《蛋白质的测定ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的测定ppt课件（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Determination of protein Determination of protein and amino acid in Foodand amino acid in Food第九章第九章 蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定1 1第一节第一节 概述概述 1.1.1.1.蛋白质的元素组成（蛋白质的元素组成（蛋白质的元素组成（蛋白质的元素组成（The elements of The elements of The elements of The elements of proteinproteinproteinprotein） C C C C：50-55% N50-55% N50
2、-55% N50-55% N：15-18% O15-18% O15-18% O15-18% O：20-23% 20-23% 20-23% 20-23% H H H H：6-8% S6-8% S6-8% S6-8% S：0-4%0-4%0-4%0-4% 微量元素：微量元素：微量元素：微量元素：P P P P、FeFeFeFe、ZnZnZnZn、CuCuCuCu2 2 2 2、基本结构单位：氨基酸、基本结构单位：氨基酸、基本结构单位：氨基酸、基本结构单位：氨基酸3 3 3 3、蛋白质的变性作用。、蛋白质的变性作用。、蛋白质的变性作用。、蛋白质的变性作用。2 24、蛋白质分析的重要性、蛋白质分析的重
3、要性生物活性测定生物活性测定生物活性测定生物活性测定功能性质调查功能性质调查功能性质调查功能性质调查营养标签营养标签营养标签营养标签 总蛋白质含量总蛋白质含量总蛋白质含量总蛋白质含量 氨基酸组成氨基酸组成氨基酸组成氨基酸组成 蛋白质的营养价值蛋白质的营养价值蛋白质的营养价值蛋白质的营养价值3 35、蛋白质的测定方法、蛋白质的测定方法利用蛋白质共性的方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法凯氏定氮法杜马斯法杜马斯法福林酚法福林酚法染色法染色法4 4第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色
4、反应电电电电泳泳泳泳或或或或纸纸纸纸层层层层析析析析之之之之后后后后用用用用一一一一些些些些染染染染料料料料与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结合合合合并并并并变色。书中列举了变色。书中列举了变色。书中列举了变色。书中列举了 55种染料。种染料。种染料。种染料。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3 3种方法）种方法）种方法）种方法）（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2 2种方法）种方法）种方法）种方法）5 5第三节
5、蛋白质的定量测定关于氮关于氮- -蛋白质换算等数蛋白质换算等数6.25=6.25=6.38=5.956 6一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法 1. 1. 1. 1. 原理原理原理原理 样样样样品品品品与与与与浓浓浓浓硫硫硫硫酸酸酸酸和和和和催催催催化化化化剂剂剂剂一一一一同同同同加加加加热热热热消消消消化化化化，使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分解解解解，其其其其中中中中碳碳碳碳和和和和氢氢氢氢被被被被氧氧氧氧化化化化为为为为二二二二氧氧氧氧化化化化碳碳碳碳和和和和水水水水逸逸逸逸出出出出，而而而而样样样样品品品品中中中中的的的的有有有有机机机机氮氮氮氮转转转转化化
6、化化为为为为氨氨氨氨与与与与硫硫硫硫酸酸酸酸结结结结合合合合成成成成硫硫硫硫酸酸酸酸铵铵铵铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。7 72NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定消化消化(NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点作为增温剂，提高溶液沸点加硫酸铜加硫酸铜加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂作为催化剂、消化终点指示剂作为催化剂、消化终点指示剂作为催化剂、消化终点指示剂加氧化剂加氧化
7、剂 加速有机物氧化速度加速有机物氧化速度8 89 9 蒸馏蒸馏NH4+OH-= NH3 +H2O1010影响氨化完全和速度的因素影响氨化完全和速度的因素（1 1）KK氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量（2 2 2 2）分解剂）分解剂）分解剂）分解剂 1g1g1g1g样品样品样品样品 K K K K2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4： H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4 = 7g : 12ml= 7g : 12ml= 7g : 12ml= 7g : 12ml 还有一种比例：还有一种比例：还有一种比例：还有一种比例： K K K K2 2 2
8、 2SOSOSOSO4 4 4 4： H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4 = 10g : 20ml= 10g : 20ml= 10g : 20ml= 10g : 20ml1111用用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定 指示剂：混合指示剂（甲基红指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿）溴甲基酚绿） 指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸） 吸收与滴定吸收与滴定反应式为：反应式为： NHNH3 3+H+H3 3BOBO3 3=NH=NH4 4+ +H+H2 2BOBO3 3- - H H2 2BOBO3 3
9、- -+H+H+ +=H=H3 3BOBO3 3 用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再标准溶液吸收，再用用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。标准溶液滴定过剩的酸液。1212 现测定某一种食品的蛋白质的含量，现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h2h后，估计消化完全，取出消化液加入少后，估计消化完全，取出消化液加入少量量NaOHNaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指
10、示剂甲进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红基红- -溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。吸收液进行滴定。大量的脂肪大量的脂肪大量的脂肪大量的脂肪振摇振摇振摇振摇大火加热大火加热大火加热大火加热消化消化消化消化2h2h2h2h后，估计消化完全后，估计消化完全后，估计消化完全后，估计消化完全量量NaOHNaOH少少1313 计 算X=X X为样品中蛋白质的含量为样品中蛋白质的含量为样品中蛋白质的含量为样品中蛋白质的含量V V1 1为样品消耗盐酸标准液的体积为样品消耗盐酸标准液的体积为样品消耗盐酸标准液的体积为样品消耗盐酸标准液的体积V V2 2为试剂空白消耗盐
11、酸标准液的体积为试剂空白消耗盐酸标准液的体积为试剂空白消耗盐酸标准液的体积为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C C为盐酸标准液的浓度为盐酸标准液的浓度为盐酸标准液的浓度为盐酸标准液的浓度MMN N为氮的摩尔质量为氮的摩尔质量为氮的摩尔质量为氮的摩尔质量WW为样品的质量为样品的质量为样品的质量为样品的质量KK为氮换算为蛋白质的系数为氮换算为蛋白质的系数为氮换算为蛋白质的系数为氮换算为蛋白质的系数14141.装水至装水至 2/3 容积容积处，加甲处，加甲基橙数滴基橙数滴及硫酸数及硫酸数毫升以保毫升以保持酸性持酸性7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色水蒸气蒸馏至指示剂变绿色开始计时，蒸馏开始计时，蒸馏10min
12、，将管尖，将管尖端提离液面再蒸馏端提离液面再蒸馏1min ，用水，用水冲洗管尖后停止蒸馏冲洗管尖后停止蒸馏同时做空白同时做空白8. .吸收液用吸收液用0.01000mol/LHCl标准溶液滴定至标准溶液滴定至微红色为终点微红色为终点2.管下端管下端插入液面插入液面下下(瓶内先瓶内先装硼酸液装硼酸液及混合指及混合指示剂示剂2滴滴)3.消化液消化液 10mL4.NaOH溶液溶液5.水洗漏水洗漏斗数次斗数次6.夹好漏斗夹好漏斗夹，水封。夹，水封。4.5.6步操步操作要作要迅速迅速微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1515凯氏定氮仪凯氏定氮仪1616凯氏定氮仪凯氏定氮仪1717二二、双缩脲法双缩脲法NH2C
13、ONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2 150160双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性能和硫酸铜的碱性溶液生成溶液生成紫色络和物紫色络和物。紫色络合物。紫色络合物。1818操作方法操作方法1 1 1 1、制作标准曲线、制作标准曲线、制作标准曲线、制作标准曲线取取取取10101010支干试管分成两组，按下表平行操作：支干试管分成两组，按下表平行操作：支干试管分成两组，按下表平行操作：支干试管分成两组，按下表平行操作：0 0 0 01 1 1 12 2 2 23 3 3 34 4 4 45 5 5 5标准蛋白液标准蛋白液标准蛋白液标准蛋白液/ml/ml
14、/ml/ml 0.20.20.20.20.40.40.40.40.60.60.60.60.80.80.80.81.01.01.01.0蛋白浓度蛋白浓度蛋白浓度蛋白浓度/(mg/ml)/(mg/ml)/(mg/ml)/(mg/ml) 2.02.02.02.04.04.04.04.06.06.06.06.08.08.08.08.010.010.010.010.0蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水/ml/ml/ml/ml1.01.01.01.00.80.80.80.80.60.60.60.60.40.40.40.40.20.20.20.20.00.00.00.0双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲试剂/ml/
15、ml/ml/ml4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0 A A A A540540 取两组测定的取两组测定的A A540值的平均值，即值的平均值，即A A540540为纵坐标，蛋为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。19192 2、样品测定、样品测定取取4 4支试管分成两组，按下表平行操作：支试管分成两组，按下表平行操作： 0 0 0 01 1 1 1样品稀释液样品稀释液样品稀释液样品稀释液/ml/ml/ml/ml 0.50.50.50.5蒸馏水蒸馏水
16、蒸馏水蒸馏水/ml/ml/ml/ml1.01.01.01.00.50.50.50.5双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲试剂/ml/ml/ml/ml4.04.04.04.04.04.04.04.0A A A A540540 2020取两组测定的平均值计算：取两组测定的平均值计算：取两组测定的平均值计算：取两组测定的平均值计算：Y Y Y Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（为标准曲线查得蛋白质得浓度（为标准曲线查得蛋白质得浓度（为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/mlmg/mlmg/mlmg/ml）N N N N为稀释倍数为稀释倍数为稀释倍数为稀释倍数c c c c为样品原浓度（为样品原浓度（为样品原
17、浓度（为样品原浓度（mg/mlmg/mlmg/mlmg/ml）。）。）。）。 3、计算、计算2121福林-酚法（双缩脲法的发展）两步反应两步反应(1)(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质白质铜络合物。铜络合物。(2)(2)此络合物将试剂磷钼酸此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸磷钨酸( (olinolin试剂试剂) )还原，混合物深蓝色还原，混合物深蓝色( (磷钼蓝和磷钨蓝混合物磷钼蓝和磷钨蓝混合物) ) 。2222杜马斯法（燃烧法）杜马斯法（燃烧法） 样品在高温下（样品在高温下（样品在高温下（样品在高温下（700-800700-800700-80070
18、0-800）燃烧，释放的氮）燃烧，释放的氮）燃烧，释放的氮）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（气由带热导检测器（气由带热导检测器（气由带热导检测器（TCD)TCD)TCD)TCD)的气相色谱仪测定。测的气相色谱仪测定。测的气相色谱仪测定。测的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。2323几种蛋白质测定方法比较几种蛋白质测定方法比较凯式定氮法凯式定氮法双缩脲双缩脲杜马斯杜马斯福林福林- -酚酚原理原理装置装置溶剂溶剂时间时间灵敏灵敏度度干扰干扰总氮量总氮量蛋白氮蛋白氮总氮量总
19、氮量蛋白氮蛋白氮凯式定氮装置凯式定氮装置分光光度计分光光度计高温装置、高温装置、GCGC分光光度计分光光度计浓硫酸浓硫酸用量较少用量较少不需要不需要福林福林- -酚试剂酚试剂长长简单快速简单快速3min3min简单快速简单快速较低较低较低较低低低低低高高高高高高高高较小较小有干扰有干扰较小较小酸类及柠檬酸类及柠檬酸类酸类2424其他方法其他方法染色法染色法紫外紫外吸收法吸收法水杨酸比色法水杨酸比色法2525 采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算：列记录的数据计算： 水份含量水份含量=8.0%，1 号样品重量号样品重量=1.015g
20、，2号样号样品重量品重量=1.025g，用于滴定的标准，用于滴定的标准HCl浓度浓度=0.1142mol/L，1号样品所用的号样品所用的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=22.0mL，2号样品的号样品的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=22.5mL，空白的空白的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。的氮。 2626第四节第四节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定2727一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法 氨基酸本身有碱性氨基酸本身有碱性-NH-NH2 2基，又有酸性基，又有酸
21、性- -COOHCOOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与与-NH-NH2 2结合，碱性消失，再用强碱来滴定结合，碱性消失，再用强碱来滴定- -COOHCOOH基。基。2828反应式（有几种不同的推论）如下：反应式（有几种不同的推论）如下： 2929双指示剂：百里酚酞双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂中性红指示剂同时取两份样同时取两份样 + +中性红，用中性红，用NaOHNaOH滴定滴定 + +百里酚酞百里酚酞+ +中性甲醛中性甲醛+NaOH+NaOH滴定滴定3030二、非水溶液滴定法二、非水溶液滴定法在水溶液中在水溶液中在水溶液中在水溶液中1 1 1 1、能溶解
22、的物质有限，尤其是有机物质、能溶解的物质有限，尤其是有机物质、能溶解的物质有限，尤其是有机物质、能溶解的物质有限，尤其是有机物质2 2 2 2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄3 3 3 3、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。定。定。定。3131溶剂选择原则溶剂选择原则1 1、不引起副反应、不引起副反应2 2、溶剂应能溶解试样及
23、滴定反应产物、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物3 3、应考虑溶剂的酸碱性、应考虑溶剂的酸碱性 对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好3232氨基酸的非水溶液滴定氨基酸的非水溶液滴定1 1、选择冰乙酸作为溶剂、选择冰乙酸作为溶剂2 2、选择高氯酸进行滴定、选择高氯酸进行滴定3333三、电位滴定法三、电位滴定法 根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，电
24、极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用用NaOH NaOH 标准溶液滴定，根据酸度计指示的标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH pH 值判断和控制滴定的终点。值判断和控制滴定的终点。pH8.29.23434氨基酸自动分析仪法氨基酸自动分析仪法 3535 在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg5mg于于100mL100mL容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL20mL进行测定，用进行测定，用0.05N0.05N氢氧化钠滴定至氢氧化钠滴定至pHpH值为值为8.28.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液7.0mL, 7.0mL, 加入加入10.0mL10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2pH9.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液10.12mL,10.12mL,同法作空白实验，滴定至同法作空白实验，滴定至pHpH值值为为8.28.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液0.08mL, 0.08mL, 加入甲醛后滴定至加入甲醛后滴定至pH9.2pH9.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液0.90ml0.90ml。问该样品的氨基酸态氮含量？。问该样品的氨基酸态氮含量？0.301%你你 算算 对对 了了 吗？吗？3636
