克隆载体的特征及类型学习教案

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1、会计学1克隆克隆(k ln)载体的特征及类型载体的特征及类型第一页，共59页。载体：携带(xidi)外源DNA进入宿主细胞的工具。能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。第1页/共58页第二页，共59页。第一节第一节 载体载体(zit)(zit)的功能及特的功能及特征征载体载体(zit)(zit)的功能的功能运送外源基因运送外源基因(jyn)(jyn)高效转入受体细胞高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

2、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第2页/共58页第三页，共59页。载体应具备载体应具备(jbi)(jbi)的条件的条件有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体 DNA的复制而同步复制；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有筛选转化子的选择性标记基因；分子量小，拷贝数多；具有较高的外源 DNA的载装能力；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会 (b hu)任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。第3页/共58页第四页，共59页。自主复制型载体(zit)和附加载体(zit)的扩增方式 第4页/共58页第五页，共59页。载体(zit)的类型n应用范围：克隆载体、表达载体

3、。n应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物(zhw)和动物）、穿梭载体。n构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。第5页/共58页第六页，共59页。克隆(kln)载体(cloningvector)用用于于在在受受体体细细胞胞中中进进行行目目的的(md)基基因因扩扩增增的的载载体体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达(biod)载体(expressionvector)使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载

4、的目的基因能够复制、转录和翻译。第6页/共58页第七页，共59页。穿梭(chun su)载体(shuttle vector) n又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。n同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。n主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高(t go)外源基因的表达效率。第7页/共58页第八页，共59页。第二节第二节 质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有质粒是生物

5、细胞内固有(gyu)(gyu)的、能独立于寄主染色体而自主复制、的、能独立于寄主染色体而自主复制、并并被稳定遗传被稳定遗传(ychun)(ychun)的一类核酸分子；绝大多数的质粒是的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNADNA型型质粒常见于原核质粒常见于原核(yun h)(yun h)细菌和细菌和真菌中真菌中质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1 - 1 - 200 kb200 kb第8页/共58页第九页，共59页。天然(tinrn)DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。Plasmidchromosome绝大多数的天然绝大多

6、数的天然DNADNA质粒具有共价质粒具有共价(nji)(nji)、封闭、环状的分、封闭、环状的分子结构，即子结构，即cccDNAcccDNA第9页/共58页第十页，共59页。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征1. 1. 质粒的自主质粒的自主(zzh)(zzh)复复制性制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行复制系统进行(jnxng)(jnxng)自主复制自主复制质粒质粒DNADNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传的复制受质粒和宿主细胞双重遗传(ychun)(ychun)系统的控制系统的控制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷

7、贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1 - 1 - 5 5 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10 - 60 10 - 60 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid第10页/共58页第十一页，共59页。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主质粒的自主(zzh)(zzh)复制性：拷贝数的控制机制复制性：拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制控制复制引物与模板控制复制引物与模板(mbn)

8、(mbn)的结合的结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制复制(fzh)(fzh)方方向向roprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物 第11页/共58页第十二页，共59页。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制质粒的自主复制性：拷贝数的控制(kngzh)(kngzh)机制机制 质粒质粒DNADNA复制复制启动控制启动控制(kngzh)(kngzh)控制复制控制复制(fzh)(fzh)起始因子与复制起始因子与

9、复制(fzh)(fzh)起始位点（起始位点（oriori）的结合的结合PcopPcopcocoppP/OrepP/OreprepreporioriCopCopRepRep质粒质粒DNADNA上的复制子结构上的复制子结构(jigu)(jigu)决定了质粒与寄主的对决定了质粒与寄主的对应关系应关系第12页/共58页第十三页，共59页。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征2. 2. 质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同任何两种含有相似复制子结构的不同(b tn)(b tn)质粒，不能同质粒，不能同时存在于时存在于一个细胞一个细胞(xbo)(xbo)中，这种现象称为质粒的不相容

10、性，不相中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质容性的质以大肠杆菌以大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的质粒为例：质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成粒组成不相容性群。不相容性群。亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。第13页/共58页第十四页，共59页。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：分子质粒的不相容性：分子(fnz)(fnz)机制机制两种含有相

11、似复制两种含有相似复制(fzh)(fzh)子结构的不同质粒，在复制子结构的不同质粒，在复制(fzh)(fzh)时受到同一种时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终(zu zhn)(zu zhn)拷贝拷贝数不同，数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内细胞内(亲和

12、性质粒亲和性质粒)其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势第14页/共58页第十五页，共59页。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征3. 3. 质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成革兰氏阴性菌的质粒可分成(fn chn)(fn chn)两大类：两大类：接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发能在天然条件下自发(zf)(zf)地从一个细胞转移到地从一个细胞转移到另一个另一个(y )(y )细胞（接合作用），如细胞（接合作用），如FF、ColCol、RR质粒等质粒等如如ColCol、RR的其它成员的其它成员非接合型质粒非接合型

13、质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由 bom bom 和和mob mob 基因决定基因决定第15页/共58页第十六页，共59页。由rec基因(jyn)控制，使质粒整合到染色体基因(jyn)组上。在基因(jyn)工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征4. 4. 质粒的重组质粒的重组(zhn (zhn z)z)性性第1

14、6页/共58页第十七页，共59页。质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征5. 5. 携带特殊的遗传携带特殊的遗传(ychun)(ychun)标记标记野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个上往往携带一个(y )(y )或多个遗传标记或多个遗传标记基因，这基因，这使得寄主生物产生正常生长使得寄主生物产生正常生长(shngzhng)(shngzhng)非必需的附加性状，包括：非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNA

15、DNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义第17页/共58页第十八页，共59页。 利用利用(l(lynyng)g)抗抗性性基基因因进进行行重重组组子子的的筛筛选选第18页/共58页第十九页，共59页。质粒基因编码(binm)的特性nFertility/F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。nResistance/R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。nCol质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E.coli中的CoE1。n降解质粒（Degradativeplasmids）:可以降解特殊的分子(fnz)如：甲苯，水杨酸。n致

16、瘤质粒（Virulenceplasmids）：农杆菌Ti质粒。第19页/共58页第二十页，共59页。天然存在的两种质粒colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-30/cellpSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨(ynjn)型复制5/cell，标记基因为Tcr质粒质粒质粒的构建质粒的构建(u jin)(u jin)第20页/共58页第二十一页，共59页。理想(lxing)的质粒载体应具备的条件n分子量较小。n松驰(snch)型，在受体细胞中有较多的拷贝数。n具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标记。n具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于

17、选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。n能够导入寄主细胞，具备转化的功能。n操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。第21页/共58页第二十二页，共59页。天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加）增加(zngji)或减少

18、合适的酶切位点，便于重组或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加(zngji)装载量装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。质粒人工构建(ujin)的目的第22页/共58页第二十三页，共59页。质粒质粒质粒的分类质粒的分类(fn li)(fn li)人工构建人工构建(u jin)(u jin)的

19、质粒根据其功能和用途可分成如下几的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：类： 高拷贝高拷贝(kobi)(kobi)质粒质粒 突变拷贝突变拷贝(kobi)(kobi)数控制基因数控制基因 拷贝拷贝(kobi)(kobi)数数1000-3000 1000-3000 扩增基因扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自pSC101 pSC101 拷贝数小于拷贝数小于1010 表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker

20、polylinker整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒 装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选第23页/共58页第二十四页，共59页。质粒质粒重要重要(zhngyo)(zhngyo)的大肠杆菌质粒载体的大肠杆菌质粒载体松弛松弛(sn (sn ch)ch)型复制型复制 pB

21、R322pBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于基因用于基因(jyn)(jyn)克隆克隆 第24页/共58页第二十五页，共59页。优点：分子量小：4363bp, 容易纯化。含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到(d do)50-100个，而在蛋

22、白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到(d do)1000-3000拷贝。缺点：有被动迁移的可能，不够安全。抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。第25页/共58页第二十六页，共59页。pBR322pBR322AmpAmpTetTet插入插入(chr)(chr)片片段段AmpAmp平板平板(pngbn)(pngbn)TetTet平板平板(pngbn)(pngbn)第26页/共58页第二十七页，共59页。质粒质粒重要的大肠杆菌重要的大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)质粒载体质粒载体pUC18 pUC18 / 19/ 19： 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 /

23、 2000 - 3000 / cellcell用于基因用于基因(jyn)(jyn)克克隆和测序隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择正选择(xunz)(xunz)颜色标记颜色标记 lacZlacZ第27页/共58页第二十八页，共59页。pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个(y )小片段上。pUC18的优点：1）突变位点位于复制起点(qdin)，提高了拷贝数。2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）多

24、克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。第28页/共58页第二十九页，共59页。质粒质粒重要重要(zhngyo)(zhngyo)的大肠杆菌质粒载体的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19pUC18 / 19：正选择标记：正选择标记 lacZ lacZ 的显色的显色(xin s)(xin s)原理原理pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSbb-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的aa-肽段肽段

25、a a a aa ab b b bb b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚(yn du)(yn du)基基-b-D-b-D-半乳糖苷半乳糖苷X-galX-gal第29页/共58页第三十页，共59页。第30页/共58页第三十一页，共59页。质粒质粒重要的大肠杆菌重要的大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)质粒载体质粒载体pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝(kobi)(kobi)装有两个装有两个(lin )(lin )噬菌体的噬菌体的强启动子强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ用于外源基因的高效表达

26、用于外源基因的高效表达 注意：注意：T7T7和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的RNARNA聚合聚合2743 bp2743 bpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrpGEM-3EpGEM-3EPPSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合酶，如：聚合酶，如：E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等等第31页/共58页第三十二页，共59页。在重组的pGEM3Z载体中加入(jir)相应的RNA聚合酶，可以发生外源基因转录。第32页/共5

27、8页第三十三页，共59页。质粒载体总体(zngt)评价n操作简便(jinbin)n克隆容量有限（ 10kb）第33页/共58页第三十四页，共59页。第二节第二节 噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA噬菌体或病毒是一类噬菌体或病毒是一类(y li)(y li)非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后宿主细胞，然后(rnhu)(rnhu)或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。起来。高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使

28、外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第34页/共58页第三十五页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n (d chn n jn)jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性(txng)(txng)： 生物结构生物结构l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和ll-DNA-DNA组成组成 ll-DNA-DNA全长全长4850248502个核苷酸个核苷酸ll-DNA-DNA上上至少有至少有6161个基因个基因约有20kb的区域为为噬菌体生长非

29、必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。第35页/共58页第三十六页，共59页。l l 噬菌体生物学特性噬菌体生物学特性(txng)(txng)： 生物结构生物结构5 TCCAGCGGCGGGG5 TCCAGCGGCGGGG3333CCCGCCGCTGGA 5 CCCGCCGCTGGA 5 COCOSSCOSCOScoscos头部合成头部合成(hchng)(hchng)基因基因尾部尾部(w(wi b)i b)合成合成基因基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基阻遏基因因重组基因重组基因删除与整合基因

30、删除与整合基因l l l l - DNA- DNA黏性末端第36页/共58页第三十七页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染感染(g(gnrnrn)n)周期周期E.coliE.coli吸附吸附LamBLamB受体受体注入注入复制复制包装包装裂解裂解第37页/共58页第三十八页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的

31、的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染感染(g(gnrnrn)n)周期周期体内包装体内包装100100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原DNADNA的的75 - 105%75 - 105%即即 36 - 51 36 - 51 kbkbDDAA第38页/共58页第三十九页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体生物学特性噬菌体生物学特性(txng)(txng)： 溶溶原状态原状态 ll噬噬

32、菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌后后，除除能能裂裂解解细细胞胞外外，也也可可能能将将其其DNADNA直直接接整整合合到到宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体DNADNA上上，并并不不产产生生子子代代噬噬菌菌体体颗颗粒粒，这这种种情情况况为为溶溶原原状状态态。人人们们可可以以根根据据需需要要改改变变ll-DNA-DNA或或宿宿主主细细胞胞的的性性质，使噬菌体或处于质，使噬菌体或处于溶菌状态溶菌状态，或处于裂解状态，或处于裂解状态 DNA DNA重组技术一般需要重组技术一般需要ll噬菌体进入溶菌状态噬菌体进入溶菌状态第39页/共58页第四十页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bn

33、gd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA载体的构建：缩短载体的构建：缩短(su(sududun)n)长度长度 野野生生型型ll-DNA-DNA包包装装的的上上限限为为5151kbkb，本本身身长长度度为为48.548.5kbkb，只只有有当当插插入入的的外外源源DNADNA片片段段不不大大于于2.52.5kbkb时时，才才能能被被包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。因因此此缩缩短短野野生生型型ll-DNA-DNA的的长长度度，可可以以提提高高装装载载量量。其其实实野野生生型型ll-D

34、NA-DNA上上约约有有40-50%40-50%的的片片段段是是复复制制和和裂裂解解所所非非必必需需的的。根根据据切切除的多少，可将除的多少，可将ll-DNA-DNA分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体第40页/共58页第四十一页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA载体的构建：缩短长度载体的构建：缩短长度(chngd) (chngd) 插入插入型载体型载体体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包

35、装插入片段插入片段载体长度载体长度 37 37 kbkb插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 0 - 14 kbkb（51 3751 37）重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。第41页/共58页第四十二页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n (d chn n jn)jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA载体的构建：缩短长度载体的构建：缩短长度(chngd) (chngd) 取代取代型载体型载体体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度 10

36、10 kbkb（51 2651 26）载体长度载体长度 26 26 kbkb插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度 25 25 kbkb（36 2636 26）第42页/共58页第四十三页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n (d chn n jn)jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA载体载体(zit(zit)的构建：删除重复的酶切位的构建：删除重复的酶切位点点野生型的野生型的ll-DNA-DNA链上有链上有55个个EcoRIEcoRI位点和位点和77个个HindIIIHindIII位点，不位点，

37、不利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至1 - 21 - 2个个同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的DNADNA片段的克隆，还需要增加一片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶酶位点位点第43页/共58页第四十四页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA载体的构建载体的构建(u jin)u jin)：加装

38、选择标记：加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型ll-DNA-DNA上缺少合适的选择标记，因此上缺少合适的选择标记，因此加装加装选择标记是选择标记是ll-DNA-DNA克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容ll-DNA-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记第44页/共58页第四十五页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA载体的构

39、建：加装选择载体的构建：加装选择(xu(xunz)nz)标记标记 imm434 imm434imm434imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止ll-噬菌体噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的基因的ll-载体进入受体细胞后，建立溶载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源当外源DNADNA插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭活，活， ll-重组分子便进入溶菌循环，形成重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑透明斑第45页/共58页第四十六页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bng

40、d)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA载体的构建载体的构建(u jin)u jin)：加装选择标记：加装选择标记 lacZ lacZlacZlacZ基因编码基因编码bb-半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的X-galX-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基因插入到因插入到lacZlacZ基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体ll-DNA-DNA则产则产生蓝色透明斑生蓝色透明斑第46页/共58页第四十七

41、页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA重组重组(zhn(zhn z z)分子的体分子的体外包装：外包装：ll-DNA-DNA重重组组分分子子需需在在体体外外人人工工包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体重重组组颗颗粒粒，方方可可高高效导入受体细胞效导入受体细胞用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白质质可可直直接接从从感感染染了了ll噬噬菌菌体体的的大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取，现现已已商商品品化化。这这些些包包装装蛋蛋白白通通常常分分

42、为为相相互互互互补补的的两两部部分分：一一部部分分缺缺少少EE组组份份，另另一一部部分分则则缺缺少少DD组组份份。包包装装时时，当当且且仅仅当当这这两两部部分分包包装装蛋蛋白白与与重重组组ll-DNA-DNA分分子子混混合合后后，包包装装才才能能有有效效进进行行，任任何何一一种种蛋蛋白白包包装装液液被被重重组组ll-DNA-DNA污污染染后后，均均不不能能被被包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的菌体颗粒，这也是基于安全而设计的第47页/共58页第四十八页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn

43、)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA及其重组分子的分离及其重组分子的分离(f(fnl)nl)纯纯化：化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入加入ll噬菌体或重组噬菌体或重组ll噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3737培养培养11小时小时用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -124 -12小时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒密度已达密度已达101013 13 -10-1014 14 / / LL，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌

44、体超速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放ll-DNA-DNA乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀ll-DNA-DNA第48页/共58页第四十九页，共59页。噬菌体或病毒噬菌体或病毒(bngd)DNA(bngd)DNA大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)的的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl-DNAl-DNA作为作为(zuwi)(zuwi)载体的优点：载体的优点：ll-DNA-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌ll-DNA-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装载

45、量远远大于质粒的装载量重组重组ll-DNA-DNA分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便重组重组ll-DNA-DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简便ll-DNA-DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNADNA片段，但不适合表达片段，但不适合表达外源基因外源基因第49页/共58页第五十页，共59页。第三节第三节 考斯质粒考斯质粒 l-DNA l-DNA载体装载量为载体装载量为25 kb25 kb，但在很多情况下，往往需要，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源克隆更大的外源DNADNA片段片段(pin dun)(pin dun)，考斯质粒载体的构，考斯质粒载体的构建就是为了进一

46、步提高噬菌体建就是为了进一步提高噬菌体DNADNA的装载量。的装载量。 在包装上限固定在包装上限固定(gdng)(gdng)的条件下，大幅度缩短噬的条件下，大幅度缩短噬菌体菌体DNADNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。的长度，就能同步增加载体的装载能力。第50页/共58页第五十一页，共59页。nn将噬菌体将噬菌体DNADNA与包装有关与包装有关(yugun)(yugun)的序列与质粒组装的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组保证重组DNADNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，分子在体外仍被包装成有感染力的颗

47、粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组组DNADNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。第51页/共58页第五十二页，共59页。考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体考斯质粒载体(zit(zit)的构的构建：建：考斯质粒是一类考斯质粒是一类(y(y li) li)人工构建的人工构建的含有含有19781978年年CollinsCollins和和HohnHohn发明发明(fmng)(fmng)构建构建

48、pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcrrll fragment fragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamHIBamHISalISalIll-DNA -DNA coscos序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的特殊类型的载体特殊类型的载体coscos site - carrying plasmid site - carrying plasmid1.8 1.8 kbkb的的ll-DNA-DNA片段片段 + + pBR322pBR322片段片段装载范围为装载范围为31 - 45 31 - 45 kbkb第52页/共58页第五十三页，共59页。考斯质

49、粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体考斯质粒载体(zit(zit)的特的特点：点：能像能像l-DNAl-DNA那样进行那样进行(jnxng)(jnxng)体外包装，并高效转染受体细胞体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（45 kb45 kb）且克隆片段具有）且克隆片段具有(jyu)(jyu)一定的大小范一定的大小范围围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞第53页/共58页第五十四页，共59页。人造人造(rnzo)(rnzo)染色染色体载体体

50、载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要(xyo)(xyo)克隆数百克隆数百甚至上千甚至上千 kb kb 的的DNADNA片段片段(pin dun)(pin dun)， 此时考斯质粒和噬菌粒此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载载体的装载量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源源DNADNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，克

51、隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（BACBAC）酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC）第54页/共58页第五十五页，共59页。人造人造(rnzo)(rnzo)染色染色体载体体载体细菌细菌(xjn)(xjn)人造染色体（人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌细

52、菌(xjn)(xjn)人造染色体通常是在大肠杆菌性因子人造染色体通常是在大肠杆菌性因子FF质粒的基础质粒的基础上上构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在50 - 30050 - 300 kbkb之间之间各种类型的各种类型的pBACspBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACspBACs主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库第55页/共58页第五十六页，共59页。人造人造(rnzo)(rnzo)染色染色体载体体载体酵母酵母(jiom)(ji

53、om)人造染色体（人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）YACYAC载体应含有载体应含有(hn yu)(hn yu)下列下列元件：元件： 酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoREcoRIIURA3URA3TELTELBamHBamHIITETELLorioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的酵母系

54、统的选择标记选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为350 - 400 350 - 400 kbkb第56页/共58页第五十七页，共59页。人造人造(rnzo)(rnzo)染色染色体载体体载体酵母酵母(jiom)(jiom)人造染色体（人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes Yeast Artificial Chromosomes YACYAC）酵母人造酵母人造(rnzo)(rnzo)染色染色体的使用：体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTEL

55、BamHIBamHITETELLorioriApAprrTRTRPPARARSSEcoREcoRIIEcoREcoRIIEcoREcoRIIBamHIBamHI连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体第57页/共58页第五十八页，共59页。内容(nirng)总结会计学。为外源基因提供复制能力或整合能力。质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并。天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一。抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。l 噬菌体由外壳包装蛋白(dnbi)和l-DNA组成。野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不第五十九页，共59页。