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1、第六章第六章目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞1第三节 重组子的筛选 在重组在重组DNADNA分子的转化、转染或转导过程分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子出期待的克隆子。概念概念克隆子克隆子转化子转化子重组子重组子2将摄取外源将摄取外源DNADNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为体细胞统称为克隆子克隆子。把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆
2、子叫做转化转化子（子（导入外源导入外源DNADNA分子后能稳定存在的受体细胞称为分子后能稳定存在的受体细胞称为转转化子化子 ），现在这两者有通用的趋向。现在这两者有通用的趋向。含有含有重组重组DNADNA分子分子的克隆子被称为的克隆子被称为重组子重组子，如果重组子如果重组子中含有中含有外源目的基因外源目的基因则又称为则又称为阳性克隆子阳性克隆子或或期望重组子期望重组子 。经过各种方法将外源经过各种方法将外源DNADNA分子导入受体细胞后，获得所分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选克隆子的筛选。 3一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选
3、转化子（一）根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时，通常在载体在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNADNA分子分子中组装了一种或两种中组装了一种或两种选择标记基因选择标记基因，在受体细胞，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为作为筛选转化子的依据。筛选转化子的依据。4 一般的做法一般的做法是是: : 将转化处理后的受体细胞接种在含适将转化处理后的受体细胞接种在含适量量选择药物的培养基选择药物的培养基上，在最适生长温度上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化
4、子。挑选出转化子。5常用的常用的选择标记选择标记基因基因主要是：主要是： 抗性基因；抗性基因； 表达产物可以表达产物可以发光或使反应底发光或使反应底物显色的基因物显色的基因相应的选择条件相应的选择条件是：是： 可以可以被抗性基因产被抗性基因产物分解的抗生素物分解的抗生素； 可以使基因产物发可以使基因产物发光的光线，或者是可光的光线，或者是可以使基因产物显色的以使基因产物显色的试剂。试剂。6选择培养基选择培养基是：是： 根据宿主细胞类型配置的培养基，对于根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞细菌受体细胞而言，通常用而言，通常用LBLB培养基，培养基，在在LBLB培养基中加入适量的某种选择
5、物，即为培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择培养基。选择物：选择物： 是由是由载体载体DNADNA分子上携带的分子上携带的选择标记基选择标记基因因所决定。所决定。7（一）根据载体选择标记初步筛选转化子（1 1）抗药性筛选）抗药性筛选（2 2）插入失活筛选法）插入失活筛选法（3 3）插入表达筛选法）插入表达筛选法（4 4）显色互补筛选法）显色互补筛选法（5 5）利用报告基因筛选植物转化细胞）利用报告基因筛选植物转化细胞（6 6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞转基因细胞8（1 1）抗药性筛选）抗药性筛选910正向选择方式正向选择方式11注意：注意
6、： 利用利用含一种选择药物的选择培养基含一种选择药物的选择培养基无法无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。和非转化子。非转化子呈非转化子呈 ApAps s、TcTcs s 转化子呈转化子呈 ApApr r、TcTcr r/s /s12（2）插入失活筛选法13双抗药性筛选双抗药性筛选双双1415（3）插入表达筛选法利用外源目的基因插入特定载体后能利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛激活筛选标记基因的表达，选标记基因的表达，由此进行转化子的筛由此进行转化子的筛选。选。有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上
7、一段接上一段负调控序列负调控序列，当，当插入失活该负调插入失活该负调控序列控序列时，其下游的筛选标记基因才能表时，其下游的筛选标记基因才能表达。达。16 例如例如pTR262pTR262质粒载体，它由质粒载体，它由pBR322pBR322衍生而来，其衍生而来，其TcTcr r基因的上游基因的上游含有一段含有一段噬菌体噬菌体DNADNA的的CICI阻遏蛋白编码阻遏蛋白编码基因及其调控序列，基因及其调控序列，CICI基因表达的阻遏蛋白可以抑制基因表达的阻遏蛋白可以抑制TcTcr r基因的表达。基因的表达。当外源当外源DNADNA片段片段插入插入CICI基因的基因的Hin dHin d或或BglBg
8、l位点位点上时，上时，CICI基因失活。基因失活。TcTcr r基因基因因阻碍解除而得因阻碍解除而得以以表达表达，故阳性重组子为，故阳性重组子为TcTcr r表型。表型。 质粒本身质粒本身因为因为TcTcr r基因受阻碍为基因受阻碍为TcTcs s表型表型，当转化细，当转化细菌涂布在菌涂布在TcTc平板上时，只有含有外源平板上时，只有含有外源DNADNA插入片段的阳插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。性重组子的转化菌才能生长成菌落。17（4）显色互补筛选法1819lacZ lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的整的近操
9、纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为之间实现互补，这种互补现象称为-互补互补。具有完整乳糖操纵子的菌体能转译具有完整乳糖操纵子的菌体能转译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(Z)(Z)、IPTGIPTG和和X-galX-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体成为蓝色。如果在载体DNADNA上组入上组入-半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（基因（lacZ)lacZ)部分缺失的片段部分缺失的片段(lacZ(lacZ) )则重组则重组DNADNA分子转化分子转化lacZlacZ互补型菌落，会在含有互补型菌落，会在含有X-galX-ga
10、l和和IPTGIPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。20lac Zlac Z是是-半乳糖苷酶基因部分缺失的半乳糖苷酶基因部分缺失的DNADNA片段，片段，含含lac Zlac Z的重组载体转化的重组载体转化lac Zlac Z互补型菌株，互补型菌株，可转译可转译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶，在含有，在含有X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷）和半乳糖苷）和IPTGIPTG（异丙基（异丙基-硫硫代半乳糖苷）代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落，的培养基上使转化子成为蓝色菌落，而而lac Zlac Z互补型菌株本
11、身为白色菌落互补型菌株本身为白色菌落。当。当lac lac Z Z区插入外源基因后，再转化区插入外源基因后，再转化lac Zlac Z互补型菌互补型菌株，由于不能翻译株，由于不能翻译-半乳糖苷酶，转化子即使在半乳糖苷酶，转化子即使在含有含有X Xgalgal和和IPTGIPTG的培养基上也只能长成白色菌的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。转化子。此方法主要用于原核生物。此方法主要用于原核生物。21 互互补补的的检检测测2223以显色剂以显色剂x-galx-gal作为选择物时作为选择物时: :DNADNA对照组对照
12、组不应出现任何菌落；不应出现任何菌落；感受态细胞对照组长感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色出的菌落应全是蓝色的；的；感受态细胞有效性对照组长感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应出的菌落中应有白色的。有白色的。其中一项不符，就有可能挑出假的转化子其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。菌落。 24（5）利用报告基因筛选植物转化细胞报告基因：报告基因：系指系指其编码产物其编码产物能够被快速地测定，能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。用
13、途的基因。在在植物转基因植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，研究中，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成以和某些目的基因构成嵌合基因嵌合基因，从报告基因的，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等某些酶类或其他持殊产物的基因等。 25特征特征作为报告基
14、因，在遗传选择和筛选检作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：测方面必须具有以下几个条件： (1)(1)已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定； (2)(2)表达产物在受体细胞中本不存在，表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；源性表达产物； (3)(3)其表达产物能进行定量测定。其表达产物能进行定量测定。 26新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（nptnpt）抗新霉素、卡抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和G418G418等抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动植物转化
15、子的选择标记基因。植物转化子的选择标记基因。潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（hpthpt）赋予转化子能抗赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（catcat）也被用于筛选动也被用于筛选动植物转化子的标记基因。植物转化子的标记基因。27-葡萄糖酸酶基因（gus）gusgus的基因产物的基因产物-葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶（GUSGUS）能够催化能够催化4-4-甲基伞形花酮甲基伞形花酮-D-D-葡萄糖苷酸，葡萄糖苷
16、酸，产生荧光物质产生荧光物质4-4-甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含gusgus基因的转化子。基因的转化子。由于植物细胞由于植物细胞GUSGUS本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。筛选植物转化子。尤其是尤其是gusgus基因的基因的3 3端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生的的嵌合基因嵌合基因仍能正常表达，产生的仍能正常表达，产生的融合蛋白融合蛋白中仍中仍有有GUSGUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。位分析。28萤火虫荧光素酶基因（luc）lucluc表达产物表达产物萤火虫荧光
17、素酶（萤火虫荧光素酶（LUCLUC）在）在MgMg2+2+的作用的作用下，下，可以与荧光素和可以与荧光素和ATPATP底物发生反应，底物发生反应，形成形成与酶结与酶结合的合的腺苷酸荧光素酰化复合物，腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用经过氧化脱羧作用后，后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用可以用荧光测定仪荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。LucLuc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在基因检测十分迅速，灵敏度
18、高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，LucLuc是是一种理想的报告基因一种理想的报告基因。29抗除草剂抗除草剂barbar基因。基因。barbar基因编码磷化乙酰转移基因编码磷化乙酰转移酶（酶（PATPAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPTPPT）成分的除草剂具有抗性。成分的除草剂具有抗性。冠瘿碱合成酶基因。冠瘿碱合成酶基因。主要包括主要包括胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因和章鱼碱合成基因两类，
19、存在于土壤农杆菌两类，存在于土壤农杆菌TiTi质粒质粒的的T-DNAT-DNA区段。区段。冠冠瘿瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。因细胞的筛选。冠冠瘿瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。 30（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞
20、 在植物转基因研究中采用的在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移氯霉素乙酰转移酶酶(Cat)(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶基因和新霉素磷酸转移酶(Npt)(Npt)基基因因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。常用的标记基因还有：常用的标记基因还有：- - 胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（tktk）、）、- - 二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（dhfrdhfr）- - 次黄嘌呤次黄嘌呤- -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprthgprt）- - 细菌的黄嘌呤细菌的黄嘌呤- -鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因基因
21、(ecogpt)(ecogpt)等。等。 31胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（tktk）、二氢叶酸还原酶基因）、二氢叶酸还原酶基因（dhfrdhfr）及次黄嘌呤）及次黄嘌呤- -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprthgprt）等的）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。成代谢。这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。长。如果用这样的如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞缺陷型细胞作为受体细胞，导入含
22、有，导入含有上述基因的外源上述基因的外源DNADNA，补充原来缺失的基因，使核，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培在不添加核苷酸的培养基养基中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。酸的培养基中筛选出转化子。32三、核酸分子杂交检测法三、核酸分子杂交检测法（p239）基本原理基本原理复性复性RNADNA33待测的核酸序列待测的核酸序列杂交的双方杂交的双方用于检测的已知核酸片段用于检测的已知核酸片段探针探针3435 根据待测核酸的来源以及将其分子结根据待测核酸的来源以及将其
23、分子结合到固相支持物上的方法的不同。合到固相支持物上的方法的不同。 SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交斑点和狭线印迹杂交斑点和狭线印迹杂交菌落（或噬菌体）原位杂交菌落（或噬菌体）原位杂交核酸分子杂交检测法分类核酸分子杂交检测法分类36又称又称DNA印迹杂交、印迹杂交、Southern DNA印迹杂交印迹杂交1、Southern印迹杂交印迹杂交经琼脂糖凝胶电泳分离的经琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段片段转移到滤膜上转移到滤膜上 与标记的与标记的DNA或或RNA探针杂交探针杂交放射自显影显杂交带放射自显影显杂交带基本原理：基本原理：37（
24、1）提取总）提取总DNA （2）酶解）酶解 （3）电泳）电泳 （4）转印）转印 （5）变性解链）变性解链 （6）杂交）杂交 （7）洗脱）洗脱 （8）放射自显影）放射自显影 （9）比较分析）比较分析 38毛细管虹吸印迹法电转移印迹法真空转移法核酸转移（印迹）方法核酸转移（印迹）方法39毛细管虹吸印迹法毛细管虹吸印迹法湿滤纸湿滤纸高盐缓冲液高盐缓冲液滤纸桥滤纸桥凝胶凝胶硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持台支持台容器容器重物重物40利用核酸分子在电场中的利用核酸分子在电场中的电泳作用电泳作用将凝胶中将凝胶中的的DNADNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。湿式电转移湿式电转移
25、干式电转移干式电转移电转移法电转移法41尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶滤纸滤纸海绵海绵凝胶支持夹凝胶支持夹缓冲液缓冲液电极电极+滤纸滤纸电极电极湿式湿式电转移法电转移法42真空转移法真空转移法43真空转移装置真空转移装置44硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜（简称（简称NCNC膜）膜）优点：优点：吸附能力强，杂交吸附能力强，杂交信号本底低信号本底低缺点：缺点：DNADNA分子结合不牢分子结合不牢固，膜易碎裂，依赖高盐固，膜易碎裂，依赖高盐溶液溶液常用的固相支持物常用的固相支持物45尼龙膜（尼龙膜（NylonNylon）优优点：点：结合单链，双链结合单链，双链DNA的能力比的能力比NC膜强，膜强，韧性高，可重复杂交
26、韧性高，可重复杂交缺点：缺点：杂交信号本底高杂交信号本底高常用的固相支持物常用的固相支持物46凝胶凝胶滤膜滤膜转移转移RNA 至膜上至膜上RNA 分子分子甲醛变性电甲醛变性电泳（聚丙烯泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）酰胺凝胶电泳）带有带有RNA片段的凝胶片段的凝胶转膜转膜杂交杂交、显影显影2、Northern印迹杂交印迹杂交47两两种种印印迹迹技技术术的的比比较较(P248)1234483、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交两种方法的两种方法的基本原理基本原理和和操作步骤操作步骤相同相同 即通过特殊的即通过特殊的加样装置加样装置将变性的将变性的DNA或或RNA核酸样品，核酸样品，直接转移直接转移到适当的杂交滤
27、到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性测核酸样品中是否存在特异性DNA或或RNA。49斑点杂交法斑点杂交法50狭缝式点样器狭缝式点样器51 1、斑点印迹为圆形、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状、狭缝印迹为线状 3、鉴别、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量、特异性不高、不能鉴别核酸分子量斑点及狭缝印迹杂交的特点斑点及狭缝印迹杂交的特点524 4、菌落（或噬菌斑）原位杂交、菌落（或噬菌斑）原位杂交基本原理基本原理直接把菌落和噬菌
28、斑转移到滤膜上直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上溶菌、变性溶菌、变性DNA暴露并于滤膜原位结合暴露并于滤膜原位结合与探针杂交与探针杂交53溶菌、使溶菌、使DNA暴露暴露洗菌体碎片和洗菌体碎片和Pr使单链使单链DNA牢牢固结合在膜上固结合在膜上54操操 作作用用 途途SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交从转化子中提取总从转化子中提取总DNADNA，经，经酶切、电泳分带及变性，酶切、电泳分带及变性，转移膜上，再用转移膜上，再用DNADNA探针与探针与其杂交。操作麻烦。其杂交。操作麻烦。鉴定转化子中鉴定转化子中是否是否含有含有待检测重组待检测重组DNADNA分子；分子；鉴定待检测的鉴定待检测
29、的DNADNA分子分子的的大小大小。斑点印迹斑点印迹杂交杂交把提取的转化子总把提取的转化子总DNADNA直接直接点样到膜上，变性处理后点样到膜上，变性处理后再用再用DNADNA探针与其杂交。操探针与其杂交。操作简单。作简单。只能区别总只能区别总DNADNA中中是否是否含有含有待检测重组待检测重组DNADNA分分子的重组子子的重组子菌落（或菌落（或噬菌斑）噬菌斑）原位杂交原位杂交直接把菌落或噬菌斑印迹直接把菌落或噬菌斑印迹转移到膜上，经溶菌和变转移到膜上，经溶菌和变性处理后使性处理后使DNADNA暴露出来并暴露出来并与滤膜原位结合，再用与滤膜原位结合，再用DNADNA探针与其杂交。操作简单。探针
30、与其杂交。操作简单。广泛地用于从广泛地用于从基因组基因组DNADNA文库文库和和cDNAcDNA文库文库中中筛选含目的基因的重组筛选含目的基因的重组子。子。三种筛选方法的比较三种筛选方法的比较55杂交探针杂交探针指具有一定序列的核苷酸指具有一定序列的核苷酸片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并且通过适当标记进行检测。并且通过适当标记进行检测。 5、核酸杂交探针、核酸杂交探针( 自学自学)56同源或部分同源探针同源或部分同源探针总总cDNAcDNA探针探针特异性特异性cDNAcDNA探针探针人工合成的寡核苷酸探针人工合成的寡核苷酸探针（1）核酸杂交探针的种类）
31、核酸杂交探针的种类57理想的探针标记物应满足的条件：理想的探针标记物应满足的条件：1)1)不会影响探针的主要理化性质；不会影响探针的主要理化性质；2)2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；重复性好；3)3)操作简便、省时经济实用：操作简便、省时经济实用：4)4)化学稳定性高、易于长期保存；化学稳定性高、易于长期保存；5)5)安全、无环境污染。安全、无环境污染。常用于分子杂交的探针标记物分常用于分子杂交的探针标记物分放射性放射性及及非放射性。非放射性。（2 2）探针标记物）探针标记物58放射性标记物放射性标记物是指以放射性同位素对核苷是指以放射性同位素对核
32、苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有位素有3232P P、3 3H H、3535S S、1414C C、125125I I等，其中以等，其中以3232P P、3 3H H、3535S S最为常用。最为常用。标记物放射性的检测主要使用标记物放射性的检测主要使用盖革计数器盖革计数器和和液体闪烁计数器液体闪烁计数器等等射线探测仪射线探测仪来完成。来完成。 放射性标记物放射性标记物59非放射性标记物的最大优势是非放射性标记物的最大优势是无放射性污无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，保存使用，但与放射性探
33、针相比，但与放射性探针相比，多数非多数非放射性探针的敏感性及特异性较差放射性探针的敏感性及特异性较差。目前已广泛应用的非放射性标记物有：目前已广泛应用的非放射性标记物有：生物素生物素(biotin)(biotin)标记的核苷酸、标记的核苷酸、地高辛地高辛(digoxigenin)(digoxigenin)标记的核苷酸标记的核苷酸荧光素荧光素(fluorescein)(fluorescein)标记的核苷酸标记的核苷酸非放射性标记物非放射性标记物60（3）探针标记方法探针的标记有探针的标记有体内标记体内标记及及体外标记体外标记两种两种方法。方法。体内标记法体内标记法是以标记化合物作为代谢底是以标记
34、化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加完成核酸分子标记，例如在培养基中加入入3 3H-H-胸苷，就可以标记到生长在该培养胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞基中的活细胞DNADNA分子上。分子上。体内标记法受多种因素的限制，且标记体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。活性不高，一般很少使用。 61体外标记包括包括化学法化学法和和酶法酶法两种。两种。化学标记法化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因的某种基因( (如磷酸基团如磷酸基团) )发生
35、化学反应而直接将标发生化学反应而直接将标记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制备的特点，尤其适于制备非放射性标记物非放射性标记物的探针。的探针。酶标记法则酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸探针。中，获得核酸探针。酶法应用广泛，适于制备所有酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部分非放射性标记探针放射性标记探针及部分非放射性标记探针。常用的酶法有常用的酶法有DNADNA缺口平移标记法
36、、缺口平移标记法、DNADNA随机引物标随机引物标记法、记法、DNADNA末端标记法末端标记法及及PCRPCR标记法标记法等。等。 62 切口平移标记法切口平移标记法(nick thanslation labeling) (nick thanslation labeling) DNA聚合酶聚合酶63该法标记模板链该法标记模板链64随机引物标记法 (random primed DNA labeling)Klenow片段催化片段催化该法标记模板互补链该法标记模板互补链随随机机引引物物是是含含有有各各种种可可能能排排列列的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段的的混混合合物物。65随机引物：随机引物：4 46
37、6使用随机引物标记的探针一般长使用随机引物标记的探针一般长400-600400-600个个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。与切口平移法不同的是，该方法标记的是与切口平移法不同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。模板互补链，而非模板本身。 66末端标记法(DNA terminal labeling)该法标记的是线性该法标记的是线性DNADNA或或RNARNA的的5 5端或端或3 3端，属端，属非均一性标记。非均一性标记。1)31)3凸出末端的加尾标记法：凸出末端的加尾标记法：末端脱氧核苷酸转末端脱氧核苷酸转移酶将带有标记的移酶将带有标记的dGTP
38、dGTP或或dCTPdCTP加到加到DNA3DNA3-OH-OH端端2)2)双链双链DNA3DNA3隐蔽末端的填充标记隐蔽末端的填充标记：（若反应体：（若反应体系存在全部与模板序列互补的系存在全部与模板序列互补的dNTPdNTP）以凸出序列）以凸出序列为模板，为模板，KlenowKlenow酶或酶或T4DNAT4DNA连接酶催化补平连接酶催化补平3 3末末端（若一种端（若一种dNTPdNTP带标记则成为探针）。带标记则成为探针）。 3)53)5末端标记末端标记：T4T4多聚核苷酸激酶将多聚核苷酸激酶将ATPATP的标记的标记的的-磷酸基团转移到游离的磷酸基团转移到游离的5 5-OH-OH上。上
39、。 67PCRPCR标记法标记法(PCR labeling)(PCR labeling)：标记的一种：标记的一种dNTP dNTP 光敏标记法光敏标记法化学衍生结合标记法化学衍生结合标记法：生物素和地高辛等非放射生物素和地高辛等非放射性标记物可以与事先经过化学修饰得到的核酸衍生物性标记物可以与事先经过化学修饰得到的核酸衍生物更加牢固地结合，进行非放射性探针的制备。常用的更加牢固地结合，进行非放射性探针的制备。常用的化学修饰反应包括磺化、转氨、溴化等反应类型化学修饰反应包括磺化、转氨、溴化等反应类型。 交叉相连标记法：交叉相连标记法：利用一些高分子化合物，如利用一些高分子化合物，如细胞色素细胞色
40、素c c、组蛋白、组蛋白H1H1及大肠杆菌单链结合蛋白质及大肠杆菌单链结合蛋白质等能与核酸结合的特性，制备相应的探针。等能与核酸结合的特性，制备相应的探针。68四、 DNA序列测定法（录像） DNADNA序列测定，即核酸一级结构的测定，简称序列测定，即核酸一级结构的测定，简称DNADNA测序。测序。对克隆对克隆DNADNA片段进行序列测定及分析片段进行序列测定及分析: :可以直观地鉴定出重组可以直观地鉴定出重组DNADNA分子中是否含有目的基因分子中是否含有目的基因; ;可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列. .这对目的基因的表达及其功能研究具有重要
41、意义。这对目的基因的表达及其功能研究具有重要意义。69DNA序列分析目前用于测序的技术主要有目前用于测序的技术主要有: :SangerSanger等（等（19751975）发明的）发明的双脱氧链末端终止双脱氧链末端终止法法MaxamMaxam和和GilbertGilbert（19771977）发明的）发明的化学降解法。化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生特定的碱基处终止，产生A A，T T，C C，G G四组不四组不同长度的一系列核苷酸，然后在同
42、长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的尿素变性的PAGEPAGE胶胶上电泳进行检测，从而获得上电泳进行检测，从而获得DNADNA序列。序列。目前目前SangerSanger测序法得到了广泛的应用。测序法得到了广泛的应用。 701 DNA的化学降解测序法DNADNA的化学降解测序的化学降解测序法法也叫也叫Maxam-GilbertMaxam-Gilbert测序法测序法基本原理基本原理是，将待测是，将待测DNADNA分子进行末端放射性标记，分子进行末端放射性标记，然后置于然后置于4 4组独立的化学反应体系中分别进行部分组独立的化学反应体系中分别进行部分降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或降解，
43、其中每一组反应特异性地针对某一碱基或某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一组反应体系中，生成各种不同长度的、一端为放组反应体系中，生成各种不同长度的、一端为放射性标记固定的寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺射性标记固定的寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNADNA分分子的碱基序列。子的碱基序列。71（2）碱基切割反应体系 进行碱基特异性化学切割反应的试剂是硫酸二甲进行碱基特异性化学切割反应的试剂是硫酸二甲酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。硫酸二甲
44、酯硫酸二甲酯、肼（联氨）肼（联氨）碱基进行化学修饰；碱基进行化学修饰；哌啶哌啶从修饰碱基处断裂核苷酸链。从修饰碱基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同的组合能特异地切割核苷酸序列中化学试剂按不同的组合能特异地切割核苷酸序列中的特定碱基，降解待测模板的特定碱基，降解待测模板DNADNA分子。分子。72硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMSDMS）：）： G G；pH2pH2甲酸哌啶：甲酸哌啶： G+AG+A; ;肼（肼（NH2NH2NH2NH2）：）： C+TC+T; ;肼（肼（NH2NH2NH2NH2）+ +高盐：高盐： C C7
45、31、待测模板、待测模板的制备的制备3、待测模板、待测模板DNA分子的分子的序列分析序列分析2、化学降解、化学降解待测模板待测模板DNA分子分子测序步骤（3 3）DNADNA74序序序序列列列列的的的的读读读读取取取取是是是是逆逆逆逆电电电电泳泳泳泳方方方方向向向向进进进进行行行行的的的的DNADNA75化学降解测序法不仅适于化学降解测序法不仅适于单链单链DNADNA，也适于也适于双链双链DNADNA的测序，主要用于研究的测序，主要用于研究DNADNA的一级和二级结构、的一级和二级结构、DNADNA甲基化位点测定和甲基化位点测定和DNA-DNA-蛋白质相互作用等方蛋白质相互作用等方面，结果准确
46、可靠，是面，结果准确可靠，是DNADNA测序的基本方法之一。测序的基本方法之一。它的它的缺点是一轮反应所能测定模板缺点是一轮反应所能测定模板DNADNA长度只有长度只有250bp250bp左右，若测定大片段左右，若测定大片段DNADNA分子时，操作较为分子时，操作较为繁琐费时。繁琐费时。另外，化学降解测序法另外，化学降解测序法不能在载体上不能在载体上直接进行，直接进行，标记后的模板标记后的模板DNADNA分子难以纯化。分子难以纯化。762 DNA的双脱氧链终止测序法双脱氧链终止测序法是由双脱氧链终止测序法是由SangerSanger等在加减法等在加减法的基础上建立的一种简单快速的的基础上建立的
47、一种简单快速的DNADNA序列分序列分析法，故也称为析法，故也称为SangerSanger测序法测序法。有时又称为。有时又称为引物合成法引物合成法，或，或酶促引物合成法酶促引物合成法，因为该法，因为该法是以待测是以待测DNADNA分子为模板，在分子为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的的作用下，利用适当的作用下，利用适当的DNADNA合成引物进行合成引物进行DNADNA互互补链的合成补链的合成来完成测序工作的。来完成测序工作的。77基本原理基本原理：DNADNA聚合酶能够利用单链聚合酶能够利用单链DNADNA作作模板，合成出对应的模板，合成出对应的DNADNA互补链，但在反应互补链，但在反应过程
48、中，如果过程中，如果2 2，3 3- -双脱氧核糖核苷三双脱氧核糖核苷三磷酸底物磷酸底物（ddNTPddNTP）掺入到寡核苷酸链的）掺入到寡核苷酸链的3 3端，端，DNADNA链的延伸反应即被终止。链的延伸反应即被终止。ddNTPddNTP链终止核苷酸链终止核苷酸（1 1）基本原理）基本原理787980在在4 4个特定反应体系中个特定反应体系中分别加入一种分别加入一种ddNTPddNTP反应底反应底物（物（ddCTPddCTP、ddATPddATP、ddGTPddGTP、ddTTPddTTP）以及）以及DNADNA模板、模板、合成引物、合成引物、DNADNA聚合酶聚合酶I I、一定浓度的、一定
49、浓度的dNTPdNTP（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP，其中有一种是带，其中有一种是带3232P P放射性标放射性标记的），记的），DNADNA链的合成随机终止于某一特定链的合成随机终止于某一特定ddNTPsddNTPs。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术读出待测读出待测DNADNA模板的碱基序列。模板的碱基序列。双脱氧链终止测序法的精确度较高，绝大多数以双脱氧链终止测序法的精确度较高，绝大多数以单纯测定单纯测定DNADNA序列为目的的实验室均采用此法。序列为目的的实验室均采用此法。此法读取的碱基序列是待
50、测此法读取的碱基序列是待测DNADNA模板的互补链，而模板的互补链，而非模板链本身。非模板链本身。81ddNTP 82838485（2）双脱氧核糖核苷三磷酸的作用机制 2 2，3 3- -双脱氧核糖核苷三磷酸双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTPddNTP）的分子结构式与）的分子结构式与2 2- -脱氧核糖核苷三磷脱氧核糖核苷三磷酸（酸（dNTPdNTP）极为相似，惟一的区别是，）极为相似，惟一的区别是，ddNTPddNTP在脱在脱氧核糖的氧核糖的3 3位置上缺少一个羟基。位置上缺少一个羟基。 在在DNADNA链的合成过程中，链的合成过程中，ddNTPddNTP可以利用其可以利用其5 5- -磷酸基
51、团与磷酸基团与DNADNA链上的游离羟基基团形成磷酸链上的游离羟基基团形成磷酸二酯键而使链得以延伸，但是由于二酯键而使链得以延伸，但是由于ddNTPddNTP缺少缺少3 3- -0H0H基团，不能与下一个底物分子的基团，不能与下一个底物分子的5 5- -磷酸基团磷酸基团进行反应，因此新生的寡核酸链一旦加入进行反应，因此新生的寡核酸链一旦加入ddNTPddNTP，DNADNA链的合成就会终止。链的合成就会终止。8687（3）待测模板DNA分子的制备限制性核酸内切酶消化切割形成限制性核酸内切酶消化切割形成DNADNA小片段小片段随机地克隆到一种合适的载体分子上随机地克隆到一种合适的载体分子上经转化
52、筛选后得到含有同一来源经转化筛选后得到含有同一来源DNADNA片段的重组子片段的重组子克隆后代克隆后代以此大量制备重组以此大量制备重组DNADNA分子，直接用于分子，直接用于DNADNA测序需测序需要要采用采用采用采用DNADNADNADNA分子克隆分子克隆分子克隆分子克隆的方法制备模板的方法制备模板的方法制备模板的方法制备模板DNADNADNADNA：88 因为新生因为新生DNADNA链的合成反应是从引物链的合成反应是从引物3 3端定向进行的，无须将待测端定向进行的，无须将待测DNADNA片段从片段从载体上切下。载体上切下。 事实上，载体的存在不但不会影响事实上，载体的存在不但不会影响测序的
53、结果，反而有利于测序的进行，因测序的结果，反而有利于测序的进行，因为在实际操作中，为在实际操作中，引物往往是与载体克隆引物往往是与载体克隆位点的两侧序列互补位点的两侧序列互补，这样可以测定完整，这样可以测定完整的的DNADNA序列。序列。89 M13M13载体载体能克隆单链能克隆单链DNADNA分子，制备的产物可直接用作分子，制备的产物可直接用作引物合成反应中的单链模板，同时，由于待测引物合成反应中的单链模板，同时，由于待测DNADNA片段均被片段均被克隆在克隆在M13M13载体的同一个特定区段内，载体的同一个特定区段内，所有的待测所有的待测DNADNA片段，片段，都可以使用同一种引物，即都可
54、以使用同一种引物，即M13M13载体克隆位点两侧的通用引载体克隆位点两侧的通用引物（物（universal primeruniversal primer）进行）进行DNADNA链的合成延伸链的合成延伸，避免了因，避免了因合成和分离各种不同引物而导致的许多麻烦。合成和分离各种不同引物而导致的许多麻烦。 因此，因此，M13M13载体双脱氧链终止法目前已经成为一种普载体双脱氧链终止法目前已经成为一种普遍采用的快速遍采用的快速DNADNA序列分析法。序列分析法。9019851985年年ChenChen和和SeeburgSeeburg为了提高为了提高DNADNA测序速度建立。测序速度建立。 该法是将待测
55、定的该法是将待测定的DNADNA片段克隆到质粒载体上，直片段克隆到质粒载体上，直接用接用闭合环形的双链质粒闭合环形的双链质粒DNADNA按双脱氧链终止法测定模板按双脱氧链终止法测定模板DNADNA序列。由于通常使用的质粒是序列。由于通常使用的质粒是PUCPUC载体系列，所以又称载体系列，所以又称之为之为SangerSanger双脱氧链终止双脱氧链终止-pUC-pUC体系体系DNADNA序列分析法。序列分析法。这种方法的最大这种方法的最大优点优点是，它无须将是，它无须将DNADNA克隆到克隆到M13M13载体分子载体分子上，而是直接用碱变性的双链闭合环形的重组质粒上，而是直接用碱变性的双链闭合环
56、形的重组质粒DNADNA作作为模板进行序列分析，因此比为模板进行序列分析，因此比M13M13法更为简单快速，实用法更为简单快速，实用价值高。价值高。针对双链针对双链DNA模板进行的双脱氧链终止测序法模板进行的双脱氧链终止测序法91（4）测序反应物的合理应用双脱氧链终止测序法的双脱氧链终止测序法的操作关键操作关键：是：是ddNTPddNTP与与dNTPdNTP的用量比例的用量比例，两者较为理想的分子，两者较为理想的分子比在比在1 1：3 3至至1 1：4 4之间。之间。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段、测序酶片段、测序酶（经过改造的（经过改造的T7T7噬菌体聚
57、合酶）、噬菌体聚合酶）、TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶DNADNA序列分析中通常采用序列分析中通常采用-3535S SdATPdATP代替代替-3232P PdNTPdNTP，以便获得更高的分辨率。，以便获得更高的分辨率。923 大片段DNA的测序策略 DNADNA测序通常包括测序通常包括克隆、测序反应和读序克隆、测序反应和读序三个步骤。三个步骤。 前述两种前述两种DNADNA测序方法中，一次测序能直接读出的测序方法中，一次测序能直接读出的DNADNA序列长度受到序列长度受到聚丙烯酰胺凝胶分离效果聚丙烯酰胺凝胶分离效果的限制，一般的限制，一般情况下，最大限度不超过情况下，最大限度不超过3
58、50350个碱基序列。因此，对于较个碱基序列。因此，对于较大的大的DNADNA片段而言，必须将其分成较小的片段分别测序，片段而言，必须将其分成较小的片段分别测序，才能获得完整的碱基序列。才能获得完整的碱基序列。 选择选择恰当的测序策略恰当的测序策略将直接关系到大片段将直接关系到大片段DNADNA或基或基因组因组DNADNA序列分析的工作效率。序列分析的工作效率。 93随机克隆策略又叫又叫鸟枪法克隆策略鸟枪法克隆策略，先将克隆，先将克隆DNADNA片段用超声波片段用超声波打断或打断或DNADNA酶酶切断，随机亚克隆到切断，随机亚克隆到M13M13载体上，载体上，分别进行分别进行DNADNA序列测
59、定，然后利用计算机进行数据序列测定，然后利用计算机进行数据分析，排出完整的分析，排出完整的DNADNA序列。序列。鸟枪法的缺点鸟枪法的缺点随机亚克隆易造成序列重复测定，也易丢失某些随机亚克隆易造成序列重复测定，也易丢失某些序列；序列；测序及测序后的数据处理和分析工作量大，并需测序及测序后的数据处理和分析工作量大，并需要计算机帮助进行排序才能得到完整的序列。要计算机帮助进行排序才能得到完整的序列。9495 引物步移策略将待测将待测DNADNA片段克隆在片段克隆在质粒载体质粒载体上，利用引上，利用引物步移延伸，从物步移延伸，从DNADNA片段的一端开始逐步进片段的一端开始逐步进行序列测定，直到另一
60、端为止。行序列测定，直到另一端为止。9697引物步移法克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克引物步移法克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备的繁琐步骤，也减轻了随后数据分析的工隆制备的繁琐步骤，也减轻了随后数据分析的工作量。作量。但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基序列，才能合成适当的引物进行测序，因此碱基序列，才能合成适当的引物进行测序，因此该策略难以自动化操作该策略难以自动化操作。此外，引物合成费时费。此外，引物合成费时费力，再加上目前常用的力，再加上目前常用的质粒载体不易纯化质粒载体不易纯化等也都等也都影响了该法的实施。影响了该法的实施。最近
61、的研究表明最近的研究表明：随机引物：随机引物可作为引物步移法中可作为引物步移法中的测序引物，例如采用线性连接的的测序引物，例如采用线性连接的3 3条条6 6碱基的随碱基的随机引物即可很好地引导测序反应，这些结果为引机引物即可很好地引导测序反应，这些结果为引物步移法的自动化带来可能。物步移法的自动化带来可能。98定向缺失克隆策略利用核酸外切酶利用核酸外切酶、Bal31Bal31或或T4 DNAT4 DNA聚合酶等酶解聚合酶等酶解方法，从克隆方法，从克隆DNADNA片段一侧进行片段一侧进行不同时间的定向缺不同时间的定向缺失，逐步缩短失，逐步缩短DNADNA片段大小，分别回收并环化片段大小，分别回收
62、并环化DNADNA缺失片段，使缺失片段，使DNADNA片段被保护一侧的引物结合位点片段被保护一侧的引物结合位点与缺失不同长度的一侧连接重组，转化筛选后得与缺失不同长度的一侧连接重组，转化筛选后得到一系列由待测到一系列由待测DNADNA片段定向缺失后形成的嵌套重片段定向缺失后形成的嵌套重组子，然后利用引物结合位点逐一测定这些嵌套组子，然后利用引物结合位点逐一测定这些嵌套重组子中的待测重组子中的待测DNADNA模板，最后根据重叠序列将不模板，最后根据重叠序列将不同片段的序列拼接为完整的同片段的序列拼接为完整的DNADNA片段序列。片段序列。99利用利用Exo能特异能特异性起始切割性起始切割5凸出凸
63、出端或平末端的双链端或平末端的双链DNA，而不能有，而不能有效切割效切割3凸出端的凸出端的双链双链DNA的特性，的特性，构建待测构建待测DNA的的定向定向嵌套缺失。嵌套缺失。1004、DNA测序技术的发展第一，非放射性标记检测物的使用第一，非放射性标记检测物的使用第二，第二，DNADNA测序自动化：测序自动化：1 1是测序过程中某些具体是测序过程中某些具体 步骤的步骤的机械化和自动化，机械化和自动化，2 2是高度集成的自动化测序仪的发明及是高度集成的自动化测序仪的发明及应用应用第三，计算机在第三，计算机在DNADNA测序中的应用：测序中的应用：大规模测序计划在很大规模测序计划在很大程度上依赖于
64、计算机程序对原始数据进行分类、整理和大程度上依赖于计算机程序对原始数据进行分类、整理和排序，尤其是在随机测序策略中，采用计算机辅助分析，排序，尤其是在随机测序策略中，采用计算机辅助分析，大大加快了大大加快了DNADNA测序的发展进程。测序的发展进程。101第四，现有技术的其他改进。第四，现有技术的其他改进。主要包括：主要包括：增加每块胶上的泳道数；增加每块胶上的泳道数；采用新型凝胶和电泳技术；采用新型凝胶和电泳技术；改进光学检测系统；改进光学检测系统；提高测序聚合酶的催化效能等。提高测序聚合酶的催化效能等。 其目的是大大加快测序速度，提高其目的是大大加快测序速度，提高测序反应的灵敏度及准确性，
65、降低测序反测序反应的灵敏度及准确性，降低测序反应对模板质量的要求，简化模板制备程序应对模板质量的要求，简化模板制备程序等。等。102DNADNA测序方法分为两类：测序方法分为两类：一类是基于凝胶电泳技术的测序法一类是基于凝胶电泳技术的测序法，包括，包括目前普遍采用的手工目前普遍采用的手工DNADNA测序技术、自动化测序技术、自动化DNADNA测序技术、毛细管凝胶电泳激光荧光法、测序技术、毛细管凝胶电泳激光荧光法、阵列毛细管电泳激光荧光法和超薄层凝胶阵列毛细管电泳激光荧光法和超薄层凝胶板电泳激光荧光法等；板电泳激光荧光法等；另一类是不依赖于电泳分离的直接测序法另一类是不依赖于电泳分离的直接测序法
66、，包括质谱法、原子探针法、杂交法和流动包括质谱法、原子探针法、杂交法和流动式单分子荧光检测法等。式单分子荧光检测法等。103（1）以凝胶电泳为基础的测序方法 DNADNA全自动序列分析系统（全自动序列分析系统（ALF ALF systemsystem）DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四
67、种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光光信信号号，并并依此确定依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 104超薄层板凝胶电泳（ultra-thin gel electrophoresis，UGE）激光荧光法 在在电泳方式方面电泳方式方面有有2 2处改进：处改进：1 1是超高压电场的使用，是超高压电场的使用，它可以大幅度提高电泳速度；它可以大幅度提高电泳速度；2 2是超薄凝胶的使用，由是超薄凝胶的使用，由于降低了凝胶厚度，不仅提高了电泳速度，还可以提于降低了凝胶厚度，不仅提
68、高了电泳速度，还可以提高电泳条带的分辨率，使一次性阅读由原来的高电泳条带的分辨率，使一次性阅读由原来的500500个碱个碱基上升至基上升至10001000个碱基，总的效果是测序速度提高到个碱基，总的效果是测序速度提高到 8000bp8000bph h以上。在以上。在电泳结果检测方式电泳结果检测方式方面，以激光荧方面，以激光荧光检测法取代了传统的放射自显影检测法，既杜绝了光检测法取代了传统的放射自显影检测法，既杜绝了放射性核素带来的危害，也便于自动化操作。放射性核素带来的危害，也便于自动化操作。105PCRPCR测序技术测序技术第一，利用第一，利用PCRPCR技术直接从大的技术直接从大的DNAD
69、NA片段或基因组片段或基因组DNADNA中扩增中扩增获得足够量的待测获得足够量的待测DNADNA模板，从而省去亚克隆等繁琐步骤。模板，从而省去亚克隆等繁琐步骤。目前，不对称目前，不对称PCRPCR、单链、单链PCRPCR、固相、固相PCRPCR以及循环以及循环PCRPCR等新的等新的PCRPCR技术都已应用到技术都已应用到DNADNA测序中。测序中。第二，通过第二，通过PCRPCR技术进行重叠群排序。将由重叠群末端序列技术进行重叠群排序。将由重叠群末端序列确定的引物逐一配对，以待测大片段确定的引物逐一配对，以待测大片段DNADNA为模板进行为模板进行PCRPCR，如能扩增出阳性条带，便说明这两
70、个重叠群相邻。重叠群如能扩增出阳性条带，便说明这两个重叠群相邻。重叠群顺序一经确定，便可利用顺序一经确定，便可利用PCRPCR扩增重叠群间的扩增重叠群间的DNADNA片段。片段。第三，利用第三，利用PCRPCR技术进行技术进行DNADNA链终止测序反应，这一过程被链终止测序反应，这一过程被称为称为循环测序循环测序。循环测序是在模板。循环测序是在模板DNADNA分子过少时，用耐高分子过少时，用耐高温的温的TaqTaq酶代替酶代替DNADNA聚合酶进行酶法测序。在测序反应中，聚合酶进行酶法测序。在测序反应中，一方面模板一方面模板DNADNA分子得以扩增，另一方面分子得以扩增，另一方面ddNTPdd
71、NTP的插入造成的插入造成以特定以特定ddNTPddNTP结尾的长短不同的结尾的长短不同的DNADNA片段。通过电泳分离便片段。通过电泳分离便可获得待测可获得待测DNADNA分子的碱基序列。分子的碱基序列。循环测序的优点循环测序的优点有：大大有：大大减少了模板减少了模板DNADNA的用量；重复的变性、复性、链延伸循环可的用量；重复的变性、复性、链延伸循环可使双链使双链DNADNA的酶法测序高效进行；初始阶段加入试剂后不必的酶法测序高效进行；初始阶段加入试剂后不必在中途补充，可实现自动化。在中途补充，可实现自动化。106 毛细管及阵列毛细管电泳激光荧光法毛细管及阵列毛细管电泳激光荧光法与普通凝胶
72、电泳相比，毛细管凝胶电泳具备很多优势：与普通凝胶电泳相比，毛细管凝胶电泳具备很多优势：第一，高效、快速。毛细管内径一般在第一，高效、快速。毛细管内径一般在2525100pm100pm，比表，比表面积大，散热快，可使用较高的电场强度，大大提高了分面积大，散热快，可使用较高的电场强度，大大提高了分析速度和分辨率。析速度和分辨率。第二，所需样品量少，灵敏度高。采用电动进样或压力进第二，所需样品量少，灵敏度高。采用电动进样或压力进样，样品量仅为样，样品量仅为1-50ul1-50ul，普通紫外检测器可检测，普通紫外检测器可检测1010-13-13-10-10- -1515molmol，激光诱导荧光检测可
73、达，激光诱导荧光检测可达1010-18-18-10-10-21-21molmol。第三，在线检测。利用检测窗口直接进行柱检测，不受凝第三，在线检测。利用检测窗口直接进行柱检测，不受凝胶长度的影响。胶长度的影响。第四，操作自动化、重复实验误差低。第四，操作自动化、重复实验误差低。因此，利用毛细管凝胶电泳进行因此，利用毛细管凝胶电泳进行DNADNA测序，分辨率极高，测序，分辨率极高，其关键在于选择合适的毛细管长度、电场强度、凝胶聚合其关键在于选择合适的毛细管长度、电场强度、凝胶聚合物浓度及温度因素等，以达到将一个碱基大小差异的物浓度及温度因素等，以达到将一个碱基大小差异的DNADNA片段顺利分离开
74、来的目的。片段顺利分离开来的目的。107（2）非电泳分离的测序技术 杂交法（杂交法（SBHSBH）SBHSBH的基本原理是，用特定长度的具有所的基本原理是，用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸群体，与未有可能碱基序列的寡核苷酸群体，与未知序列的特点数目的知序列的特点数目的DNADNA片段杂交，根据片段杂交，根据某些寡核苷酸探针形成的完全双链推知某些寡核苷酸探针形成的完全双链推知目的目的DNADNA的碱基序列。的碱基序列。108利用共价结合在寡核苷酸利用共价结合在寡核苷酸3 3或或5 5端的衍生物与玻璃板或端的衍生物与玻璃板或凝胶结合，形成固定的凝胶结合，形成固定的寡核苷酸小区寡核苷酸小区
75、；不同碱基组合的寡；不同碱基组合的寡核苷酸小区排列在一起形成核苷酸小区排列在一起形成探针点阵探针点阵，构成，构成DNADNA测序芯片测序芯片或称为或称为基因芯片、寡核苷酸矩阵芯片基因芯片、寡核苷酸矩阵芯片。芯片中寡核苷酸小。芯片中寡核苷酸小区的数目取决于寡核苷酸片段的长度，以八聚体单链区的数目取决于寡核苷酸片段的长度，以八聚体单链DNADNA探针为例，包含所有可能的探针为例，包含所有可能的4 4种碱基的全部排列序列共计种碱基的全部排列序列共计4 48 8=65536=65536种，因此在芯片上寡核苷酸小区数目为种，因此在芯片上寡核苷酸小区数目为65 53665 536个，个，每一个寡核苷酸小区
76、则代表了一个已知序列的探针。每一个寡核苷酸小区则代表了一个已知序列的探针。每一每一个探针序列与其所处位置的对应关系是已知的，测序时，个探针序列与其所处位置的对应关系是已知的，测序时，只须将待测只须将待测DNADNA样品变性解链，在单链样品变性解链，在单链DNADNA片段末端上共价片段末端上共价标记一个标记一个荧光分子荧光分子，然后与基因芯片进行复性杂交。经适，然后与基因芯片进行复性杂交。经适当清洗后，与探针完全杂交的单链当清洗后，与探针完全杂交的单链DNADNA的荧光分子在特定的荧光分子在特定波长的激光束照射下，发射出一定波长的荧光，然后再由波长的激光束照射下，发射出一定波长的荧光，然后再由荧
77、光扫描仪荧光扫描仪将基因芯片上的所有方格点阵进行荧光扫描检将基因芯片上的所有方格点阵进行荧光扫描检测，并将荧光发射与否的正负信号传输到电脑，最后根据测，并将荧光发射与否的正负信号传输到电脑，最后根据发射荧光的探针序列排出待测发射荧光的探针序列排出待测DNADNA样品的全序列。样品的全序列。109110 原子探针显微镜法原子探针显微镜法扫描隧道显微镜（扫描隧道显微镜（STMSTM）和原子显微镜（）和原子显微镜（AFMAFM）等新技术的发展，使快速、高分辨、直接观测等新技术的发展，使快速、高分辨、直接观测DNADNA分子构象成为可能。分子构象成为可能。STMSTM采用了相当于原子直径的导电探针扫描
78、样采用了相当于原子直径的导电探针扫描样品表面，通过连续测量移动的探头与分子表面品表面，通过连续测量移动的探头与分子表面之间形成的隧道电流，确定样品的三维图像。之间形成的隧道电流，确定样品的三维图像。AFMAFM则是通过测量探针和则是通过测量探针和DNADNA样品表面的作用力样品表面的作用力来确定分子表面形状，并不要求样品导电。来确定分子表面形状，并不要求样品导电。目前，应用目前，应用STMSTM已成功地观测到已成功地观测到DNADNA双螺旋结构双螺旋结构和单个碱基对以及单链分子中的单个核苷酸，和单个碱基对以及单链分子中的单个核苷酸，因此可以直接从因此可以直接从DNADNA单链上读取碱基序列。根
79、单链上读取碱基序列。根据扫描速度，据扫描速度，DNADNA测序能力可达测序能力可达1000bp1000bpminmin以以上。上。111 流动式单分子荧光检测流动式单分子荧光检测法法美国美国Los AlamosLos Alamos国家实验室建立的一种快速国家实验室建立的一种快速DNADNA测序新技术，可测序新技术，可对单个分子进行检测。对单个分子进行检测。基本原理是，对模板基本原理是，对模板DNADNA片段上的片段上的4 4种碱基分别标记上不同的荧种碱基分别标记上不同的荧光基团，然后置于液体系统中，用水流载带光基团，然后置于液体系统中，用水流载带DNADNA片段流动，利用片段流动，利用外切酶快
80、速逐个地切断外切酶快速逐个地切断DNADNA中标记的单个碱基，通过激光荧光检中标记的单个碱基，通过激光荧光检测碱基类型，便可得到模板测碱基类型，便可得到模板DNADNA序列。序列。据报道，此法测序速度可达据报道，此法测序速度可达1001001000bp/s1000bp/s，而常规的自动测序，而常规的自动测序仪最快的阅读速度仅为仪最快的阅读速度仅为0.1bp/s0.1bp/s。存在的主要问题是如何快速酶切单个荧光标记的核苷酸分子以存在的主要问题是如何快速酶切单个荧光标记的核苷酸分子以及如何用及如何用4 4种不同的荧光基团标记不同的种不同的荧光基团标记不同的4 4种碱基等。种碱基等。112基本过程
81、与菌落分子杂交法相似，但该法使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。免疫学检测法具有专一性强、灵敏度高的特点，只要有一个拷贝的目的基因在克隆子细胞内表达合成蛋白质，就可以检测出来。前提条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。根据实验手段的不同，免疫学检测法可以分为抗体测定法和免疫沉淀测定法等类型。四、免疫化学检测法（自学）四、免疫化学检测法（自学）113（1）放射性抗体测定法（2）非放射性抗体测定法1、抗体测定法、抗体测定法114基本依据一种免疫血清中含有多种类型的免疫球蛋白IgG分子，这些IgG分子分别与同一抗原分子上不同的抗原决定簇特异性结合。抗体分子或其某部分
82、可牢固地吸附在固体支持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不会被洗脱掉。通过体外碘化作用，IgG抗体会迅速地被放射性125I标记上。（1）放射性抗体测定法）放射性抗体测定法115放射性抗体测定法的操作过程放射性抗体测定法的操作过程116目前所采用的免疫学检测方法中，更多的是先将待检测的菌落或噬菌斑按原位印迹到硝酸纤维素膜等固相支持物上，然后裂解细胞，使目的蛋白抗原结合到硝酸纤维素膜上，进一步与相应的抗体（即第一抗体）反应，形成抗原-抗体复合物。对抗原-抗体复合物的检测，既可采用125I标记的第二抗体直接检测，也可采用125I标记的A蛋白进行间接分析。直接检测法中，针对不同的第一抗体，应分别标记
83、相应的第二抗体进行检测；间接分析法中，只须标记一种A蛋白分子便可检测多种不同的第一抗体（A蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种组分，它可以牢固地结合到IgG分子的Fc段，形成多分子复合物）因此用一种碘化标记试剂可以检测筛选产生不同抗原的重组克隆子，而不必每次标记不同的第二抗体。117118119120121（2 2）非放射性抗体测定法）非放射性抗体测定法非放射性抗体分析技术的发展得益于非放射性标记物的广泛成功的应用。可以采用直接与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）偶合的第二抗体，检测目的蛋白抗原-抗体复合物。也可采用与HRP偶联的抗生物素蛋白来检测与生物素偶联的第二抗体等。这些方法也称为
84、酶联免疫检测分析法（ELISA），具有较高的灵敏度和特异性，也没有使用放射性核素标记物带来的半衰期短和安全防护等问题。1221231241251262 2、免疫沉淀测定法、免疫沉淀测定法在生长有转化子菌落的培养基中，加入在生长有转化子菌落的培养基中，加入与目的基因产物相对应的标记抗体。如与目的基因产物相对应的标记抗体。如果菌落会产生与抗体相对应的抗原蛋白果菌落会产生与抗体相对应的抗原蛋白（目的基因产物），则其周围就会出现（目的基因产物），则其周围就会出现一种叫一种叫沉淀素沉淀素的抗体的抗体- -抗原沉淀物形成的抗原沉淀物形成的白色圆圈。该方法操作简便，但灵敏度白色圆圈。该方法操作简便，但灵敏度
85、不高，实用性较差。不高，实用性较差。127128五、转译筛选法（了解）五、转译筛选法（了解） 转译筛选法，分为杂交选择转译（hybrid selected translation）和杂交抑制转译（hybrid arrested translation）。其突出优点在于将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。1291 1、杂交抑制转译检测法、杂交抑制转译检测法原理是，在体外无细胞的转译体系中，目的基因的转录产原理是，在体外无细胞的转译体系中，目的基因的转录产物物mRNAmRNA一旦同一旦同DNADNA分子杂交之后，就不再能够指导蛋白质分子杂交之后，就不再能够指导蛋白质多肽的合成。多
86、肽的合成。从转化子菌落或噬菌体群体中制备从转化子菌落或噬菌体群体中制备质粒质粒DNADNA，变性后选择有利于形成，变性后选择有利于形成DNA-RNADNA-RNA杂种分子杂种分子，但不利于形，但不利于形成成DNA-DNADNA-DNA杂种分子，同时又能阻止线性质粒杂种分子，同时又能阻止线性质粒DNADNA再环化的再环化的反应条件，与反应条件，与原菌落或噬菌体群体的总原菌落或噬菌体群体的总mRNAmRNA进行杂交进行杂交。从从杂交混合物中回收核酸，杂交混合物中回收核酸，进行体外转译。由于体系中加有进行体外转译。由于体系中加有3232S S标记的甲硫氨酸，因此转译合成的多肽蛋白质，可以通标记的甲硫
87、氨酸，因此转译合成的多肽蛋白质，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析。过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析。把其结果把其结果同未经杂交处理的同未经杂交处理的mRNAmRNA的转译产物作比较，若杂交组缺少的转译产物作比较，若杂交组缺少某种蛋白质（被杂交抑制了的某种蛋白质（被杂交抑制了的mRNAmRNA的产物），表明供杂交的产物），表明供杂交用的那部分克隆子群体中含有目的基因。用的那部分克隆子群体中含有目的基因。然后，将这个群然后，将这个群体分成若干较小的群体，并重复上述实验程序，直至最后体分成若干较小的群体，并重复上述实验程序，直至最后鉴定出含目的基因的单一克隆子。鉴定出含目的基因
88、的单一克隆子。130如果被研究的目的基因能编码丰富的如果被研究的目的基因能编码丰富的mRNAmRNA，采用杂交抑制转译检测法筛选阳，采用杂交抑制转译检测法筛选阳性克隆子尤为适合。性克隆子尤为适合。常用的无细胞转译体系包括麦胚提取物常用的无细胞转译体系包括麦胚提取物和网织红细胞提取物等，系统中包含了和网织红细胞提取物等，系统中包含了基因表达所需要的所有因子，如基因表达所需要的所有因子，如RNARNA聚聚合酶、核糖体、合酶、核糖体、tRNAtRNA、核苷酸、氨基酸、核苷酸、氨基酸以及合适的缓冲液组成成分。以及合适的缓冲液组成成分。1312 2、杂交选择转译检测法、杂交选择转译检测法 杂交选择转译法
89、，有时也称杂交选择转译法，有时也称杂交释放转杂交释放转译法（译法（hybrid releasedhybrid released translationtranslation），），比杂交抑制转译法灵敏度更高的阳性重比杂交抑制转译法灵敏度更高的阳性重组子筛选法，适用于低丰度组子筛选法，适用于低丰度mRNAmRNA产物的产物的cDNAcDNA重组分子的检测。重组分子的检测。与杂交抑制转译法不同，杂交选择转译与杂交抑制转译法不同，杂交选择转译法是通过杂交手段选择目的法是通过杂交手段选择目的mRNAmRNA进行体进行体外转译，而非抑制目的外转译，而非抑制目的mRNAmRNA的体外转译。的体外转译。13
90、2基本做法基本做法是从克隆文库中挑取转化菌落或噬菌体群体，分离制备是从克隆文库中挑取转化菌落或噬菌体群体，分离制备其其质粒质粒DNADNA分子分子，经适当处理后，经适当处理后牢固结合在硝化纤维素滤膜上牢固结合在硝化纤维素滤膜上。然后用同一菌落或噬菌体群体的然后用同一菌落或噬菌体群体的mRNAmRNA（甚至是总的细胞（甚至是总的细胞RNARNA）进）进行杂交。行杂交。通过洗脱作用，分离出能与结合的通过洗脱作用，分离出能与结合的DNADNA分子杂交的分子杂交的mRNAmRNA。回收杂交的回收杂交的mRNAmRNA，加到无细胞体系中进行体外转译，通过凝胶电，加到无细胞体系中进行体外转译，通过凝胶电泳分析或根据生物活性鉴定转译合成的带放射性标记的多肽产物。泳分析或根据生物活性鉴定转译合成的带放射性标记的多肽产物。一旦获得某种呈阳性反应的克隆群体，可将它分成许多小库，直一旦获得某种呈阳性反应的克隆群体，可将它分成许多小库，直到用划线培养法获得一个或数个呈阳性反应的单菌落重组子为止。到用划线培养法获得一个或数个呈阳性反应的单菌落重组子为止。133134
