成化学合成工艺竞争。氯霉素、磷霉素和一些新型-内酰胺类抗生素已由发酵法生产改为化学合成法生产，就是很好的例证。（二）特殊工艺要求（二）特殊工艺要求：1、要保持菌种的菌种的高纯度、高活力和高产性： 生产菌种容易退化或变异，故培养和保存都有严格的质量要求，并需经常分离、复壮。2、要求严格无菌化，防止杂菌污染：

105、生产过程使用的设备、原辅料设备、原辅料(包括过程水) 通入的空气空气及各项过程操作均要求经过严格各项过程操作均要求经过严格的灭菌或除菌处理的灭菌或除菌处理，对包装材料均有严格的包装材料均有严格的质量要求，生产厂房及其空间也要保持一定质量要求，生产厂房及其空间也要保持一定的洁净度。的洁净度。 3、要注意通气和搅拌： 微生物药物的生产大多为好氧发酵好氧发酵过程，需要较强较强的通气和搅拌，以满足供氧和混合的工艺要求。 4、生产过程控制需要分阶段进行、生产过程控制需要分阶段进行： 微生物药物大多为次级代谢产物，故发酵过程中细胞生长和产物合成呈分阶段现象。 5、后处理过程复杂、步骤多、后处理过程复杂、步

106、骤多： 由于微生物药物有特殊的高质量指标，因而后处理过程复杂、步骤多，工艺控制要求精细。6、要注意对酸、碱、热、酶等环境条件的控制： 大多数微生物药物对酸、碱、热、酶等条件不稳定，在生产的各工序中都必须严格地加以注意，避免其降解失活。三、微生物药物生产的质量控制三、微生物药物生产的质量控制 微生物药物和其他药物一样，由于这类产品涉及到人类的生命和健康，因而对质量有着特殊的要求。世界各国都以法典的形式对差不多每种药物规定了严格的质量指标，这就是各国的药典。为了确保药品质量，生产者必须把质量意识贯穿到生产的全过程，在生产的各个环节中予以严密控制：1、原、辅料的质量控制： 生产微生物药物的原料可分为

107、天然有机原料和化工原料两大类。（1）天然有机原料： 一般是各种农副产品及其工业加工品。对于这类原料，要通过生产性试验确定最佳品种、产地、加工方法、有效成分及水分含量指标，然后制订严格的采购、运输和仓储制度。仓库要保持通风和干燥，仓储时间一般不超过1年。（2） 化工原料化工原料： 有无机和有机两种。在制订质量标堆时，除了考虑有效成分有效成分含量外，还应有有毒杂质及重金属的上限控制指标。（3）过程用水）过程用水： 不可忽视的一种原料是不同生产环节有不同的用水标准，如软化水、脱离子水、蒸馏软化水、脱离子水、蒸馏水、无菌蒸馏水、超纯水等，都要有一定的水、无菌蒸馏水、超纯水等，都要有一定的质量指标。质量

108、指标。（4）辅料）辅料： 辅料包括药用辅料药用辅料、包装材料包装材料和辅助辅助材料材料。药用辅料的质量要按国家标准执行药用辅料的质量要按国家标准执行。（5）包装材料）包装材料： 如玻璃瓶、橡胶塞、铝塑袋、纸袋、纸箱玻璃瓶、橡胶塞、铝塑袋、纸袋、纸箱等，都应当清洁、无毒清洁、无毒，便于药品运输和贮便于药品运输和贮存，并能在药品的有效期内保持药品质量稳存，并能在药品的有效期内保持药品质量稳定。定。（6）辅助材料：）辅助材料： 如絮凝剂、助滤剂、破乳剂、活性炭、絮凝剂、助滤剂、破乳剂、活性炭、树脂、溶媒等，对它们都要有严格的质树脂、溶媒等，对它们都要有严格的质量要求。量要求。 2中间体的质量控制中间

109、体的质量控制 微生物制药过程的中间体有生产种子、生产种子、配料液、灭菌培养基、发酵液、发酵滤液、配料液、灭菌培养基、发酵液、发酵滤液、萃取液、洗脱液、脱色液、浓缩液、粗晶萃取液、洗脱液、脱色液、浓缩液、粗晶(粉粉)等等。 要根据各工序的要求，制订每种中间体每种中间体的质量标准质量标准，以确保最终产品质量完全达标以确保最终产品质量完全达标。（1） 生产种子的质量标准生产种子的质量标准：有生物质或生物质或孢子含量、细胞形态、细胞生长阶段、菌落孢子含量、细胞形态、细胞生长阶段、菌落纯度等；纯度等；（2）发酵液质量标准）发酵液质量标准：包括发酵效价（即所发酵效价（即所需产物浓度需产物浓度)、副产物和降

110、解物含量、残存碳、副产物和降解物含量、残存碳源和消沫剂含量、生物质含量及其自溶程源和消沫剂含量、生物质含量及其自溶程度、粘度、色泽、度、粘度、色泽、pH等。等。 每种中间体都有一项共同的质量标准共同的质量标准，就是杂菌污染情况。 其中生产种子要求绝对没有杂菌污染；其他各种中间体也要求没有或极少杂菌污染。 杂菌污染将使产品质量下降，甚至大幅度降低产量、提高成本。严重的杂菌污染还可能造成生产过程全军覆没，颗粒无收。 3 、 产成品的质量控制产成品的质量控制 微生物药品和化学药品一样，产成品质量标准由具有法律效应的药典规定。 项目一般包括： 物理和外观性状、鉴别试验、溶解度、物理和外观性状、鉴别试验

111、、溶解度、溶液酸碱度、色泽和澄明度、有效成分含溶液酸碱度、色泽和澄明度、有效成分含量、杂质含量、水分含量、比旋光度、灼烧量、杂质含量、水分含量、比旋光度、灼烧残渣、重金属含量、微生物含量、崩解时限残渣、重金属含量、微生物含量、崩解时限和溶出度、异常毒性、热原物质、降压物质和溶出度、异常毒性、热原物质、降压物质、过敏源物质、装量与标示量差异等。、过敏源物质、装量与标示量差异等。 和化学药品不同的不同的是：由于微生物药品具有某种特殊的生物活性，而且这种活性与化学含量的测定往往不完全相关(可能因空间构型不同所致)，故在多数情况下需要进行生物活性的测定，并且作为一项重要的质量指标载入药典。 为了使药品

112、生产全过程都纳入质量管理、严格控制影响质量的各种因素、确保最终产品质量，世界各国都制订了药品生产管理规药品生产管理规范范，即GMP（Good Manufacture Practice)。 这一规范，对涉及药品生产的厂房、设药品生产的厂房、设备、人员、原材料、工艺规程、生产记录、备、人员、原材料、工艺规程、生产记录、生产控制、监控方法、分析检测、产品包生产控制、监控方法、分析检测、产品包装、仓储、销售、售后服务、药品稳定性等装、仓储、销售、售后服务、药品稳定性等都有严格的规定和具体的要求，各制药企业都有严格的规定和具体的要求，各制药企业都必须在生产中贯彻执行。都必须在生产中贯彻执行。 遵照这一规

113、范，可确保整个生产过程的安全、有序、高效、优质，最终为社会提供符合药典要求的安全、有效产品和优质服务。课程讨论：抗生素滥用的严重后果及防止措课程讨论：抗生素滥用的严重后果及防止措施。施。第二章第二章 微生物酶微生物酶 第一节第一节 慨慨 述述1、早期人们对酶的应用、早期人们对酶的应用：（）概念（）概念： 酶是由活细胞产生,能在体内外对其底物(作用物)起着同样催化作用的一类蛋白质。 （）应用（）应用：在酶的参与下，生物体内的新陈代谢才能有序进行。 尽管人类在19世纪前后才建立起酶的概念，但酶的催化作用却很早就为人们的生活所利用。比如，在人类游牧生活时期，就已会利用动物的胃液来凝固牛乳。 在400

114、0多年前就已掌握的酿酒和制酱技术其实也是酶作用的结果。2、酶的真正发现和生产、酶的真正发现和生产： 1897年以后，酶的细胞外作用现象被发现，从而导致了酶的商品化生产。最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取，如如： 从从牛胃中提取凝乳酶牛胃中提取凝乳酶胰脏中提取胰酶胰脏中提取胰酶血液中提取凝血酶血液中提取凝血酶植物材料中提取淀粉酶等植物材料中提取淀粉酶等。3、酶工业的第一次飞跃、酶工业的第一次飞跃： 在酶被真正发现之后，利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。其方法在今天仍被采用。4、酶工业的第二次飞跃、酶工业的第二次飞跃： 第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工艺和设备的日臻完善

115、，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。5、酶工业的第三次飞跃、酶工业的第三次飞跃： 20世纪90年代以后，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物中得到表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程+发酵工艺+先进发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。 在这次飞跃中，微生物作为酶制剂来源的地位得到了进一步的加强，显示出了动植物无法与其比拟的巨大优越性。第二节 微生物酶的开发一、应用微生物开发酶的优点一、应用微生物开发酶的优点二、微生物酶开发的一般程序二、微生物酶开发的一般程序三、实验室操作与工业化生产之间

116、的差别三、实验室操作与工业化生产之间的差别、应用微生物开发酶的优点、应用微生物开发酶的优点（一）生产能力（发酵）几乎可以（一）生产能力（发酵）几乎可以不受限制不受限制地扩大地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求：，能够满足迅速扩张的市场需求： 因为，微生物生长繁殖快，生活周期短等。因为，微生物生长繁殖快，生活周期短等。（二）（二）几乎可以获得任何一种酶几乎可以获得任何一种酶： 微生物种类繁多，它们散布于整个地球的微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同环境下生存的微生物各个角落，而且在不同环境下生存的微生物都有其截然不同的代谢方式，能分解利用不都有其截然不同的代谢方式，能分解利用不

117、同的底物。同的底物。 这一特征就为微生物酶微生物酶品种的多样性提供了物质基础。 特别是当基因工程介入时，动、植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。 因此，有计划和仔细地筛选微生物菌株，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当菌株。二、微生物酶开发的一般程序二、微生物酶开发的一般程序 产酶微生物产酶微生物与药用微生物药用微生物一样，广泛分布广泛分布于自然界。这是我们对其进行开发利用的基本条件。 微生物酶的全程研发流程如下所示： 样样品品采采集集菌菌种种分分离离初初筛筛摇摇瓶瓶实实验验复复筛筛保保藏藏菌菌种种最佳产酶条件组合研究最佳产酶条件组合研究微生物育种微生物育种物理诱变物理诱变化

118、学诱变化学诱变分子改造分子改造遗传工程遗传工程基因工程基因工程酶的制备酶的制备收集发酵液收集发酵液胞外酶胞外酶收集菌体收集菌体破碎破碎胞内酶胞内酶酶学研究酶学研究产品扩大产品扩大指指导导工工业业生生产产实实践践（一）样品采集（一）样品采集1、有目的采样、有目的采样： 采样的目的目的决定采样地点地点、采样方法方法及采样的数量数量。一般而言，存在目的酶作用底物或潜在作用底物的场所是首选的采样地首选的采样地。（但原则上不是绝对的但原则上不是绝对的）2、广泛采样：、广泛采样： 由于微生物具备有很强的适应能力适应能力，因而也能从一些看似并不相关的看似并不相关的环境中获得目的酶产生菌。 如：脂肪酶脂肪酶产

119、生菌一般存在于油脂厂或乳品厂周围环境，但也有一些脂肪酶生成菌分离自蔬菜。同理，将一些“不不相干相干”的样品采集回来以后，通过用某种营养物质富集培养富集培养也可以从中将某种酶某种酶产生菌分离出来。 3、到特殊或极端环境中采样：、到特殊或极端环境中采样： 在这些环境中，由于生存条件比较苛刻，能生存下来的微生物一般都具有不同寻常不同寻常的生存机制，因此从这些微生物中往往能获得新酶或具有特殊稳定性特殊稳定性的酶种酶种。 比如说，生物工程中应用到的热稳定聚合（Taq）酶就是来自于从美国黄石国家公园美国黄石国家公园l00硫泉硫泉中分离获得的水生栖热菌水生栖热菌。4、采样方法、采样方法： 采样时，在同一地点

120、同一地点可选35个点，每点每点取样10g左右，土层深度不一土层深度不一，并混在一起混在一起包好。 在采样过程中还应明确标注标注采样点的地理地理位置、生态环境、气温、采样日期位置、生态环境、气温、采样日期等以备查用。（二）菌种的分离（二）菌种的分离 菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。分离应注意以下几个问题：1、分离培养基的确定：、分离培养基的确定：2、分离培养条件的选择：、分离培养条件的选择： 如培养温度、湿度、好氧温度、湿度、好氧或厌氧厌氧培养等：3、在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件，尽可能分离到尽可能多的纯菌种： 因此，在菌种的分离阶段可以选用广泛的分离培养基(各种分离培养基中还

121、应针对性地加入目的酶产生菌的作用底物)。 分离对象可包括细菌、真菌、酵母菌及放线菌等，并且分离条件也应做到多样化，比如吸取的土样稀释液量的控制、不同的培养温度选择等。分离到的单菌落应立即转移到与分离成分一致的新鲜斜面上，待获得纯培养之后就可着手进行初筛。初筛。（三）菌种的初筛（三）菌种的初筛 菌种的初筛有两种方法：1、用简单的定性反应进行初筛、用简单的定性反应进行初筛 定性反应定性反应可以包括颜色反应、有无水解圈、有无特殊气体生成等(其中，平板培养透明圈法是筛选水解酶类常用的有效方法。一般是将所需目的酶的作用底物加入适当的平板培养基内，在培养结束之后，直接根据透明圈的直径与菌落直径的比值来判断

122、菌体的产酶能力)。2、给予特殊的培养基或培养条件：、给予特殊的培养基或培养条件： 在最初最初分离阶段就给予特殊的培养基特殊的培养基或培培养条件养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离一株纯化分离。 此方法常常与菌种的分离工作同步进行：以脂肪酶产生菌脂肪酶产生菌的初筛为例，其分离培养基的成分为： 乳化橄榄油乳化橄榄油2 2、硫酸铵、硫酸铵0.50.5、磷酸氢二、磷酸氢二钾钾0.50.5、硫酸镁、硫酸镁0.10.1、酵母浸膏、酵母浸膏0.050.05、去、去氧胆酸盐氧胆酸盐0.10.1、琼脂、琼脂2 2、PH5.8PH5.8。 与

123、常规的分离培养基不同，这种脂肪酶产生菌筛选培养基中的作用底物橄榄油橄榄油得到了 充分的乳化充分的乳化且其中还加入了去氧胆酸盐去氧胆酸盐，这样就可以保证当有适合的胞外脂肪酶产生菌生长时，菌落周围就会出现清晰的水解圈。 总之，初筛的目的就是要用最简单和最快最简单和最快捷的方法来对大量的待筛菌进行测试。捷的方法来对大量的待筛菌进行测试。 （四（四)菌种的复筛菌种的复筛 初筛初筛之后还要进行复筛复筛。复筛复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。 复筛复筛通常要进行摇瓶液体培养，即在接近发酵罐培养条件下发酵罐培养条件下培养菌体并检测其产酶能产酶能力。力。 在复筛阶段，酶活测定

124、方法的建立十分重要。 初筛时初筛时，往往采用间接的“底物类似物底物类似物”测定法，这种方法的最大特点就是简便简便，酶的酶的用量少，反应时间也较短。用量少，反应时间也较短。 而在复筛阶段而在复筛阶段，由于接近生产的条件生产的条件，故在酶的测定过程中需要用真正的底物真正的底物。 以脂肪酶为例以脂肪酶为例 在初筛初筛定性测酶活的过程中，可以选用三酰三酰甘油酯甘油酯作为底物，这时生成的水解圈就很明显，易于对各菌种进行比较。 但在复筛复筛过程中就必须用橄橄榄油榄油来进行实验。 最后，应该指出，除了可以从自然界除了可以从自然界中分离获得目的酶产生菌外，也可以从已经保藏的菌种中筛选产酶菌种。这样做不仅可以节

125、可以节约大量的人力、物力约大量的人力、物力，而且可以根据前人的资料和经验，了解产酶微生物的类别产酶微生物的类别，然后有目的地加以寻找，搜集有关菌种或相类似的微生物，则可达到事半功倍的效果。从保藏菌种中筛选产酶菌种，可以省去平板分离平板分离纯化这一步纯化这一步。直接进行初筛和复筛直接进行初筛和复筛。（五）对复筛获得的菌株的要求（五）对复筛获得的菌株的要求1、不能是致病菌。 其在系统发生系统发生上，应与病原体无关病原体无关，也不产生毒素不产生毒素。故在采用一个新的产酶菌株时应有大量的病理或动物病理或动物饲养实验资料饲养实验资料以确证其卫生安全性。2、不易变异和退化，不易感染噬菌体。3、微生物产酶量

126、高，生长繁殖快。4、酶的性质符合应用的需要。5、最好是产胞外酶的菌株。6、产生的酶便于分离和提纯，得率高。7、营养要求低 最好能利用廉价的农副产品廉价的农副产品作为营养物，这样可以降低生产成本降低生产成本。（六）最佳产酶条件的初步确定（六）最佳产酶条件的初步确定1培养方式的确定 在此阶段应从未来生产的成本、原料来源原料来源、生产生产工艺工艺等一些因素出发，先确定一个适当适当的培养方式。（1）固体培养 ： 固体培养法也叫做麸曲法，一般用麸皮、稻草、米糠麸皮、稻草、米糠等农副产品为原料，加少量水，做成固体形式固体形式的培养基，让微生物在其中生长并产生酶。 用这种方法来培养菌体，在保温培养保温培养期

127、间，随着有机物质氧化成二氧化碳和水有机物质氧化成二氧化碳和水，麸皮培养基的重量会大大减轻重量会大大减轻。此时，间隔一段时间测量温度、温度、pH、湿度、重量损失及酶、湿度、重量损失及酶活活，并且对温度和湿度温度和湿度进行人工控制人工控制，当酶量达到最大时就可以收获。 该法广泛用于广泛用于各种商品酶制剂商品酶制剂的生产，如真菌淀粉酶、真菌蛋白酶、真菌葡萄糖酶、真菌淀粉酶、真菌蛋白酶、真菌葡萄糖酶、真菌纤维素酶、真菌凝乳酶等。真菌纤维素酶、真菌凝乳酶等。（2）液体培养：）液体培养： 液体培养液体培养就是将微生物接种到液体培养基液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好氧性好氧性的，而且微生物只能

128、利用溶解氧溶解氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度至关重要溶解氧浓度至关重要。 常温（20）常压下达到平衡时，氧在水中的溶解度仅为6.2m1/L(0.28mmol)，这些氧只能保证氧化8.3mg(0.046mmo1)葡萄糖，仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的1。除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养分一般都可保证微生物使用几小时至数天。所以，对好氧菌而言，生长的限制因子几乎总是氧。 液体培养中，一般可通过增加液体与氧液体与氧的接触面积接触面积或提高氧分压提高氧分压来提高溶氧速率提高溶氧速率。具体可采取以下措施：浅层液体培养浅层液体培养(Shallow liquid culture)。在好氧

129、微生物静止培养中常常将培养液装成浅浅层层以增大培养液与空气的接触面积，使氧不至于成为限制因子；利用摇床作三角瓶的液体振荡培养利用摇床作三角瓶的液体振荡培养深层培养深层培养：大规模液体培养都是采用更先进的深层培养。从深层液体培养器底部通入培养器底部通入加压空气加压空气，并用气体分布器使空气以小气泡小气泡形式均匀喷出；形式均匀喷出；对培养液进行机械搅伴并在培养器壁上对培养液进行机械搅伴并在培养器壁上设置档扳，以降低气泡直径，增加相界面设置档扳，以降低气泡直径，增加相界面积，也可采用气升式反应器来取代机械搅积，也可采用气升式反应器来取代机械搅拌；拌；通过提高罐压可以改善溶氧。通过提高罐压可以改善溶氧

130、。 2、最佳培养条件组合、最佳培养条件组合 在确定了培养方式之后，还必须确定最佳的培养条件组合。培养条件包括培养基中关培养基中关键成分的用量、碳氮比、培养温度、键成分的用量、碳氮比、培养温度、PH等等。 最佳培养条件的确定可以通过设计工作量适合的正交试验正交试验或均匀试验均匀试验来进行。 3胞内酶和胞外酶胞内酶和胞外酶 在进行扩大实验扩大实验之前，还应注意到微生物所产酶的特性酶的特性。一般说来，在几种微生物产生的酶的性质大体相同的情况下，胞外酶胞外酶是首选。是首选。 与胞内酶胞内酶相比，胞外酶具有以下一些优点：胞外酶具有以下一些优点：分离提取容易分离提取容易 不必破碎细胞，因而也就省去了去除核

131、酸的工艺； 胞外酶的生产不受可获得生物量的限胞外酶的生产不受可获得生物量的限制，因而容易得到较高的酶产量；制，因而容易得到较高的酶产量； 胞外酶活性显现的最适条件与产酶菌株胞外酶活性显现的最适条件与产酶菌株的最适生长条件往往一致的最适生长条件往往一致 例如来源于碱性环境碱性环境的枯草芽孢杆菌的蛋白酶，其酶活性的最适pH就要比来源于中性环境的枯草芽孢杆菌蛋白酶高好几个单位。但胞内酶就不一定(如耐热菌耐热菌的胞内酶，其热稳定温度就常常低于产酶菌的生低于产酶菌的生长温度长温度)。 与之相反，以胞内酶为商品酶胞内酶为商品酶生产的酶源，不仅生产工艺复杂工艺复杂，而且酶合成量的提高酶合成量的提高往往受“饱

132、和饱和“效应的限制效应的限制，甚至给细胞细胞带来毒毒性。性。 但并不是所有的酶都可找到其相应的胞外酶产生菌，少数一些酶少数一些酶就只能在微生物细胞只能在微生物细胞内生成内生成。比如：葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、蔗糖酶、乳葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、蔗糖酶、乳糖酶等。糖酶等。 另外，用于分子生物学研究的多聚核苷酸多聚核苷酸磷酸化酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、磷酸化酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、DNA聚合酶等也属于胞内酶。聚合酶等也属于胞内酶。 产胞内酶胞内酶的微生物多用深层培养法深层培养法进行培养。 在实验室水平上多用冻融、研磨冻融、研磨或超声波超声波法来破碎细胞壁破碎细胞壁，使细胞壁裂解细胞壁

133、裂解以回收其中的酶。在工业应用上还可通过控制培养温度控制培养温度的办法使细胞自溶细胞自溶来获取目的酶。由酿酒酵酿酒酵母生产蔗糖酶母生产蔗糖酶就是一个很好的例子。 4 微生物酶收集的时间顺序微生物酶收集的时间顺序 酶的积累发生在菌体生活周期中的哪一个阶段，随着各菌种和酶的不同有很大变化。除了延迟期外除了延迟期外，在生长周期中的任何一个阶任何一个阶段，都可以大量出现所需要的酶。段，都可以大量出现所需要的酶。 在某些情况下，胞外酶在对数生长期的早期就开始出现，并且在以后的几个阶段中继续增加数量增加数量。 胞内酶可能主要产生于对数生长期对数生长期，但是，只有在衰亡期，当细胞被溶解时才释放到培养基培养基

134、中，因此，通常在对数生长期的末期收集细胞细胞以回收胞内酶最为合适最为合适，然后然后再利用菌体自溶菌体自溶、机械研磨机械研磨或超声波处理使酶超声波处理使酶释放到提取液中。释放到提取液中。（七）微生物产酶性能的进一步提高（七）微生物产酶性能的进一步提高 在以上工作结束后，为了让微生物菌种的产酶能力得到进一步提高，其方法一般有：1、获得高产菌种的突变体获得高产菌种的突变体 高产突变菌种高产突变菌种有着十分重要的意义。 首先，高产突变株高产突变株常常能够比亲株亲株产生高出很多高出很多倍数量的酶。倍数量的酶。 另外，在一些情况下，突变株能够产生比较少比较少的不需要的酶或其他代谢产物不需要的酶或其他代谢产

135、物，因而有利于酶的回收因而有利于酶的回收和提纯。和提纯。 获得高产突变株高产突变株的方法有以下几种：（1）物理和化学诱变）物理和化学诱变 该方法实际就是采用物理和化学因子来处理微生物，并使其发生变异。 常用的化学诱变剂有：氮介子气、亚硝酸、氮介子气、亚硝酸、硫酸二乙酯、环氧乙烷、乙烯亚胺等。硫酸二乙酯、环氧乙烷、乙烯亚胺等。 物理因子有：紫外线、紫外线、x射线、射线、 射线射线等。 诱变的基本流程如下所示：菌种菌种诱变处理诱变处理物理因子物理因子化学因子化学因子大部分被杀死大部分被杀死少部分存活少部分存活与亲株比较与亲株比较极少数酶活性极少数酶活性得到提高得到提高大多数被淘汰大多数被淘汰（ 2

136、）利用代谢调节机理来获得突变株）利用代谢调节机理来获得突变株 这实际上是一种定向选择获得原有微生物类群中可能存在的突变株的方法。 定向选择其实就是在某种只适合于所需突某种只适合于所需突变株生长的营养环境中来处理微生物变株生长的营养环境中来处理微生物，以达到富集突变株富集突变株的目的。 以选择不需要诱导物的大肠杆菌不需要诱导物的大肠杆菌 半乳半乳糖苷酶组成型突变株糖苷酶组成型突变株为例，其方法如下： 首先让大肠杆菌大肠杆菌在含有葡萄糖葡萄糖的培养基中生长一段时期，这时候少数的组成型突变体少数的组成型突变体和绝大多数绝大多数 半乳糖苷酶诱导型细胞并存半乳糖苷酶诱导型细胞并存。 然后，将此混合培养物

137、转移到乳糖培养基中，在这种条件下由于诱导型细胞诱导型细胞要经过一段诱导时间一段诱导时间才能适应新的碳源，组成型突组成型突变体优先得到生长变体优先得到生长这样经过几次重复几次重复之后，就可以将组成型突变体组成型突变体选择出来。2、利用代谢调节机理来提高微生物的酶产量、利用代谢调节机理来提高微生物的酶产量 由于微生物产生的各种酶均受诱导、终产物阻遏等许多调控机理调控机理来协调，因此，我们可以利用这些机理机理来达到我们提高微生物酶我们提高微生物酶产量的目的。产量的目的。 比如：许多分解代谢的酶类，一般都处于受阻遏状态，为了达到解阻遏状态，就可以向微生物培养物中添加诱导物诱导物或诱导物类似诱导物类似物

138、。物。 以大肠杆菌大肠杆菌为例，当培养基中加入了异丙异丙基基- -D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷后，可以使它的 -乳糖乳糖苷酶活性提高苷酶活性提高1000倍。倍。 另外，对于有终产物阻遏终产物阻遏的酶而言，为获得较高的酶产量，首先在生长培养基中就应尽量减少阻遏化合物阻遏化合物的量，同时也应避免使应避免使用丰富的、复杂的或如葡萄糖一类能被快速用丰富的、复杂的或如葡萄糖一类能被快速分解利用的原料。分解利用的原料。 3 基因水平上的改造基因水平上的改造 酶的生成最终是受微生物细胞内酶基因微生物细胞内酶基因的控制，而微生物可以借助结合、转化、结合、转化、转染、转导转染、转导等途径来改变或重新组合遗传改变

139、或重新组合遗传物质。物质。 因此，最初人们就是利用了微生物的这个特性来对其进行基因改造进行基因改造。但是，这些方法还只能认为是在细胞水平细胞水平上对微生物中的遗传物质遗传物质进行操作。 之后，随着生物化学生物化学、微生物遗传学微生物遗传学等学科的迅速发展，人们在基因水平进行基因改造取得了巨大进步，既基因工程基因工程(重组重组DNA技术技术)。 目前，该项技术已延伸到了生物学科的各个领延伸到了生物学科的各个领域域，其目标就是要从商业角度上商业角度上利用基因操作技基因操作技术术，从而能够更廉价、更清洁更廉价、更清洁地生产现有的主要蛋蛋白质产品，酶也是其中之一白质产品，酶也是其中之一 。 到目前为止

140、，基因克隆基因克隆己在酶生产菌酶生产菌的改良方面改良方面发挥了很大的作用发挥了很大的作用，前景诱人。应用基因工程技术基因工程技术改良的工业酶已有十余种，用于洗涤剂、淀粉加洗涤剂、淀粉加工、奶酪生产工、奶酪生产等。方法如下：（1）使酶基因在另一微生物上得到表达）使酶基因在另一微生物上得到表达 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达在原理广是比较简单的。 首先首先是制备含有目的酶的目的酶的DNA片段片段，同时选择适当的载体适当的载体(如质粒、质粒、 噬菌体噬菌体等)。选用只有一个切点的限制性内切酶一个切点的限制性内切酶去切割环状质粒DNA或者其他载体DNA分子，形成具有粘性末端的线形分子，然后，用同

141、种限制性内切酶切割外源外源DNA(通常是酶基因通常是酶基因)，形成相相同的粘性末端。同的粘性末端。 在联接酶联接酶的作用下，线状的载体线状的载体DNA分子与外源的外源的DNA片段重组片段重组，再用重组再用重组DNA分子去转化新的宿主细胞转化新的宿主细胞(通常是一些生长周期生长周期短、营养要求低、可以利用发酵技术来大规短、营养要求低、可以利用发酵技术来大规模培养的微生物模培养的微生物)。 常用的转化方法转化方法是将克隆克隆到质粒载体质粒载体上的DNA与经过与经过Ca处理过的感受态细胞一起保处理过的感受态细胞一起保温温，然后涂布到选择性培养基上涂布到选择性培养基上，根据质粒根据质粒上标记基因的功能

142、上标记基因的功能(如对某种抗生素的抗性改如对某种抗生素的抗性改变变)来判断重组是否成功。来判断重组是否成功。 转化之后，最常用的筛选方法最常用的筛选方法就是利用放放射性标记的核酸探针进行杂交射性标记的核酸探针进行杂交，鉴别出相应鉴别出相应的重组体。的重组体。 之后，这样的重组体重组体就可以大量生产所需大量生产所需要的目的克隆酶。要的目的克隆酶。 以淀粉酶淀粉酶为例，将支链淀粉酶编码的基支链淀粉酶编码的基因，引入到液化淀粉芽孢杆菌中，从而得到因，引入到液化淀粉芽孢杆菌中，从而得到了能同时产生了能同时产生 -淀粉酶和支链淀粉酶的产生淀粉酶和支链淀粉酶的产生菌，对生产非常有用。菌，对生产非常有用。（

143、2）大幅度提高酶基因在细胞内的量）大幅度提高酶基因在细胞内的量 由于酶量实际是受基因控制酶量实际是受基因控制的，因此我们也可以通过提高酶基因的量来促进酶的生成 以淀粉酶淀粉酶为例，将淀粉液化芽孢杆菌的将淀粉液化芽孢杆菌的 -淀粉酶基因，克隆到多复制型质粒中淀粉酶基因，克隆到多复制型质粒中，再转再转移到芽孢杆菌中移到芽孢杆菌中。这时，酶基因复制的拷贝酶基因复制的拷贝数增加了数增加了50倍倍，因而大大提高了酶的产量因而大大提高了酶的产量。（八）微生物酶的提取方法（八）微生物酶的提取方法 酶的提取按照不同的提纯要求又可分为酶的粗提及酶的精提： 1酶的粗提酶的粗提 工业生产工业生产上用到的微生物酶一般

144、用量都很用量都很大，纯度要求也不很高大，纯度要求也不很高。如果待开发的酶待开发的酶是工业用途工业用途的话，则提取方法可以比较粗放则提取方法可以比较粗放。具体的提取流程如下：具体的提取流程如下：胞内酶胞内酶的提取的提取：收集菌体收集菌体破碎细胞破碎细胞收集细胞液收集细胞液酶的沉淀分离酶的沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀等）（盐析、有机溶剂沉淀等）胞外酶的提取：胞外酶的提取：发酵培养发酵培养收集发酵液收集发酵液发酵培养发酵培养2 酶的精制酶的精制 用于结构鉴定或其他特殊用途的结构鉴定或其他特殊用途的酶，通常需要精制，精制，其基本流程如下(1)一般流程一般流程粗提酶液粗提酶液脱盐脱盐透析透析凝胶过滤凝胶

145、过滤浓缩浓缩超滤超滤凝胶干燥凝胶干燥离子交换浓缩离子交换浓缩分离分离离子交换层析离子交换层析凝胶色谱层析凝胶色谱层析纯化纯化亲和层析亲和层析等电凝集等电凝集酶的结晶酶的结晶（2）制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳法）制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （参看生化实验指导教材）（九）、菌种保藏（九）、菌种保藏 见微生物学实验三、实验室操作与工业化生产三、实验室操作与工业化生产之间的差别之间的差别 实验室小规模操作实验室小规模操作与工业化大规模生产工业化大规模生产微生物酶的一般原理是相同的一般原理是相同的，但两者在可能遇到的问题、操作要求和方法上，通常有很大差异：（1）无菌控制方面的差异 摇瓶培养微生物时，在培养过

146、程中很容易保持无杂菌污染状态。工业发酵过程中，防止污染却是一项经常工业发酵过程中，防止污染却是一项经常性任务。性任务。因为，污染源往往是多方面的污染源往往是多方面的，如：搅拌器轴封漏气、冷却盘管漏水或阀门及空气无菌过滤器出现无菌状态不严格等，都会导致在发酵过程中的杂菌污染。（2）发酵时间及后处理的差异发酵时间的差异 实验室水平上的微生物发酵往往需要更长实验室水平上的微生物发酵往往需要更长的时间。的时间。一般来说，根据菌种和所需目的酶的不同，一般来说，根据菌种和所需目的酶的不同，实验室规模的发酵时间通常为实验室规模的发酵时间通常为2一一14天，而工天，而工业化生产则只需业化生产则只需12h至至6

147、天。天。 后处理的差异在实验室进行操作时，由于培养液的体积小，一旦方法确定，几小时内几小时内就可将酶提取出来。大型发酵大型发酵，遇到最大难题，往往不会出现在发酵阶段，而是在随后的酶提取时期，即发酵液的后处理阶段发酵液的后处理阶段。（3）发酵参数的差异 实验室条件下实验室条件下的摇瓶试验甚至是微型发酵罐微型发酵罐的发酵经验，对于大型的工业化发酵生产来说所能提供的参考价值也是很有限的，因此，在任何一家工厂的规模发酵过程中(包括生产目的酶的中型试验中型试验)，为了获得最佳目的酶产量，一些重要的发酵参数，如搅拌转速、通气量、功率输入等都必须依靠操作人员操作人员的经验来确定。第三节、微生物酶的应用第三节

148、、微生物酶的应用 用微生物生产的商业化酶商业化酶已有百余种。但产量大、应用广、经济效益高产量大、应用广、经济效益高的酶品种主要是各种分解酶。另外，基因工程工具酶日新月异的进步也从根本上改变了人们的生活。 一、一、蛋蛋 白白 酶酶 从经济学的角度看，蛋白酶蛋白酶算是最重要的一类工业酶。 在当代，商业化蛋白酶的应用主要集中在去污剂工业。在该领域，碱性丝氨酸蛋白酶被广泛使用。此外，毛霉蛋白酶在乳酪制造业中起着重要作用。从市场占有率看，蛋白酶约占整个商品酶销售量的40。（一）几种常用蛋白酶及其 产生菌和用途：1 1、中性蛋白酶：、中性蛋白酶： 由枯草芽孢杆菌、米曲霉等产生，主要用于肉和干酪的风味强化；

149、甜味二肽的生产，其甜度为蔗糖的150倍，适合糖尿病人食用。2 2、碱性蛋白酶：、碱性蛋白酶： 由地衣芽孢杆菌产生，主要用于家用洗涤剂工业。3 3、凝乳酶：、凝乳酶：主要由重组的大肠杆菌和真菌产生，用于干酪制造。 另外，人们一直在寻找具高温和高碱稳定性的蛋白分解酶。但没有太大的进展。 二、淀粉酶及糖类转化酶类1、-淀粉酶：内切水解-1，4糖苷键 由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉等产生。用于淀粉加工业。2、葡萄糖淀粉酶：从淀粉的非还原末端去除葡萄糖。 由米曲霉、黑曲霉、米根霉产生。用于淀粉加工、酿酒工业。3、支链淀粉酶： 裂解普鲁兰和支链淀粉的-1，6糖苷键。 由产气克雷伯氏菌产生。用于淀粉加

150、工业。4、-葡聚糖酶： 裂解-1，3（4）糖苷键降解-葡聚糖。 由枯草芽孢杆菌、黑曲霉等产生。用于啤酒酿造。5、果胶酶： 降解果胶。 由米曲霉、黑曲霉、米根霉产生。用于果汁和葡萄酒澄清。6、转化酶： 分解蔗糖为葡萄糖和果糖。用于糖果制造业。7、乳糖酶： 分解乳糖为葡萄糖和半乳糖。由乳酸酵母、米曲霉、黑曲霉、米根霉产生。用于乳品工业（处理牛乳和乳清）。 8、葡萄糖异构酶： 将葡萄糖转化为果糖。 由凝结芽孢杆菌、白色链霉菌产生。用于生产高果糖浆。三、脂肪酶三、脂肪酶 脂肪酶：水解脂肪的酯键。 由米曲霉、黑曲霉、米根霉产生。 用于：降血脂；治疗局部炎症；帮助消化；乳制品工业；洗涤剂工业等。 四、芳基

151、乙醚酶四、芳基乙醚酶 木质素木质素是纤维素发酵后纤维素发酵后的主要副产品主要副产品。全世界陆生生物量中木质纤维占了95，其中木质素又占l4左右。 科学家们通过遗传工程方法将欧文氏菌编码的芳基乙醚酶基因克隆到大肠杆菌内，后者即可大量分泌能降解木质素降解木质素的芳基乙醚芳基乙醚酶。酶。 木质素经过该酶降解后能转换出有用的高档药品、染料、能源及生物降解塑料聚羥丁酯的原料。这样既可消除污染消除污染，又创造了财财富富，可谓一举两得。 五、纤维素酶五、纤维素酶 纤维素占地球动植物总量的一半，是数量最大的可再生资源可再生资源。 但在自然状态下，纤维素的微生物降解是很缓慢缓慢的。参与分解纤维素的微生物在不同环

152、境下也不同，而且酶解过程在时空上常常是由很多微生物依先后秩序分工协调完成。 要把自然界的这个过程在人工条件下加速完成是一件很不容易的事。 目前研究的对象集中在：1、继续研究酶的结构和功能2、继续从天然环境中寻找能产生不同酶组分的最佳菌种3、用基因工程技术来构建理想的工程菌4、研究酶解纤维素的工艺条件。 据报道，人们已经找到一种能在70下发酵纤维素直接生产酒精的高温菌高温菌。这种菌能在70下生长，并能产生分解纤维素及发酵葡萄糖产生酒精的全套酶系。 此外，该菌与纤维素在该菌与纤维素在70发酵时发酵时，随着酒精的不断蒸发，发酵过程可以持续进行下去。六、六、 青霉素酰化酶青霉素酰化酶 由于人类对抗生素

153、的无节制的滥用无节制的滥用，造成细菌产生的抗药性抗药性已使天然青霉素的治疗效果明显下降天然青霉素的治疗效果明显下降。为了解决细菌的抗药性问题抗药性问题，人们利用青霉素酰化酶的作用来改变天然青霉素的侧链结构，使其具有抵御抗药性微生物-内酰胺酶攻击的能力。 该酶广泛存在于细菌、放线菌、霉菌及酵母菌内。它除了可以用于新青霉素的半合成外，也能催化水解和合成除头孢霉素之外的头孢霉素衍生物。因此，青霉素酰化酶在医药工业上有着广阔的应用前景广阔的应用前景 七、特殊的治疗用酶七、特殊的治疗用酶1、透明质酸酶 该酶除了可从动物体内获得外，已有报道用霉菌来产生。其应用范围包括：治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤等

154、；治疗传染性肝炎及肝硬化；用于治疗女性不孕症等。 2 、 血纤维蛋白溶酶 此酶存在于人类的血纤维蛋白溶酶原中，现已能从头孢霉和米曲霉中得到，主要用于治疗心肌梗死和支气管炎等。3L-天冬酰胺酶 欧氏植病杆菌、假单胞杆菌及大肠杆菌均可产生该酶。该酶可用于治疗白血病。4右旋糖酐酶 该酶来源于青霉，可水解右旋糖酐及细菌多糖类的-1，6葡萄糖苷键。它可将牙银上沉积的右旋糖酐高分子多糖溶解，用来预防和治疗蛀牙。第四节 未来展望极端环境微生物酶的开发 与我们熟悉的生存条件熟悉的生存条件不一样，极端环境微生物栖息在地球上最恶劣的环境中。在那 里，温度可以低到低到-50 或者超过超过100；流体静压强可达到12

155、0MPa；水活度可以小到0.6；（aw = 0.91-0.95 细菌；细菌； aw = 0.88 酵母；酵母； aw = 0.80霉菌；霉菌； aw = 0.75喜盐细菌；喜盐细菌； aw = 0.70高渗酵母高渗酵母 ；aw = 0.65 耐干燥耐干燥 霉菌）霉菌） pH要么低到低到0.5，要么高到高到12。 但就是在这些本已很特殊已很特殊的微生物中，还有一些很严格的极端类型很严格的极端类型，它们只能在一个很狭窄很狭窄的温度、温度、pH等范围下生存等范围下生存。比如，有一种极端嗜热极端嗜热菌菌，它的最适生长温度为最适生长温度为113 ，一旦温度低于低于85就不能生长。就不能生长。 借助借助1

156、6SrRNA序列分析和生理生化实验，目前已分离得到的极端环境微生物大多数属于古生菌古生菌。 极端环境极端环境微生物必然有特殊必然有特殊的代谢类型，产生特殊的酶特殊的酶。但直到最近，极端环境微生物酶的开发才成为大家关注的焦点。 一、极端环境微生物酶的来源一、极端环境微生物酶的来源 与它们的产生菌产生菌一样，极端环境微生物酶在极端的条件下具有活性和高度稳定性具有活性和高度稳定性。它们来源于以下一些微生物：1、嗜冷微生物 嗜冷微生物嗜冷微生物适应于在15以下以下的环境中生存。它们分离自南极洲、北极、南极附近海南极洲、北极、南极附近海域及大洋海沟域及大洋海沟。分离获得的微生物由细菌和真核菌类组成。 在

157、1530环境中生存的嗜冷嗜冷微生物意义很大，许多关于食品卫生及食品保存食品卫生及食品保存的研究均与它们有关。 2、嗜盐微生物 嗜盐微生物嗜盐微生物栖息于高盐高盐环境中。 它们大多分离自死海、非洲及欧洲死海、非洲及欧洲，美国还从南极的湖泊南极的湖泊中分离到它们。和嗜热菌嗜热菌很类似，它们大多为古生菌，另外就是细菌和真核菌类。这些微生物尽管也能产生淀粉酶、蛋白酶、糖苷酶及脂肪酶，但很多还未进行调查研究，更谈不上应用。到目前为止，惟一商品化的嗜盐嗜盐酶种酶种都是限制性内切核酸酶。 3嗜热微生物嗜热微生物 嗜热微生物嗜热微生物、高度嗜热微生物及极端嗜热高度嗜热微生物及极端嗜热微生物生活于微生物生活于5

158、0一一113甚至更高温度的环甚至更高温度的环境中。境中。 它们广泛分布于热泉、油田、海底热泉、油田、海底的火山火山喷汽孔等喷汽孔等。有时，这些环境除了温度很高除了温度很高之外，还有很低很低pH或很高的渗透压或很高的渗透压。嗜热菌嗜热菌主要是古生菌和真细菌。 它们可以利用多种营养物质多种营养物质，如淀粉、蛋淀粉、蛋白质、多糖白质、多糖等。厌氧类型厌氧类型甚至还能通过氧化元素硫元素硫来获取能量。因此，它们可以产生许多具有不同热稳定性的有用酶类具有不同热稳定性的有用酶类。 目前嗜热微生物产生的DNA聚合酶主要运用于PCR技术中。 另外，由它们产生的热稳定淀粉酶、葡萄热稳定淀粉酶、葡萄糖异构酶等都很有

159、实用价值糖异构酶等都很有实用价值。二、二、极端环境微生物酶的获得 1、酶的产生 在大规模开发某种极端环境酶极端环境酶前，必须先找到一个经济有效的产酶方法。在这里，有两种途径两种途径可供选择：从一种极端环境微生物中找到的酶基因在另外一种极端菌上获得表达。 但是，要培养这些极端环境微生物极端环境微生物并不容易。 由于以上原因人们的相当一部分兴趣转向了异源基因表达技术异源基因表达技术。用一些更为普通的宿主如大肠杆菌，来进行异源基因表达。 通过运用异源基因表达技术，相当一部分高度热稳定嗜热酶由大肠杆菌成功产生。 以日本为例，它们的潜水艇曾在海洋底的热水矿床中采集到一种能在高于100的环境下生存的极端嗜

160、热细菌。这种细菌产生的酶因为有着极高的耐热性而极具工业应用价值。但这种细菌的培养和酶的直接提取却非常困难。 后来，日本生命工学工业技术研究所生命工学工业技术研究所利用通产省产品评价技术中心产品评价技术中心解析的基因组信基因组信息息，将该细菌的特定遗传基因转移到大肠杆菌中进行表达，结果得到了9种在95以上高温中具催化作用的高度耐热酶。 这些酶可用于生物工程和生物反应器生物工程和生物反应器，并可用来延长生物传感器的寿命延长生物传感器的寿命。 此外，一些嗜热菌的酶嗜热菌的酶，柠檬酸合成酶、葡萄柠檬酸合成酶、葡萄糖脱氢酶糖脱氢酶等，也已通过类似的方法成功获得通过类似的方法成功获得。 目前仅有很少一部分

161、嗜冷酶嗜冷酶，如南极细菌柠檬酸合成酶及-淀粉酶，在大肠杆菌上获得成功表达。 嗜盐菌酶基因在大肠杆菌中异源表达后有的也嗜盐菌酶基因在大肠杆菌中异源表达后有的也可达到理想的效果可达到理想的效果，如3-羥-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶、苹果酸脱氢酶等。 另外，为了从难培养或不能培养的特殊菌体特殊菌体中获得它们产生的酶，合理运用合理运用DNA重组技术重组技术也十分有用。 2 酶的纯化及酶性能的改善酶的纯化及酶性能的改善 对于嗜热菌嗜热菌及嗜冷菌嗜冷菌而言，酶的纯化可用常规常规的手段来进行处理。但对于嗜盐菌嗜盐菌来说，由于它们产生的酶需要在高盐浓度下才能保持稳定，故在对他们进行纯化时，操作会更复杂一些。

162、在无盐状态下，可选用甘油甘油及其他一些溶剂使酶保持稳定溶剂使酶保持稳定，但这常会导致溶液的粘稠度升高溶液的粘稠度升高，给后处理带来麻烦。人们通常是利用固定化金属离子亲和层析技术及硫酸铵色谱柱分离方法，在高盐条件下进行操作。这两种方法不仅简便不仅简便，而且获得纯化产物的而且获得纯化产物的量也很高。量也很高。 尽管极端环境微生物酶具有在极端条件下的稳定性，可以用于进行所需要的生物催化反应，但是随着时间的延长随着时间的延长，它们也会失去活性它们也会失去活性。 另外，这些酶的酶活及稳定性酶活及稳定性也还有进一步得进一步得到提高的可能到提高的可能。现在，一些用于常温酶改良的手段，比如固定化酶技术固定化酶技术、蛋白质工程蛋白质工程等。也可用于处理这些极端酶极端酶从而使得它们的性能得到很大改善。 总之，极端环境微生物及其酶资源的开发已经成为人们关注的热点。目前的大部分研究工作集中在解释是怎样的酶结构导致这些酶具有如此独特的性质。此外，开发这些酶主要还得依靠分子生物学手段，这样，发现新酶新酶的可能性极大。 这些酶的开发和应用将会有助于许多新技术有助于许多新技术的发展。因此，对这些酶进行研究不仅具有重要的理论价值，而且也会像Taq（热稳定聚合酶）一样，从根本上改变人们的生活甚至整个世界改变人们的生活甚至整个世界。 在未来微生物酶的研发中，“极端特性”是一个很重要的方向。