神经解剖学研究方法

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1、神经生物学神经生物学研究技术与方法研究技术与方法, ,教授教授, Ph.D M.D, Ph.D M.D神经解剖学研究方法WhatisNeuroscience?WhatisNeuroscience? Thestudyofthenervoussystemincludingthebrain,thespinalcord,andnetworksofneurons,advancestheunderstandingofhumanthought,emotion,andbehavior. Humanscontainroughly100billionneurons,whichcommunicatewitheach

2、otherbysendingelectricalsignalslongdistancesandthenreleasingneurotransmitterswhichcrosssynapses.神经解剖学研究方法Neurosciencearecognizeddisciplinecharacterizedby: Aunifiedfieldthatintegratesbiology,chemistry,andphysicswithstudiesofstructure,physiology,andbehavior,includinghumanemotionalandcognitivefunctions

3、. Neuroscientistscomefrommanydifferentdisciplinesincludingpsychology,zoology,physics,anthropology,biology,chemistry,physiology,andphilosophy.Adiverseeducationalbackgroundwillprovidethemostimportantskillofall:howtoaskquestions.神经解剖学研究方法NeuroscienceResearchers?NeuroscienceResearchers? Molecularbiologi

4、stsisolateanddescribethegenesthatproducetheproteinsimportanttoneuronfunction. Neuroanatomistsstudythestructureandorganizationofthenervoussystem. Developmentalneuroscientistsstudyhowthebraingrowsandchanges.Theydefinechemicalsandprocessesneuronsusetoseekoutandconnectwithotherneuronsandmaintainconnecti

5、ons. Cognitiveneuroscientistsstudyfunctionssuchasperceptionandmemoryinanimalsbyusingbehavioralmethodsandotherneurosciencetechniques.Inhumans,theyusenon-invasivebrainscans-suchaspositronemissiontomographyandmagneticresonanceimaging-touncoverroutesofneuralprocessingthatoccurduringlanguage,problemsolvi

6、ngandothertasks.神经解剖学研究方法NeuroscienceResearch?NeuroscienceResearch? Behavioralneuroscientistsstudytheprocessesunderlyingbehaviorinhumansandinanimals.Theirtoolsincludemicroelectrodesandbrainscans. Advancedcomputersystemsareenablingneuroscientiststodevisemodelsofneuronsandtheirconnectionsinthebrain-ho

7、whumansperformcomplextasks. Clinicalneuroscientistspsychiatrists,neurologistsandothermedicalspecialistsusebasicresearchfindingstodevelopdiagnosticmethodsandwaystopreventandtreatneurologicaldisordersthataffectmillionsofpeople.神经解剖学研究方法Neuroscientistsworkto:Describethehumanbrainandhowitfunctionsnormal

8、ly.(现象)Determinehowthenervoussystemdevelops,maturesandmaintainsitselfthroughlife（本质）.Findwaystopreventorcuremanydevastatingneurologicalandpsychiatricdisorders（干预）.神经解剖学研究方法ChallengesfortheFutureChallengesfortheFuture（in2005in2005） WhatarethemethodsforearlydetectionofneurologicaldisorderssuchasParkin

9、sonsdiseaseandAlzheimersdiseaseandformentaldisorderssuchasschizophreniaanddepression?Whatarethecausesoftheseillnesses?Whatarethecures?Howcanwehelpnervesregenerate?Canwecurespinalcordinjuries?Canwetransplantorreplacepartsofthebrain?Whatcauseschronicpain?Whatisthebestwaytotreatpain?Howcanwetapintooure

10、ndogenouspaininhibitorysystem?Whatarethemechanismsofaddiction?Aretherebetterwaystotreataddictions?Howarememoriesformed,storedandlost?Whatarebetterwaystoimagethelivingbrain?神经解剖学研究方法ChallengesfortheFutureWhatistheneurologicalbasisofemotionssuchasanger,happinessandsadness?Whatarethedifferencesinthebra

11、insofmenandwomenandwhatdothesedifferencesmean?Howdoesexperienceandlearningaffectthebrainandhowcanweusethisinformationtoimproveourdailylives?Whataretheneurologicalmechanismsofalternativemedicinetreatmentssuchasacupuncture,herbaltherapyandhypnosisandhowcanthesemethodsbeusedtotreatnervoussystemdisorder

12、s?Whydowesleepandhowcanweshiftourinternalbodyclocks?Whatisconsciousness?神经解剖学研究方法21世纪神经生物学可望取得突破性进展的5个新领域神经解剖学研究方法脑动态神经元功能成像研究脑动态神经元功能成像研究 如果能动态显示在不同脑功能状态下每个神经元的兴奋过程，相当于将脑功能成像与无创性单神经元记录相结合，则对人脑功能活动的认识将更加深入。 目前脑的功能成像的空间分辨率为毫米级，时间分辨率为秒级，远远不能满足脑功能研究的需要。神经元胞体的大小约为20一40微米如果CT的空间分辨率再提高至l0微米的近微米数量级，就可以“看见”

13、单个的神经元。目前工业CT已能达到10微米的分辨率。由于采用电子束扫描技术代替机械扫描，在时间分辨率方面已由每帧1OO秒提高到50ms/帧达到近毫秒级水平。 如果医学CT能采用工业CT的一系列先进技术如CCD集成电路检测技术，双能电子束扫描技术等，有可能将空间和时间分辩率再提高一个数量级达到微米和的ms/帧水平（动态显微CT)。神经解剖学研究方法 已经知道，胞外钙离子浓度为10-4mo1/L而胞内钙离子浓度为10-2molL，二者相差100倍，当神经元兴奋时，钙离子通道开放，胞内钙在短暂的数百微秒之内可增高达1000倍左右，但由于钙泵前作用胞内钙离子浓度很快即恢复至正常水平。所以用动态的(ms

14、/帧)和显微(微米)CT，再结台双能x线束来检测胞内钙离子浓度的瞬态上升就可以观测脑在不同功能状态下单个神经元的兴奋过程这样即可以研究在不同外界输入状态下脑内神经元活动的内在模式，以及在思考、记忆、学习时神经元活动的动态时空编码由此提供的大量数据再用电子计算机进行分析处理将对脑功能的研究更加深人。神经解剖学研究方法神经解剖学研究方法神经系统多基因病的定位及老年性痴呆发神经系统多基因病的定位及老年性痴呆发病机理的阐明病机理的阐明随着人口的老龄化老年性痴呆的发病率逐年上升，老年性痴呆已成为21世纪的社会问题。已经知道，老年痴呆是一个多基因的疾病其发病机理至今尚未彻底明了一预期在21世纪这一问题将最

15、终得到解决。神经解剖学研究方法神经系统信息的编码研究神经系统信息的编码研究 20世纪Adrian研究各种刺激对感受器及单根神经纤维放电的影响，发现脉冲放电频率的对数与刺激量成正比Freeman在嗅球研究嗅觉的混沌吸引子编码，Singh在视觉皮层发现40赫兹的同步放电等。 神经系统信息编码可分为快速的神经元状态编码和缓慢的突触联系强度编码两大类。神经元的兴奋与静息两种基本状态。可分别以1和0加以编码，具有N个神经元的神经网络共有N种不同状态，组成N维编码空间。不同的外界输人组成在N维状态空间中的一组编码链。 神经元状态编码方式决定外界输人在脑内的内部映象。与脑内信息的传输与加工关系密切。而突触联

16、系强度编码是可塑的。包括新的突触形成与原有突触联结消失，以及原有突触联系强度的增强与消退等两个过程。突触联系强度编码是连续的、分域的，它和脑的学习与信息存储功能密切相关。神经解剖学研究方法后基因组时代的神经生物学后基因组时代的神经生物学 后基因组时代有两个主要的研究方向： 一是从基因结构与定位转向对基因的功能及其调控机理的研究； 二是研究各种生物活性蛋白分子的空间构象与其生物学功能的关系。分子神经生物学将从后基因组分子生物学中得到启发和促进进一步对神经系统的生长、发育再生、凋亡、学习、记忆、思维、注意等脑功能基因的调控规律及相关的蛋白质活性分子的空间构象及功能进行系列的研究神经解剖学研究方法意

17、识、思维、情绪本质的探讨意识、思维、情绪本质的探讨 意识、思维和情绪的功能活动固然是建立在脑区、神经元和分子活动水平的基础之上，但更主要的是用系统论的方法，把脑的各个层次的功能活动整合起来加以研究，才能最终解决意识，思维与情绪活动之谜。在21世纪，这方面可能继续取得更大的进展。神经解剖学研究方法2016年年Science杂志评选杂志评选“人类突破了十大人类突破了十大前沿科技前沿科技” 脑和认知方面，脑图谱绘制、认知计算、脑控等技术取得实质性进展，为人类认知能力的增强，以及脑科学的军事应用奠定了重要基础。 1.美国艾伦脑科学研究院绘出了迄今最完整的数字版人脑结构图谱，也是迄今最清晰脑部微观解剖学

18、结构图谱，将成为大脑研究人员的最新指南和“导航图”，标志着在理解人脑方面的巨大飞跃； 2.美国加州大学伯克利分校绘制出人类大脑中语义信息功能呈现的图谱，可揭示语言的神经生物学机理； 3.美国华盛顿大学的研究小组绘制出迄今最全面、最精确的人类大脑图谱，其中97个人类大脑皮层区域属于首次公布。 4.美国国家卫生研究院的研究项目团队开发出一种新的神经成像技术，可看到人脑中基因开关的位置，为了解影响精神健康的基因提供了有力工具。神经解剖学研究方法 5.DARPA首次成功在动物受试者上测试了一种通过血管进入脑部，记录神经活动的微型传感器。 6.美国劳伦斯利弗莫尔国家实验室和IBM公司联合公布了以“真北”

19、仿脑处理器芯片为基础的具有认知能力的深度学习超级计算机，标志着人类进入认知计算的新时代，深度学习超级计算机对于网络安全、核武器模拟等具有重大意义。7.韩国科学家在一块10厘米的晶圆上，构建了144个突触晶体管，研制出迄今为止能耗最低的人造突触，这一突破有望使研制大型类脑计算机成为现实。8.美国科学家研制出了一种新型“扩散式忆阻器”，能逼真地模拟人脑突触内钙离子的行为，新设备有助于开发类脑（神经形态）计算机。2016年年Science杂志评选杂志评选“人类突破了十大人类突破了十大前沿科技前沿科技”神经解剖学研究方法相关网络信息 神经科学研究的国内外组织 神经科学相关的科学期刊 神经科学相关的著名

20、的国际研究机构神经解剖学研究方法神经解剖学和神经生物学的研究方法神经解剖学研究方法一、一、 神经结构的经典研究方法神经结构的经典研究方法 1. 1. 大体解剖的研究方法大体解剖的研究方法 固定和非固定脑和脊髓的移取和保存观察外部形态神经解剖学研究方法一、一、 神经结构的经典研究方法神经结构的经典研究方法 1. 1. 大体解剖的研究方法大体解剖的研究方法脑膜和脑血管标本的制作，脑血管的显示：固定颈内动脉灌注红色充填剂浸泡70%甘油透明显示神经解剖学研究方法一、一、 神经结构的经典研究方法神经结构的经典研究方法 1. 1. 大体解剖的研究方法大体解剖的研究方法脑的解剖剥离标本：显示脑白质和基底核神

21、经解剖学研究方法2. 2. 脑厚片（脑厚片（0.5-1.0cm0.5-1.0cm）染色技术）染色技术 利用脑灰质和白质所含髓磷脂的量不同，用水溶剂染料使灰利用脑灰质和白质所含髓磷脂的量不同，用水溶剂染料使灰质着色，用脂溶性染料使白质着色的方法。质着色，用脂溶性染料使白质着色的方法。一、一、 神经结构的经典研究方法神经结构的经典研究方法24神经解剖学研究方法3. 3. 脑和脊髓的常用切面脑和脊髓的常用切面正中矢状切面，水平切面正中矢状切面，水平切面一、一、 神经结构的经典研究方法神经结构的经典研究方法25神经解剖学研究方法3. 3. 脑和脊髓的常用切面脑和脊髓的常用切面冠状切面冠状切面神经解剖学

22、研究方法大白鼠实验头位大白鼠实验头位按照不同的定位图进行大白鼠脑实验时, 必须采取和定位图相应的头位。大白鼠的实验头位有多种（在定位仪上）：用耳杆固定大白鼠的外耳道后, 调节切牙棒的高度使前囟高于人字缝尖1毫米。调节切牙棒使其上缘高于耳间线5毫米调节切牙棒使耳间线中点至切牙棒前上缘的垂线与仪器水平面成5度的交角确定大白鼠的实验头位是依据脑的冠状平面应与神经轴相垂直。中脑与间脑的分界面通过后连合后缘和脚间窝前缘, 大体上垂直于神经轴, 把它作为鼠脑的冠状基平面图, 当此平面与水平面垂直时,鼠头的位置即是规定的实验头位。 对体重为150克雌鼠的实验头一位进行了测定, 测出耳间线比切牙棒上缘高2.4

23、毫米, 耳间线中点到切牙棒前上缘的垂线与水平面成5度的交角。神经解剖学研究方法脑立体定位仪脑立体定位仪神经解剖学研究方法CaudatenucleusCaudatenucleusPutamenPutamenGlobuspallidusGlobuspallidus神经解剖学研究方法3.3.组织学的研究方法组织学的研究方法 光学显微镜显微结构（微米m） 普通，倒置，相差，暗视野，荧光，偏关 电子显微镜超微结构（纳米nm和埃A） 扫描，透射，共聚焦，双光子 活体成像显微技术，等等神经解剖学研究方法组织学的研究方法组织学的研究方法 固定组织的标本制作方法固定组织的标本制作方法 固定和固定液：甲醛、戊二醛

24、，等 涂片和切片： 石蜡（5-10m） 冰冻（15-40m） 恒冷箱（5-25m）,冷冻干燥真空包埋 振动（30-100m） 超薄（nm） 染色、显色和拍照：细胞成分与酸性或者碱性染料的理化反应。神经解剖学研究方法Hematoxylin-EosinHematoxylin-Eosin（HEHE）stainstain苏木精（H）：阳离子染料，将细胞核内的是碱性物质染成蓝色伊红（E）：阴离子染料，将细胞质和胶原原纤维染成粉红色4.4.神经解剖学的传统染色方法神经解剖学的传统染色方法神经解剖学研究方法（2 2）GolgiGolgi（银浸染）法（银浸染）法(Golgistain)(Golgistain)

25、能在大量神经细胞中镀染出少数神经元的全貌。神经解剖学研究方法十九、二十世纪神经系统十九、二十世纪神经系统构造的网状学说构造的网状学说 神经解剖学研究方法（3 3）CajalstainCajalstain 显示神经元内的神经原纤维neurofibrillary及轴突末梢神经解剖学研究方法神经元学说神经元学说神经细胞是一个独立的生物学单位（神经元），神经元间的联系不是通过细胞的连续，而是通过彼此的接触来完成的。并描述了神经元的树突及轴突，提出树突是接受区，神经元极性的概念。神经解剖学研究方法 Electron microscope (1950s)：TEM，SEM神经解剖学研究方法证实神经元学说的证

26、据神经解剖学研究方法（4）Nisslstain尼氏染色(1892)染神经组织内的核酸RNAandDNA，神经元核仁含丰富的RNA和一层DNA外壳，核中染色质少。胞浆内含大量的RNA，以尼氏体的型式存在，胶质细胞核质深染但胞浆内无尼氏体。 神经解剖学研究方法（5 5）WeigertWeigert法法(1884)(1884)：染髓鞘，而不能用于研究薄髓和无髓纤维（6）Luxol坚牢蓝：属于铜-酞菁染料，在酒精溶液内具有与髓鞘磷脂结合的染色特性。神经解剖学研究方法 （7）Marchi(1890):用四氧化锇染变性的髓鞘 （8）Nauta法:将变性神经原纤维染成黑色，抑制正常神经元纤维的着色（顺行追踪

27、法）神经解剖学研究方法年龄及病理变化神经解剖学研究方法二、近代追踪神经通路的研究方法 辣根过氧化物酶法辣根过氧化物酶法 （Horseradish perosidase HRP method） 运输速度：逆行50-80mm/d， 顺行50-500mm/d神经解剖学研究方法神经元的胞浆转运神经元的胞浆转运 axonal transplantaxonal transplant 神经元胞体中合成的结构和功能物质以及有形成分在胞体和外周突起之间，或神经元与周围微环境之间的往返转运。维持神经元的正常结构，为神经的生长发育、新陈代谢提供物质基础；作为神经系统中分子信息传递的重要部分，与神经冲动的电信息相互整

28、和，实现对神经元的调控. 分类： 顺行轴浆快转运：小泡、线粒体、SER 顺行轴浆慢转运：骨架蛋白 0.28mm/d 逆行轴浆转运：内质网、溶酶体、线粒体、内质体、大致密芯泡 神经解剖学研究方法二、近代追踪神经通路的研究方法二、近代追踪神经通路的研究方法 放射自显影神经顺行追踪 2-脱氧葡萄糖（2-DG），神经组织局部代谢 PHA-L顺行轴突追踪法 生物胞素和神经生物素 生物素化葡聚糖（Biotinylated Dextran amine, BDA） 霍乱毒素荧光色素标记神经束路化学损毁免疫电镜酶或者分子标记结合影像技术（CT, MRI, PET）神经解剖学研究方法荧光追踪剂及其追踪法神经解剖学

29、研究方法逆行或双向追踪法逆行或双向追踪法 HRP 植物凝集素（PHA） 毒素(CT,HSCPrV) 生物素或生物素化的葡聚糖（BDA） 荧光色素单标，双标，等 2-DG法神经解剖学研究方法PatchandFITC神经解剖学研究方法神经解剖学研究方法Confocal electron microscope(1993) neuron structures alive神经解剖学研究方法化学损伤技术 轴突切断 单胺能和胆碱能毒剂神经解剖学研究方法脑功能成像技术脑功能成像技术1973年，Hounsfield用电子计算机断层成像技术首次在活体条件下现察到人脑的内部结构。其后MRI，fMRI，PET，SPE

30、CT等脑的结构及功能成像技术得到迅速的发展。Phelps建立的PET成像技术能在正常条件下显示出人脑在不同功能活动状态时脑内各种活性物质(氧、葡萄糖等)的代谢变化过程，是脑功能定位成像的重大突破它为研究人的心理及智能活动奠定基础.神经解剖学研究方法神经解剖学研究方法三、化学神经解剖学的研究方法三、化学神经解剖学的研究方法针对神经递质或调质、受体和离子通道、信号蛋白的研究方法 1. 所有分子生物学用于检测基因的研究方法 2. 基于抗原抗体的反应的功能蛋白定位检测方法 流式细胞仪 配体标记法 Western-blotting 免疫组织化学染色法 原位杂交组织化学法 3.基于神经递质的酶活性的组织化

31、学反应检测方法神经解剖学研究方法突突触触1概念是神经元之间或神经元和非神经元之间连接的特化结构，有传递信息和分析整合的作用。神经解剖学研究方法22化学突触的结构化学突触的结构突触间隙：介于突触前后膜之间；突触前成分：包括突触前膨大和突触前膜， 内含突触小泡和线粒体；突触后成分：含神经递质的受体，其胞质面有致密物质附着。神经解剖学研究方法免疫细胞化学 免疫荧光细胞化学 免疫酶法（PAP） ABC免疫组织化学中的交叉反应免疫组织化学染色的对照试验阳性对照阴性对照自身对照吸收试验神经解剖学研究方法神经解剖学研究方法四、光学探针、数字荧光图像仪和形态定量法四、光学探针、数字荧光图像仪和形态定量法 钙的

32、荧光探针 乙酰胆碱酯酶组化染色（AChE） 单胺的荧光组织化学(FA) 显微分光光度计 显微荧光光度计 图像分析 形态定量研究方法神经解剖学研究方法五、神经组织和神经细胞培养五、神经组织和神经细胞培养神经解剖学研究方法 Neural cells are not directly derived from ES cells. Mature cells of the nervous system come from a variety of cells lineages and progenitors that differentiate into specific cell types. Dif

33、ferent lineages are also known to support the differentiation of other cell lineages. 神经细胞谱系lineages形成神经解剖学研究方法基质诱导诱导物质诱导物质 细胞外基质：胶原，细胞外基质：胶原，糖胺多糖和蛋白多糖糖胺多糖和蛋白多糖 诱导组织：诱导组织：actin,actin,noggin,follistainnoggin,follistain等等 细胞粘着分子细胞粘着分子 ：CAMsCAMs神经解剖学研究方法Zhao,S.etal.Development2004;131:5117-5125Zhao,S.etal.Development2004;131:5117-5125Co-cultivationofreeler(rl-/-)dentategyruswithwildtyperescuesradialfiberorientationandneuronalCo-cultivationofreeler(rl-/-)dentategyruswithwildtyperescuesradialfiberorientationandneuronallaminationlamination神经解剖学研究方法神经解剖学研究方法