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1、深低温保存技术在生殖医学中深低温保存技术在生殖医学中的应用的应用青岛大学医学院附属医院低温医学科王沛涛概述生殖医学：上世纪70年代末第1例试管婴儿的诞生；现在，临床已经可以开展诸如单精子注射（ICSI）、植入前诊断（PGD）等辅助生殖技术（ART）。与低温生物学的交叉：精子深低温保存；目前，已经扩展到更广泛的领域，如卵子（未成熟卵子及M期卵子）、卵巢组织、胚胎和睾丸组织等的保存。两学科相互促进： 卵子保存； 卵巢组织保存一、生殖细胞保存一、生殖细胞保存1卵子保存卵子保存重要意义 治疗前肿瘤女病人卵子保存 超促排卵周期中多余卵子的保存 供体卵子库保存方法 玻璃化 程控降温冷冻冷冻对卵子造成的危害
2、主要表现在： (1) 纺锤体损伤与染色体及DNA畸形。 (2) 细胞骨架结构破坏。冷冻剂保护剂和冷冻过程均可。二甲基亚砜(DMSO)对细胞骨架的损伤特别明显。 (3) 皮质颗粒提前释放与透明带变硬，降低受精率。 (4) 其他方面：膜的完整性、细胞代谢、细胞对损伤的控制和修复能力。卵子细胞模式图卵子细胞模式图减数分裂（成熟分裂）减数分裂（成熟分裂）减数分裂（成熟分裂）减数分裂（成熟分裂）：双倍体、前期、中期、后双倍体、前期、中期、后期、末期期、末期2精子精子低温生物学与生殖医学（包括动物生殖）最为成功学科结合就是精子的深低温保存技术建立和应用。自上世纪中期广泛开展以来，带来了巨大的经济和社会效益
3、。同时，深低温保存技术和精子库的建立为整个生殖医学科学的发展发挥了巨大推动作用。国内外都已经建立的许多临床应用的供精精子库。最奇迹的生育http:/ 7月月1818日报道，英国德比郡伯日报道，英国德比郡伯顿市顿市3737岁男子约翰岁男子约翰 罗兰罗兰德在德在1414岁时被诊断出患有岁时被诊断出患有睾丸癌，睾丸癌，19881988年，年，1515岁的岁的他在接受化疗手术前冷冻他在接受化疗手术前冷冻了自己的部分精子。了自己的部分精子。 20092009年年7 7月，约翰和月，约翰和2929岁女岁女友贝吉结婚后，他用冷冻友贝吉结婚后，他用冷冻精子和贝吉的卵子接受精子和贝吉的卵子接受“试管受精试管受精
4、”手术，令贝吉手术，令贝吉成功怀上身孕。贝吉于成功怀上身孕。贝吉于4 4个个星期前生下了一名健康男星期前生下了一名健康男婴。婴。精子保存主要应用于精子保存主要应用于 供精精子库：男性无精子症的治疗（供精精子库：男性无精子症的治疗（AIDAID）。）。无精子症的概念包括精液无精子、附睾无精子和无精子症的概念包括精液无精子、附睾无精子和睾丸无精子。目前国内开展睾丸无精子。目前国内开展AIDAID治疗的适应症是睾治疗的适应症是睾丸无精子症！即使睾丸仅有丸无精子症！即使睾丸仅有“ “生精细胞生精细胞” ”，也有，也有理论上的自我生育能力，因此，对于此类不育症理论上的自我生育能力，因此，对于此类不育症仍
5、建议首先考虑仍建议首先考虑ICSIICSI技术！技术！ 自体精子保存：自体精子保存：“ “男性生殖保险男性生殖保险” ”。包括肿瘤。包括肿瘤放化疗前、从事生殖风险职业、任何其他原因需放化疗前、从事生殖风险职业、任何其他原因需要保存自体精子者。供未来自己配偶生育之需，要保存自体精子者。供未来自己配偶生育之需，如可进行人工受精（如可进行人工受精（AIHAIH）、）、IVF-ETIVF-ET和和ICSIICSI等。等。一个精子怎样实现生育愿望（ICSI）二、性腺组织及其细胞保存二、性腺组织及其细胞保存1. 卵巢组织保存卵巢组织保存保存目的：内分泌功能、生殖功能结构复杂性：细胞类型、体积、血液循环、神
6、经支配等功能复杂性：多细胞协作完成、多器官相互作用因此：目前为止，低温保存整个生殖器官仅在啮齿类动物模型得到了验证。所以：保存卵巢组织。组织与胚胎学组织与胚胎学2. 未成熟卵泡保存未成熟卵泡保存针对成熟卵细胞及卵巢组织深低温保存技术中瓶颈问题，研究人员尝试未成熟卵的深低温保存技术研究。未成熟卵泡：细胞所处的分裂周期与成熟卵子不同，相对稳定，对各种冲击的抵抗能力较高，包括对深低温保存中冰晶形成和低温保护剂毒性的耐受能力。技术难题：未成熟卵的体外培养成熟技术仍未有突破。2睾丸组织及精原细胞保存睾丸组织及精原细胞保存睾丸组织保存的目的，主要是保存精原细胞。目前，除了在小鼠已经产生出后代，其他物种中还
7、没有获得移植生育后代成功的报道。体外培养精原细胞产生精子是一个非常好的选择，但目前的有关细胞生物学方法的建立短期内尚无可能。适应症：适应症： 准备接受放化疗的患恶性病的青春期前男孩。准备接受放化疗的患恶性病的青春期前男孩。 特别是那些接受骨髓移植的患儿，移植前准备中特别是那些接受骨髓移植的患儿，移植前准备中对生精细胞的摧毁几乎是不可复性的，即使对化对生精细胞的摧毁几乎是不可复性的，即使对化疗药物不敏感的间质细胞（疗药物不敏感的间质细胞（LeydigLeydig cells cells）也通常）也通常难以幸免。青春期后的这类疾病患者通常可以采难以幸免。青春期后的这类疾病患者通常可以采取精液深低温
8、保存，可以解决其日后的生育问题。取精液深低温保存，可以解决其日后的生育问题。 接受睾丸穿刺活检检查术的男性不育患者。接受睾丸穿刺活检检查术的男性不育患者。临床治疗中：一般要求在给病人进行睾丸穿刺活临床治疗中：一般要求在给病人进行睾丸穿刺活检的同时，进行睾丸组织的深低温保存工作。检的同时，进行睾丸组织的深低温保存工作。冷冻保存方法：冷冻保存方法： 首先制备细胞悬液（其中含有首先制备细胞悬液（其中含有各级生精细胞及精子），然后直接进行悬液的冷各级生精细胞及精子），然后直接进行悬液的冷冻。冻。 采取适宜的方案进行组织块冷冻是另一个采取适宜的方案进行组织块冷冻是另一个选择。选择。应用：应用： 移植时，
9、最好将细胞从输精管注射入小移植时，最好将细胞从输精管注射入小管内，其他细胞，包括间质细胞等注射入胞间隙管内，其他细胞，包括间质细胞等注射入胞间隙内。内。 查找精子细胞或精子，进行查找精子细胞或精子，进行ICSI.ICSI.3性腺组织保存的前景性腺组织保存的前景前景：良好！极大的社会需求；技术：有待突破！实际应用：试验阶段，充分告知！希望： 相关技术（如：未成熟卵体外培养技术）； 组织移植技术（如：性腺易位移植）； 保存技术：玻璃化。三、三、 受精卵与胚胎的保存受精卵与胚胎的保存胚胎的特性：与卵子细胞在结构和功能特征上明显不同；且每个胚胎细胞数多（2，4，8，16）。冷冻保存效果：存活率比较满意
10、，慢速程序降温冷冻方案即可获得满意复温后存活率和发育率临床应用情况：已经得到生殖医学医师的认同与推广应用，已经成为各生殖中心的常规技术之一。 ARTART剩余胚胎冷冻：通过超促排卵后获得数个，剩余胚胎冷冻：通过超促排卵后获得数个，甚至十数个或更多的成熟卵子后，经甚至十数个或更多的成熟卵子后，经IVF-ETICSIIVF-ETICSI后可以获得多个发育良好的受精卵或胚胎，按照后可以获得多个发育良好的受精卵或胚胎，按照卫生管理部门有关卫生管理部门有关ARTART技术应用的要求，一次移技术应用的要求，一次移植胚胎不能超过植胚胎不能超过3 3个。然后，将剩余的胚胎通过深个。然后，将剩余的胚胎通过深低温
11、技术保存起来。低温技术保存起来。如果，移植胚胎后病人不能顺利妊娠和生育，则如果，移植胚胎后病人不能顺利妊娠和生育，则可在病人之后的治疗周期中，直接复温保存的受可在病人之后的治疗周期中，直接复温保存的受精卵或胚胎，进行移植即可。精卵或胚胎，进行移植即可。好处：省事、省钱、降低风险！好处：省事、省钱、降低风险！依次为：受精卵、依次为：受精卵、依次为：受精卵、依次为：受精卵、2 2 2 2细胞、细胞、细胞、细胞、4 4 4 4细胞、细胞、细胞、细胞、8 8 8 8细胞、细胞、细胞、细胞、16161616细胞和桑椹胚。细胞和桑椹胚。细胞和桑椹胚。细胞和桑椹胚。ivf- 生殖保险的伦理病人方面：“一子多
12、父”、“一子多母”。医疗结构：职业道德与操守社会责任法律责任。医疗管理与监管部门：制定相关法律或条例，或管理规定文件督查医疗卫生机构相关工作建立行业规定，自我约束机制！四、技术研究与应用展望四、技术研究与应用展望技术研究：技术研究： 低温保存技术：保护剂、冷冻方法、复温技低温保存技术：保护剂、冷冻方法、复温技术术 细胞生物学技术：干细胞技术、体外培养方细胞生物学技术：干细胞技术、体外培养方法、克隆技术法、克隆技术 组织器官移植学。组织器官移植学。技术应用技术应用 单身女性。生育有要求！单身女性。生育有要求！ 青春期前儿童。进展性疾病！青春期前儿童。进展性疾病！ 肿瘤患者。发病率高！肿瘤患者。发
13、病率高！小结小结精子冷冻保存精子冷冻保存精子冷冻保存精子冷冻保存：胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存： 方法、数量、质量等方法、数量、质量等受一定限制！受一定限制！成熟卵子保存成熟卵子保存成熟卵子保存成熟卵子保存： 方法？低温冷冻损伤？！方法？低温冷冻损伤？！未成熟卵子保存未成熟卵子保存未成熟卵子保存未成熟卵子保存： 体外成熟技术的体外成熟技术的成熟！成熟！生殖腺组织保存：生殖腺组织保存：生殖腺组织保存：生殖腺组织保存：冻保存技术有待突破、冻保存技术有待突破、移植技术有待观察移植技术有待观察媒体报道英国科学家首次利用人体干细胞造出英国科学家首次利用人体干细胞造出人造精子人造精子干细胞研究及进展干细胞研究及进展干细胞研究及进展干细胞研究及进展(Stem Cells and Development)(Stem Cells and Development)(Stem Cells and Development)(Stem Cells and Development) Thank you!
