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1、细菌鉴定技术常用细菌生化反应糖发酵试验吲哚试验（靛基质试验）甲基红试验V-P（Voges-Proskauer）试验枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验克氏双糖铁（KIA）复合试验动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验1.糖发酵试验【原理】：各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后仅产酸，有的分解后产酸产气，故可用来鉴别细菌。【方法】：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种葡萄糖、乳糖发酵管，35C培养18-24h观察结果。1.糖发酵试验【结果】：首先确定细菌是否生长，细菌生长者培养基呈混浊状：1）不分解糖，培养基顔色与接种前无变化，以“-”表示；2）分解
2、糖产酸不产气，培养基由紫色变为黄色，以“+”表示；3）分解糖产酸产气，除培养基顔色变化外，倒管中还有气泡，以“”表示。大肠埃希菌分解葡萄糖和乳糖产酸产气，伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖。2.吲哚试验（靛基质试验）【原理】：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与吲哚试剂形成红色化合物。【方法】：大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，35C18-24h后，加入吲哚试剂数滴，静置分层，观察结果。【结果】：在培养物液面上层呈玫瑰红色为阳性，不变色者为阴性。大肠埃希菌为阳性，伤寒沙门菌为阴性。3.甲基红试验【原理】：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分
3、解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH 在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色（阳性）；有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步化为醇、酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂后呈黄色（阴性）。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种葡萄糖蛋白胨水培养基中，35C18-24h，加入甲基红指示剂2-3滴观察结果。【结果】：红色为阳性，黄色为阴性。大肠埃希菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。 +4.V-P（Voges-Proskauer）试验【原理】：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，
4、为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反应。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水中，35C，24-48h，加入VP试剂甲液和乙液各1滴，充分摇动，观察。【结果】：红色为阳性，若为阴性应再培养4h观察，仍无红色者为阴性。大肠埃希菌阴性，产气肠杆菌阳性。 +5.枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验【原理】：当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源，同时柠檬酸盐为惟一碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色为阳性，培养基不变色（绿色）为阴性。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于柠檬酸盐培养
5、基中，35C，24-48h，观察。【结果】：菌苔出现，培养基变为深蓝色为阳性。细菌不能生长，培养基不变色（绿色）为阴性。产气肠肝菌为阳性，大肠埃希菌为阴性。6.克氏双糖铁（KIA）复合试验【原理】：该培养基用酚红指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色。细菌如能发酵乳糖和葡萄糖而产酸产气，则斜面与底层均呈黄色，且有气泡。如只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层由于是在相对缺氧状态下，细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化挥发而保持黄色。如细菌分解蛋白产生硫化氢，则与硫化亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。6.克氏双糖铁
6、（KIA）复合试验【方法】：将待检菌接种于克氏双糖铁培养基（底层穿刺，上层斜面划线），35C，24h，观察。【结果】：发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则上层和底层均呈黄色且有气泡产生；只发酵葡萄糖而不发酵乳糖，则底层变黄，上层仍为红色。如底层变黑，说明该菌产生硫化氢，生成黑色的硫化铁沉淀。双糖铁培养基双糖铁培养基标准管标准管痢疾杆菌痢疾杆菌KAKA 斜面：斜面：斜面：斜面：K K 红色红色红色红色底层：底层：底层：底层：A A 黄色黄色黄色黄色伤寒杆菌伤寒杆菌KA KA 大肠杆菌大肠杆菌AAAA 没产气没产H2S产H2S产气7.动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验【原理】：培养基为含尿素、蛋白胨的半固
7、体培养基，指示剂为酚红。具色氨酸酶的细菌能分解色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基上层的吲哚会变红；具脲酶的细菌能分解尿素产氨，使整个培养基变碱呈红色；有动力的细菌沿穿刺线扩散生长。【方法】：将大肠埃希菌和普通变形杆菌穿刺线接种于MIU培养基，35C，18-24h，观察动力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。【结果】：扩散生长为动力阳性；滴加吲哚试剂后呈玫瑰红色为阳性；培养基变红脲酶阳性。大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌MIUMIU（）（）（）（）普通变形杆菌普通变形杆菌普通变形杆菌普通变形杆菌MIUMIU（）（）（）（）MM：动力：动力：动力：动力I I：吲哚：吲哚：吲哚：吲哚U U：尿
8、酶：尿酶：尿酶：尿酶请记住：大肠埃希大肠埃希菌菌KIAKIA（AAAA）MIUMIU（）（）上层变黄下层变黄产气没产H2S大肠埃希菌大肠埃希菌IMViCIMViC试验（）试验（）右侧为对照（右侧为对照（） I：吲哚，：吲哚，M：甲基红，：甲基红，Vi：VP，C：枸橼酸盐：枸橼酸盐伤寒沙门伤寒沙门菌菌KIAKIA（KAKA）MIUMIU（）（）沙门菌沙门菌IMViCIMViC试验（）试验（）志贺菌志贺菌KIAKIA（KAKA）MIUMIU（）（）志贺志贺菌菌IMViCIMViC试验（）试验（） 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌KIAKIAKIAKIA（A AA AA AA A ）、）、MIUMIUMIU
9、MIU（）（） 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌IMViCIMViC试验（）试验（）产气肠杆菌产气肠杆菌IMViCIMViC试验（）试验（）变形杆菌变形杆菌KIAKIA（KA+KA+）MIUMIU（+/-+/-+）血浆凝固酶试验：1）原理：金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶（凝聚因子），可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝块；游离型的血浆凝固酶则可使试管中的血浆发生凝固。金黄色葡萄球菌的凝固酶阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的凝固酶阴性。【原理】 氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化
10、型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。【方法】取滤纸一角，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即粉红色，并于5-10秒内呈现深紫色。氧化酶试验氧化酶试验铜绿假单胞菌：阳性大肠埃希菌：阴性【原理】过氧化氢酶可使过氧化氢分解为分子态氧。【方法】 滴加3%过氧化氢溶液数滴于玻片上，挑取固体培养基上的菌落少许于过氧化氢溶液，观察结果。【 结果】 30s内产生大量气泡者为阳性。 过氧化氢酶（触酶）试验过氧化氢酶（触酶）试验葡萄球菌：阳性链球菌：阴性【原理】某些细菌能产生尿素酶分解尿素，产氨使培养基变碱。 【方法】将被检菌接种尿素培养基，35培养1824h观察结果。阴性时应继续观察4d。 【 结果】酚
11、红指示剂变红为阳性，不变为阴性 。变形杆菌阳性，大肠埃希菌阴性。 尿素尿素酶酶试验试验【原理】当细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长分解枸橼酸钠，使培养基变碱。 【方法】在枸橼酸盐琼脂斜面上浓密划线，接种被检菌，于35培养14d，逐日观察结果。 【 结果】枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长，培养基变蓝为阳性；无细菌生长、颜色不变（绿色）为阴性。大肠埃希菌：阴性产气肠杆菌：阳性 枸枸橼酸酸盐利用利用试验涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗镜检镜检简单染色方法干燥干燥初染初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液( (加量以盖满
12、菌膜为度加量以盖满菌膜为度) )，染色，染色1min1min。倾去染色液，用自来倾去染色液，用自来水小心地冲洗。水小心地冲洗。媒染媒染 滴加滴加( (LugolLugol) )碘液，染碘液，染1min1min，水洗。水洗。脱色脱色 滴加滴加95%95%乙醇，脱色乙醇，脱色30s30s立即水洗，以终止脱色。立即水洗，以终止脱色。复染复染 滴加蕃红，染色滴加蕃红，染色30s 30s ，水洗。最后用吸水纸轻轻，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。吸干。革兰氏染色注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大
13、，以免涂片薄膜脱落。急，过大，以免涂片薄膜脱落。抗酸染色法分枝杆菌属的细菌（包括结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等）为抗酸性细菌，一般染色法不易着色，须用抗酸染色法。注意事项涂片要略厚加温染色或延长染色时间，加温时随时补加染色液分枝杆菌呈红色(+)其他细菌和背景为蓝色(-)。操作操作过程取痰液涂片（略厚）干燥固定石炭酸复红加温染色810分钟后用3%的盐酸酒精脱色约12分钟，脱色时轻摇玻片，直到涂片颜色脱去为止水洗后，用碱性美蓝复染1分钟水洗，印干镜检细菌接种：细菌接种：细菌接种：细菌接种： 固体平板培养基固体平板培养基固体平板培养基固体平板培养基 接种方法：接种方法：接种方法：接种方法：分区划线法分
14、区划线法分区划线法分区划线法 固体斜面培养基固体斜面培养基固体斜面培养基固体斜面培养基 接种方法：接种方法：接种方法：接种方法：划线法划线法划线法划线法 固体高层斜面培养基固体高层斜面培养基固体高层斜面培养基固体高层斜面培养基 接种方法：接种方法：接种方法：接种方法：穿刺划线法穿刺划线法穿刺划线法穿刺划线法 半固体培养基半固体培养基半固体培养基半固体培养基 接种方法：接种方法：接种方法：接种方法：穿刺法穿刺法穿刺法穿刺法 液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基 接种方法：接种方法：接种方法：接种方法：液体接种法液体接种法液体接种法液体接种法 实验内容复习实验内容复习使用器材使用器材接种环接种环接种针接种针/接种环接种环接种针接种针接种针接种针接种环接种环/接种针接种针
