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1、CYP2C19基因多态性与丙基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性研究戊酸血药浓度相关性研究 答 辩 人：罗 静指导教师：童卫杭 主管药师厦门大学医学院本科毕业论文厦门大学医学院本科毕业论文主要内容主要内容研究背景研究背景1实验方法实验方法2实验结果实验结果3分析讨论分析讨论4第一部分第一部分 研究背景研究背景药物耐受及药物耐受及低药效低药效毒副作用及毒副作用及不良反应不良反应AEDsAEDs需合需合理的临床理的临床个体化用个体化用药药传统的传统的“标准化用药标准化用药”癫痫癫痫癫痫癫痫第二大神经系统顽症第二大神经系统顽症第二大神经系统顽症第二大神经系统顽症一线抗癫一线抗癫痫药痫药（AEDsAEDs
2、）体内代谢体内代谢个体差异个体差异大大丙戊酸钠（丙戊酸钠（Sodium Sodium ValproateValproate, VPA, VPA）一线抗癫痫药，目前仍无法取代一线抗癫痫药，目前仍无法取代可用于多种类型的癫痫发作可用于多种类型的癫痫发作图1.丙戊酸分子结构Fig.1 molecular structure of valproic acid相线粒体内相线粒体内-氧化氧化 相尿苷酸二磷酸相尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶葡萄糖醛酸酶(UGT)的酸化的酸化 细胞色素细胞色素P450P450酶酶(CYP450)(CYP450)的代谢的代谢 未发现相关酶未发现相关酶的基因多态性的基因多态性UGTUG
3、T酶基因的酶基因的突变位点及突突变位点及突变频率未知变频率未知CYP2C19CYP2C19中国人群中国人群突变率较高，突变突变率较高，突变位点研究成熟位点研究成熟药代药代动力动力学学（PKPK）复）复杂，杂，个体个体差异差异大大体内体内代谢代谢途径途径相关酶的相关酶的基因多基因多态性态性研究研究CYP2C19CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值CYP2C19CYP2C19最主要的两个突变位点最主要的两个突变位点 CYP2C19*2: CYP2C19*2:第第5 5外显子外显子681681位位 GAGA CYP2C19*3
4、: CYP2C19*3:第第4 4外显子外显子636636位位 GAGA 基因型鉴定：聚合酶链反应基因型鉴定：聚合酶链反应- -限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性分析（分析（PCR-RFLPPCR-RFLP） PCRPCR：模拟体内：模拟体内DNADNA复制条件，体外酶促合成特异复制条件，体外酶促合成特异DNADNA片段的循环反片段的循环反应，以应，以扩增目的扩增目的DNADNA。 RFLP RFLP：某种限制性内切酶：某种限制性内切酶特异性识别特异性识别位点，对位点，对DNADNA切割；切割； 基因突变时特异性酶切位点基因突变时特异性酶切位点消失消失，不被限制性内切酶切断；，不被限制性
5、内切酶切断； 利用利用电泳检测电泳检测，观察条带分析基因型。，观察条带分析基因型。 PCR-RFLPPCR-RFLP特点：特点：操作简便，耗时耗费低操作简便，耗时耗费低 本实验中将采用准确度受公认的本实验中将采用准确度受公认的基因测序法验证基因测序法验证该法的该法的准确性准确性产生终止密码，过早终止蛋白合产生终止密码，过早终止蛋白合成，产生无活性成，产生无活性CYP2C19CYP2C19酶，降酶，降低对丙戊酸代谢低对丙戊酸代谢第二部分第二部分 实验方法实验方法一、数据收集一、数据收集2008年9月至2009年4月第二炮兵总医院神经内科、神经外科门诊及住院部服用丙戊酸钠的癫痫患者49例筛选资料齐
6、全的30例记录性别、年龄、体重、治疗药物、治疗剂量、治疗药物血药浓度、合并用药等情况。 二、二、血药浓度检测血药浓度检测荧光偏振免疫法（荧光偏振免疫法（FIPFIP） 美国Abbott公司TDxFLx荧光偏振免疫测定仪及配套试剂盒服用丙戊酸至少5个半衰期（2-2.5天）后，血药浓度达稳态时，于下次服药前，采抗凝静脉血4ml。离心，取上清液（血浆）100l，进样测定。三、基因型鉴定三、基因型鉴定1 1、提取、提取DNA:DNA: 北京QIAGEN公司血液基因组提取试剂盒提取所收集血样DNA 北京六一仪器厂DYY-II2型电泳仪和电泳槽DNA样品电泳检测紫外灯下判读结果，照相存档2 2、聚合酶链反
7、应、聚合酶链反应- -限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（PCR-RFLPPCR-RFLP）2.1 PCR2.1 PCR反应反应 德国Eppendof公司PCR扩增仪设计并合成CYP2C19引物： CYP2C19*2:前引物F 5-AGCAGGTATAAGTCTAGGAAA-3 后引物R 5-ACAAATACGCAAGCAGTC-3 CYP2C19*3:前引物F 5-ACTTTCATCCTGGGCTGTGC-3 后引物R 5ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3 建立反应体系： 蒸馏水9 l 前引物0.5 l，后引物0.5 l HotStar Taq Master Mix 12.
8、5 l（包含4种dNTP，Mg2+，Taq DNA聚合酶，以及TrisCl-KCl缓冲液） DNA 模板2.5 lPCR反应条件： CYP2C19*2：94预变性15min94变性40s51退火30s72延伸30s 循环35次，最后72延伸10min。产物长度458bp CYP2C19*3：94预变性15min94变性30s56退火30s72延伸30s循环35次，最后72延伸10min。产物长度233bp。PCR产物电泳检测 紫外灯下判读结果，目的条带清晰且无非特异扩增者进行下一步实验 照相存档2.2 2.2 限制性长度多态性（限制性长度多态性（RFLPRFLP） 美国New England
9、Biolabs公司内切酶SmaI 、 BamHI酶切反应： CYP2C19*2：用限制型内切酶SmaI30消化3h。SmaI酶切条件：PCR反应产物10ul；水16ul；10Buffer 2ul；SmaI 2ul。 CYP2C19*3：用限制型内切酶BamHI37消化3h。BamHI酶切条件：PCR反应产物10ul；水18ul；10Buffer BamHI 2ul；BamHI 1ul。酶切产物电泳检测 紫外灯下判读结果，通过条带数目及位置，判断基因型 照相存档3 3、基因测序、基因测序 取前引物6l，与PCR产物同时送于测序公司分析基因序列 四、数据分析四、数据分析Spss 12.0 stan
10、dard version(Spss Inc.)用双侧t检验和2检验。P0.05为差异有统计学意义 第三部分第三部分 实验结果实验结果一、病人一般情况和治疗情况一、病人一般情况和治疗情况男20例，女10例，男女比例2:1平均年龄33.624.60岁，平均体重56.1518.50kg丙戊酸钠体重剂量范围2.3-27.7mg/kgd,平均值为11.74mg6.10/kgd血药浓度范围7.97-89.96g/ml,平均值为44.5927.60g/ml二、血药浓度监测情况二、血药浓度监测情况测定血药浓度样品150例次血药浓度有效范围：40-100g/ml低于有效浓度低限共65例次超过有效浓度高限共2例次
11、三、全血基因组三、全血基因组DNADNA提取与提取与PCRPCR扩增产物扩增产物1 1、琼脂糖凝胶电泳显示，提取的基因组、琼脂糖凝胶电泳显示，提取的基因组DNADNA条带结果条带结果2000bp目的条带Marker图2.琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNAFig 2. Apparent DNA ladder shown by agarose gel electrophoresis2 2、CYP2C19*2CYP2C19*2、CYP2C19*3 PCRCYP2C19*3 PCR扩增结果扩增结果 CYP2C19*2 PCR产物长度458bp500bp458bp目的条带Marker图3.琼脂糖凝胶电
12、泳检测CYP2C19*2PCR产物Fig3. PCR amplification of CYP2C19*2 shown by agarose gel electrophoresis CYP2C19*3 PCR产物长度233bp250bp233bpMarker目的条带图4.琼脂糖凝胶电泳检测CYP2C19*3PCR产物Fig4.PCR amplification of CYP2C19*3 shown by agarose gel electrophresis 目的条带清晰，无非特异性扩增条带，说明PCR扩增较为理想，符合研究要求。四、基因型判定四、基因型判定1 1、限制性片段长度多态性法、限制性
13、片段长度多态性法CYP2C19*2突变位点：681GA 当等位基因为681G时，SmaI酶将片断切开成为272bp和186bp两条片断 当等位基因为681A时，酶切位点消失，片段不被切开据此分析酶切结果，判断基因型，见图5： GG基因型，也称野生型-272、186bp两条片断 GA基因型，也称突变杂合子-458、272、186bp三条片断 AA基因型，也称突变纯合子-458bp一条片断 500bpAA型AG型GG型458bp 272bp186bpMarker图5.CYP2C19*2分型Fig5.Genotype of CYP2C19*2（AA为突变纯合型，GG为野生型，AG为突变杂合型）(AA
14、 homozygous type, GG wild type, AG heterozygous type)CYP2C19*3突变位点：636GA 当等位基因为636G时，BamHI酶将片断切开成为137bp和96bp两条片断 当等位基因为636A时，酶切位点消失，片段不被切开据此分析酶切结果，判断基因型，见图6： GG基因型，也称野生型-137、96bp两条片断 GA基因型，也称突变杂合子-233、137、96bp三条片断 AA基因型，也称突变纯合子-233bp一条片断250bp233bp137bp96bpGG AGMarker图6.CYP2C19*3分型Fig6.Genotype of CY
15、P2C19*3（GG为野生型，AG为突变杂合型）(GG wild type, AG heterozygous type)2 2、基因测序法、基因测序法图7.基因测序图谱从测序图谱分析：在突变位点只有G峰的，为GG型在突变位点只有A峰的，为AA型在突变位点有G和A双峰的，为AG型限制性片段长度多态性分析结果与限制性片段长度多态性分析结果与基因测序结果一致基因测序结果一致两种两种DNADNA鉴定方法相互验证，证明所鉴定方法相互验证，证明所建立的限制性片段长度多态性法准建立的限制性片段长度多态性法准确、可靠确、可靠五、等位基因和基因型分布五、等位基因和基因型分布1 1、基因频率与基因型、基因频率与基
16、因型 CYP2C19*2的基因频率与基因型统计结果见下表表1.CYP2C19*2基因频率与基因型分布Tab.1 Frequency distribution of gene and genotype for CYP2C19*2基因型基因型频率基因频率GG型50.00%基因G 0.7333GA型46.67%基因A 0.2667AA型3.33% CYP2C19*3的基因频率与基因型统计结果见下表表2.CYP2C19*3基因型及基因频率分布Tab.2 Frequency distribution of gene and genotype for CYP2C19*3基因型基因型频率基因频率GG型88.
17、89%基因G 0.9444GA型11.11%基因A 0.0556AA型0.00%2 2、双位点基因型、双位点基因型 理论上应该有九种双位点基因型： CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 GG（纯合野生，无突变） CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 GA（*2纯合野生，*3杂合子） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 GG（*2杂合子，*3纯合野生） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 GG（*2纯合突变，*3纯合野生） CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 AA（*2纯合野生，*3纯合突变） CYP2C19*2 GA - CYP
18、2C19*3 GA（*2杂合子，*3杂合子） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 AA（*2杂合子，*3纯合突变） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 GA（*2纯合突变，*3杂合子） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 AA（*2纯合突变，*3纯合突变）由于样本量的限制，在此次研究中，只发现了*2GG-*3GG,*2GA-*3GG,*2AA-*3GG,*2GG-*3GA,*2GA-*3GA五种双位点基因型。各基因型频率分布见下表表3.双位点基因型频率分布Tab.3 Frequency distribution of genotype双位点基因型频率*
19、2GG*3GG40.7%*2GA*3GG44.4%*2AA*3GG3.7%*2GG*3GA7.4%*2GA*3GA3.7%六、六、CYP2C19CYP2C19基因型与丙戊酸血药浓度的相关性基因型与丙戊酸血药浓度的相关性血药浓度/体重剂量血药浓度标准化，排除服药剂量和体重对血药浓度的影响进行基因型与血药浓度/体重剂量相关性分析，结果如下1 1、各种基因型与血药浓度的关系、各种基因型与血药浓度的关系单独分析CYP2C19*2基因位点，血药浓度/体重剂量比值的大小顺序为：GGGAAA单独分析CYP2C19*3基因位点，血药浓度/体重剂量比值的大小顺序为：GGGA带有突变的基因型比值均高于野生基因型，
20、但差异没有统计学意义，见表4表4.CYP2C19*2和CYP2C19*3位点基因型与血药浓度相关性CYP2C19*2CYP2C19*3GGGAAAGGGA血药浓度/体重剂量（kg/L）3.611.574.142.754.220.13.962.294.120.862 2、各种双位点基因型与血药浓度相关性、各种双位点基因型与血药浓度相关性研究发现，5种双位点基因型中，血药浓度/体重剂量比值大小顺序为： *2GG-*3GG *2GG-*3AG *2AG-*3GG ，见表5（其中*2AG-*3AG和*2AA-*3GG都只有1例） *2AG-*3GG基因型血药浓度/体重剂量比值明显高于*2GG-*3GG
21、，其他基因型比值均高于*2GG-*3GG，但结果没有统计学差异表5.CYP2C19双位点位点基因型与血药浓度相关性双位点基因型血药浓度/体重剂量*2GG-*3GG3.551.76*2GG-*3AG3.690.61*2AG-*3GG4.362.83*2AG-*3AG4.98*2AA-*3GG4.22 第四部分第四部分 分析讨论分析讨论一、关于实验技术的讨论一、关于实验技术的讨论用于药物代谢酶基因多态性研究的基因分型方法 q限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）分析）分析q基因测序法基因测序法q单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP）q变性高效液相色谱（变性高效液相色谱（
22、DHPLC）分析）分析q变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析）分析其中，基因测序法结果精准，但费用较高，不适于临床样品常规检测其中，基因测序法结果精准，但费用较高，不适于临床样品常规检测 DHPLC DHPLC法目前已不单独使用，多为结合其他技术作辅助使用法目前已不单独使用，多为结合其他技术作辅助使用优点优点操作简单低耗时耗费经基因测序结果验证，准确可靠限制性片段长度多限制性片段长度多态性（态性（RFLPRFLP）分析）分析缺点缺点要具有已知的内切酶的识别位点只能检测已知的酶切位点，而对基因的所有突变位点无法全面检测此法适于临床样品的常规检测在建立一种新的PCR-RFLP法时，最
23、好用基因测序法予以验证二、关于实验结果的讨论二、关于实验结果的讨论1 1、基因频率与基因型、基因频率与基因型 本研究所得各种基因型与双位点基因型的频率，均与文献报道相似（CYP2C19基因多态性对癫痫患者丙戊酸血药浓度的影响，北大药学院，于洁，邵宏等） 基因突变率较高，证实中国人群中研究CYP2C19基因多态性与血药浓度的相关性，有临床研究价值。2 2、基因型与血药浓度的相关性、基因型与血药浓度的相关性基于样本量不足，我们对数据进行分析没有统计学差异但在研究中发现*2AG-*3GG基因型血药浓度/体重剂量比值明显高于*2GG-*3GG，因此可以认为CYP2C19基因多态性影响丙戊酸血药浓度*2
24、GG-*3AG的血药浓度/体重剂量比值较之*2AG-*3GG，与*2GG-*3GG较接近，是因为*3位点上的基因突变率较*2位点的低。 在临床使用中，携带*2AG-*3GG基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸血药浓度会明显升高，若要达到某一目标血药浓度，携带*2AG-*3GG基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸剂量应减少三、关于下一步实验的设想三、关于下一步实验的设想1 1、针对目前实验的不足，下一步的工作中可在以下几个方、针对目前实验的不足，下一步的工作中可在以下几个方面进行完善面进行完善样本量样本量不足不足继续收集血样，扩大样本量，进行更广泛深入的研究相关基相关基因仍有因仍有待研究待研究陆续开
25、展CYP2A6、UGT等与丙戊酸血药浓度相关性研究未考虑未考虑合并用合并用药影响药影响丙戊酸钠合并用药常为卡马西平，苯巴比妥一类CYP450s诱导剂，影响丙戊酸血药浓度，应纳入研究未研究不未研究不良反应发良反应发生率生率监察患者不良反应与丙戊酸血药浓度，服药剂量，基因型的关系2 2、关于实验的其他设想、关于实验的其他设想 在上述工作取得进展后，我认为还可以在如左所述几个方面开展工作，以取得丙戊酸个体化用药研究的新突破共同为提高癫痫患者的生命质量而努力共同为提高癫痫患者的生命质量而努力共同为提高癫痫患者的生命质量而努力共同为提高癫痫患者的生命质量而努力多中心联合建立多中心联合建立多中心联合建立多
26、中心联合建立丙戊酸患者相关丙戊酸患者相关丙戊酸患者相关丙戊酸患者相关基因库基因库基因库基因库对相关基因型对相关基因型对相关基因型对相关基因型与血药浓度数与血药浓度数与血药浓度数与血药浓度数据进行量化研据进行量化研据进行量化研据进行量化研究，建立模型究，建立模型究，建立模型究，建立模型进行进行进行进行前瞻性研究前瞻性研究，变用药后的血药变用药后的血药变用药后的血药变用药后的血药浓度监测为基因浓度监测为基因浓度监测为基因浓度监测为基因检测的用药前预检测的用药前预检测的用药前预检测的用药前预测和指导测和指导测和指导测和指导 致谢致谢本文是在临床药学室童卫杭老师的悉心指导下完成的，本文是在临床药学室童
27、卫杭老师的悉心指导下完成的，在此谨对导师的辛勤奉献和热情关怀致以最诚挚的感谢。在此谨对导师的辛勤奉献和热情关怀致以最诚挚的感谢。刘丽宏主任和马萍副主任也对本文进行了严格的督导，刘丽宏主任和马萍副主任也对本文进行了严格的督导，丁春雷、雷宁、李鹏飞、吴诚、杨润涛、张晓菲老师在丁春雷、雷宁、李鹏飞、吴诚、杨润涛、张晓菲老师在实习期间给予了耐心的教导和无私的帮助，在此表示衷实习期间给予了耐心的教导和无私的帮助，在此表示衷心的感谢。心的感谢。 感谢厦门大学领导和老师的教育与培养，为我们提供了感谢厦门大学领导和老师的教育与培养，为我们提供了良好的学习氛围和文化视野。良好的学习氛围和文化视野。感谢实习队友张琼娥、林玉香和唐静的陪伴与帮助。感谢实习队友张琼娥、林玉香和唐静的陪伴与帮助。谢谢远在家乡的母亲，兄长及各位好友，谢谢他们无私谢谢远在家乡的母亲，兄长及各位好友，谢谢他们无私的关爱和支持。的关爱和支持。欢迎各位批评与指正欢迎各位批评与指正厦门大学医学院本科毕业论文厦门大学医学院本科毕业论文
