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1、实验二实验二 血清血清球蛋白的分球蛋白的分离纯化与鉴定离纯化与鉴定层析技术实验原理实验思路实验流程及操作注意事项层层 析析 技技 术术1 1层析法层析法：又称色谱法，是一：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术析鉴定技术. .2.2. 依据依据：混合物中各组分的理：混合物中各组分的理化性质差异化性质差异吸附力、分子形吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。分子亲和力以及分配系数。固定相固定相固定不动固定不动流动相流动相对固定相作单向相对运动，对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移
2、推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。中的迁移距离不等，达到分离。3 3基本原理基本原理：固定相和流动相：固定相和流动相4 4分类分类：流动相的物理状态：气相和液相流动相的物理状态：气相和液相 气液气液/ /固，固，液固液固/ /液液方式：纸、薄层、方式
3、：纸、薄层、柱柱原理：吸附、分配、原理：吸附、分配、凝胶凝胶、离子交、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相换、亲和、金属螯合、疏水、反相5 5凝胶层析凝胶层析( (凝胶过滤、凝胶色谱、分凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析子筛层析、分子排阻层析) )定义定义：指混合物随流动相：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。不同而被分离的技术。基本原理：基本原理：固定相固定相：凝胶，惰性三维空间多孔：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、糖、交联葡聚糖交联
4、葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼、聚丙烯酰胺、琼脂糖脂糖- -葡聚糖复合凝胶。葡聚糖复合凝胶。流动相流动相：洗脱液：洗脱液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为珠状颗粒，商品名为SephadexSephadex G G系列系列G G交联度：交联度：G G后面的阿拉伯数字表示不同的后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有规格型号，有G-10G-10，G-15G-15，G-25G-25，G-50G-50，G-75G-75，G-100G-100，G-150G-150，和，和G-200G-200八种，具体含义为八种，具体含义为凝胶
5、得水值的凝胶得水值的1010倍或吸水量（倍或吸水量（g g）/10g/10g干胶干胶交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，吸水性大。因此，“G G”反映凝胶的交联程度，反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。膨胀程度及分部范围。长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进
6、入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出大小分子彼此分开 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中数学模型 Vo Vi VtViVi凝胶孔内水（内水）凝胶孔内水（内水）VoVo颗粒间水（外水）颗粒间水（外水）VgVg凝胶体积凝胶体积总体积总体积VtVt= = Vi Vi + +VoVo+ +VgVgKdKd分配系数：精确衡量混合物分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗
7、粒的程度，是溶质分子大小的一个粒的程度，是溶质分子大小的一个函数函数VeVe洗脱体积：分离物被洗脱时洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积所用的洗脱液体积 VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度各物质浓度/ /吸光度为纵坐标作图吸光度为纵坐标作图（1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，VeVe= =VoVo，KdKd=0=0（2 2）中等分子，）中等分子，VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi，00KdKd111影响因素影响因素* *层析柱的选择及装填：层析柱的选择及装填：柱大小柱大小分离
8、样品量分离样品量凝胶型号凝胶型号分辨率：各种分子筛的分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子的两种全排阻分子/ /完全渗透分子。完全渗透分子。* *洗脱液：溶解待分离物质，不变性洗脱液：溶解待分离物质，不变性* *加样量：加样量：1%1%5%5%* *凝胶的再生凝胶的再生凝胶型号凝胶型号颗粒大小（粒大小（m)溶溶胀体体积(ml/g)分离范分离范围（Mr）G-1040120237102G-15501502.53.5 1.5
9、103G-2550150461103 5103G-50401209111.5103 3104G-754012012153103 8104G-1004012015204103 1105交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数实验原理实验原理透析及超滤法盐析、有机溶剂/免疫沉淀电泳凝胶层析离子交换层析超离心共性共性：* *生命高分子：透析、超滤、超离心、生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶凝胶层析层析* *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷膜和电荷盐析盐析/ /有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀* *两性电解质和等电点：两性电解质
10、和等电点：pH pH pIpI，蛋白质带，蛋白质带负电；反之带正电负电；反之带正电电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析 * *有一定的功能：抗原性有一定的功能：抗原性 免疫沉淀免疫沉淀 个性个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同形状不同分离依据：蛋白质理化性质的和个性分离依据：蛋白质理化性质的和个性 清蛋白清蛋白 pIpI=4.9 57%=4.9 57%72%72% 1 1 2%2%5%5% 2 2 pIpI6 4%6 4%9%9% 6.5%6.5%12%12% pIpI=7.3 2%=7.3 2%20%20%球蛋白球蛋白实验思路实验思路分段盐析去
11、除杂蛋白分段盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定上午完成下午完成先先粗粗后后细细分段盐析：分段盐析：常用中性盐：常用中性盐：硫酸铵硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。磷酸钠等。 硫酸铵硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液段盐析效果好，不易引起变性。溶液pHpH约约4.54.55.55.5，可用硫酸，可用硫酸/ /氨水按需要调节氨水按需要调节pHpH值。值。分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、分段盐析：各种蛋白大小
12、、亲水程度、pIpI不同，不同，所需的盐浓度、所需的盐浓度、pHpH也不一样。如清蛋白分子小，也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及度及pHpH可使各种蛋白质分段沉淀。可使各种蛋白质分段沉淀。实验流程及操作注意事项实验流程及操作注意事项影响因素：影响因素：温度：温度与溶解度成正比。一般室温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可温即可, ,少数温度敏感型蛋白质需少数温度敏感型蛋白质需4 4度操度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在作，而血红
13、蛋白、肌红蛋白、清蛋白在2525度比度比0 0度时溶解度低，更易盐析。度时溶解度低，更易盐析。pHpH值：大多数蛋白质在值：大多数蛋白质在pIpI时溶解度最时溶解度最低。低。pH=pH=pIpI效果更好。效果更好。蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在白质含量在2.5-3.0%2.5-3.0%。凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50G-25/50过柱，用时较短。过柱，用时较短。固定相：固定相：se
14、phadexsephadex G-25 G-25流动相：流动相：pH7.4pH7.4的的0.01M0.01M磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl0.9%NaCl）原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。子。 浓缩：浓缩：sephadexsephadex G-25 G-25吸水，利吸水，利用高分子性质。用高分子性质。注意事项：注意事项：1 1硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入2 2流洗柱子：流洗柱子：3 34 4个柱长个柱长3 3上样：转圈滴加，起跑线一致上样：转圈滴加，起跑线一致4 4防止柱上液层干涸防止柱上液层干涸5 5洗脱液收集无
15、需分部，用载玻片检洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂测蛋白，无纳氏试剂6 6G-25G-25干胶用纸条少量多次加入，液干胶用纸条少量多次加入，液层高层高0.5mlPI PH=PI PHPI电泳用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理：蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的介质：醋酸纤维素薄膜
16、，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：电泳缓冲液：pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲的巴比妥缓冲液液 清蛋白清蛋白 pIpI=4.9 57%=4.9 57%72%72% 1 1 2%2%5%5% 2 2 pIpI6 4%6 4%9%9% 6.5%6.5%12%12% pIpI=7.3 2%=7.3 2%20%20%球蛋白球蛋白 清蛋白清蛋白 1 1 2 2 清蛋白（清蛋白（albuminalbumin，A A）：）：383848g/
17、L48g/L球蛋白（球蛋白（globulinglobulin，G G）：151530g/L30g/LA/GA/G：正常值正常值1.51.52.52.5 清蛋白清蛋白 1 2 加样线加样线加样线加样线纯化蛋白纯化蛋白对照对照样品样品【操作步骤操作步骤】1 1点样点样：取经巴比妥缓冲液浸透的：取经巴比妥缓冲液浸透的28cm28cm薄膜，滤薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm2cm处用铅处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/ /样品，样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下垂直压在加样线上
18、，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置5 51010分钟平衡。分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。点样端置阴极，盖上盖子。2 2通电通电：接通电源，调节电压为：接通电源，调节电压为404050V50V，通电，通电2 2 2.5h2.5h，关闭电源，停止电泳。，关闭电源，停止电泳。3 3染色染色：薄膜浸入氨基黑：薄膜浸入氨基黑B B染色液染色液2 25 5分钟。分钟。4 4漂洗漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4 45 5次，至无蛋次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。5）醋酸纤维素薄膜电泳在临床上的应用实验二实验二 血清血清球蛋白的分球蛋白的分离纯化与鉴定离纯化与鉴定实验二实验二 血清血清球蛋白的分球蛋白的分离纯化与鉴定离纯化与鉴定
