《生物化学》教学课件：第二章 多肽与蛋白质

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1、多肽与蛋白质多肽与蛋白质第二章第二章Peptides and Proteins 1833年，年，Payen和和Persoz分离出淀粉酶。分离出淀粉酶。1864年，年，Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶并将其制成结晶。19世纪末，世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽并将氨基酸合成了多种短肽 。 1938年，德国化学家年，德国化学家Gerardus J. Mulder引用引用“Protein” 一词来描述蛋白质。一词来描述蛋白质。 1951年年, Pauling采用采用X（射）线晶体衍

2、射发现了蛋（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构白质的二级结构-螺旋螺旋(-helix)。 1953年，年，Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。完成胰岛素一级序列测定。 1962年，年，John Kendrew和和Max Perutz确定了血红蛋确定了血红蛋白的四级结构。白的四级结构。20世纪世纪90年代以后，后基因组计划。年代以后，后基因组计划。什么是蛋白质什么是蛋白质? 蛋蛋白白质质（protein）是是由由许许多多氨氨基基酸酸（amino acids）通通过过肽肽键键（peptide bond） 相连形成的高分子含氮化合物。相连形成的高分子含氮化合物。分分布布广广：所

3、所有有器器官官、组组织织都都含含有有蛋蛋白白质质；细细胞的各个部分都含有蛋白质。胞的各个部分都含有蛋白质。含含量量高高：蛋蛋白白质质是是细细胞胞内内最最丰丰富富的的有有机机分分子子，占占人人体体干干重重的的45，某某些些组组织织含含量量更更高高，例例如如脾脾、肺肺及及横横纹纹肌肌等等高高达达80。蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性1. 蛋白质是生物体重要组成成分蛋白质是生物体重要组成成分1 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）2 2）代谢调节作用）代谢调节作用3 3）免疫保护作用）免疫保护作用4 4）物质的转运和存储）物质的转运和存储5 5）运动与支持作用）运动与支持作用6 6）

4、参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递2. 蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能3. 氧化供能氧化供能肽和蛋白质的一级结构肽和蛋白质的一级结构第一节第一节Primary Structure of Peptides and Proteins （一）氨基酸通过肽键相连形成肽（一）氨基酸通过肽键相连形成肽/蛋白质蛋白质存存在在自自然然界界中中的的氨氨基基酸酸有有300余余种种，组组成成体体内内蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸（amino acid）有有20种种，均均为为L-氨氨基基酸酸（除除甘甘氨酸外）氨酸外） 。1、肽和蛋白质是由氨基酸组成的多聚体、肽和蛋白质是由氨基酸组成的多聚体蛋蛋

5、白白质质是是由由若若干干氨氨基基酸酸的的氨氨基基与与羧羧基基经经脱脱水缩合而连接起来形成的长链化合物。水缩合而连接起来形成的长链化合物。一一个个氨氨基基酸酸分分子子的的-羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸分分子子的的-氨氨基基在在适适当当的的条条件件下下经经脱脱水水缩合即生成肽。缩合即生成肽。两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。多多肽肽链链具具有有方方向向性性，头头端端为为氨氨基基端端（N N端端），尾端为羧基端（，尾端为羧基端（C C端）。端）。多肽链从氨基末端走向羧基末端。多肽链从

6、氨基末端走向羧基末端。 由由数数个个、十十数数个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽习习惯惯称称为为寡寡肽肽(oligopeptide)，而而很很多多氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称为称为多肽（多肽（polypeptid）。）。凡凡氨氨基基酸酸残残基基数数目目在在5050个个以以上上，且且具具有有特特定定空间结构的肽称蛋白质；空间结构的肽称蛋白质；凡凡氨氨基基酸酸残残基基数数目目在在5050个个以以下下，且且无无特特定定空空间结构者称多肽。间结构者称多肽。 （二）生物活性肽：（二）生物活性肽：生生物物体体内内具具有有一一定定生生物物学学活活性性的的肽肽类物质称生物活性肽。类物质称生物活性肽。重重要要的

7、的有有谷谷胱胱甘甘肽肽、神神经经肽肽、肽肽类类激素等。激素等。 1.谷胱甘肽是体内重要的还原剂谷胱甘肽是体内重要的还原剂 谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSHGSH）：）：全称为全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（可氧化、还原，故有还原型（GSHGSH）与氧化）与氧化型（型（GSSGGSSG）两种存在形式。）两种存在形式。 谷胱甘肽的生理功用：谷胱甘肽的生理功用：解解毒毒作作用用：与与毒毒物物或或药药物物结结合合，消消除除其其毒毒性作用；生物转化。性作用；生物转化。参参与与氧氧化化还还原原反反应应：作作为为重重要要的的还还原原剂剂，参与体内多种氧化还

8、原反应；参与体内多种氧化还原反应；保保护护巯巯基基酶酶的的活活性性：使使巯巯基基酶酶的的活活性性基基团团-SH-SH维持还原状态；维持还原状态；维维持持红红细细胞胞膜膜结结构构的的稳稳定定：消消除除氧氧化化剂剂对对红细胞膜结构的破坏作用。红细胞膜结构的破坏作用。 2. 2. 多肽类激素：多肽类激素：多肽类激素：多肽类激素：种类较多，生理功能各异。种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。催产素，加压素，促肾上腺皮质激素。催产素，加压素，促肾上腺皮质激素。3.3.神经肽神经肽神经肽：在神经传导过程中起信号转导作神经肽：在神经传导过程中起信号转导作用的

9、肽类。用的肽类。脑啡肽，强啡肽，孤啡肽，物质（脑啡肽，强啡肽，孤啡肽，物质（1010肽）肽）用于临床镇痛治疗用于临床镇痛治疗。二、二、蛋白质的分子组成和结构蛋白质的分子组成和结构蛋蛋白白质质分分子子中中主主要要的的元元素素组组成成是是：C C、H H、O O、N N、S S等等。C C（505055%55%）、H H（6 67%7%）、O O（191924%24%）、N N（131319%19%）、 S S（0 04%4%）、）、有有些些蛋蛋白白质质含含有有少少量量磷磷或或金金属属元元素素铁铁、铜铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。蛋白质是体内的主要含氮

10、物。蛋白质是体内的主要含氮物。其中其中N元素的含量相对稳定，约为元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于，故每克氮相当于6.25克蛋白质。克蛋白质。 N的含量平均为的含量平均为16%凯氏定氮法凯氏定氮法（Kjadehl）的理论基础）的理论基础( (一一) )蛋白质的分类蛋白质的分类1. 蛋白质根据分子组成分为单纯蛋白质和结合蛋白蛋白质根据分子组成分为单纯蛋白质和结合蛋白质两类质两类： 单纯蛋白质（单纯蛋白质（simple protein）结合蛋白质结合蛋白质 = = 蛋白质部分蛋白质部分 + + 非蛋白质部分非蛋白质部分（conjugated protein）辅基辅基（prostheti

11、c group）2. 蛋白质根据结构特点进行分类蛋白质根据结构特点进行分类 ：将具有相同或类似结构域或模体的蛋将具有相同或类似结构域或模体的蛋白质归为一类。既体现结构特性又提白质归为一类。既体现结构特性又提示功能特性。示功能特性。超家族（超家族（super family）家族（家族（family）亚家族（亚家族（subfamily）3. 蛋白质根据其形状蛋白质根据其形状 可分为：可分为：纤维状蛋白质：结构蛋白，难溶于水。如结纤维状蛋白质：结构蛋白，难溶于水。如结缔组织中的胶原蛋白缔组织中的胶原蛋白球状蛋白质：易溶于水，功能蛋白。球状蛋白质：易溶于水，功能蛋白。( (二二) )蛋白质分子结构可区

12、分为蛋白质分子结构可区分为4 4个层次个层次高级结构高级结构或或空间构象空间构象(conformation)一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋蛋白白质质的的构构象象通通常常由由非非共共价价键键（次次级级键键）来来维系。维系。三、三、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构肽键（主要化学键）肽键（主要化学键）二硫键二硫键蛋白质一级结

13、构蛋白质一级结构(primary structure)是指蛋是指蛋白质分子中，从白质分子中，从N端到端到C端的氨基酸排列端的氨基酸排列顺序。顺序。形成一级结构的化学键：形成一级结构的化学键：胰胰岛岛素素（InsulinInsulin）由由5151个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，分分为为A A、B B两两条条链链。A A链链2121个个氨氨基基酸酸残残基基，B B链链3030个个氨氨基基酸酸残残基基。A A、B B两两条条链链之之间间通通过过两两个个二二硫硫键键联联结结在在一一起起，A A链链另另有有一一个个链链内内二硫键。二硫键。 四、四、蛋白质一级结构比对可用于同源蛋白质一级结构比对可用于

14、同源 蛋白质分析蛋白质分析蛋白质一级结构（氨基酸序列）比对常被蛋白质一级结构（氨基酸序列）比对常被用来预测蛋白质之间结构与功能的相似性。用来预测蛋白质之间结构与功能的相似性。 序列比对方法（序列比对方法（sequence-comparison method）关键在于将）关键在于将2个序列准确地对齐，使个序列准确地对齐，使之达到相同序列最大化，插入或删除序列最小之达到相同序列最大化，插入或删除序列最小化的目的。化的目的。然后计算相同的氨基酸数。然后计算相同的氨基酸数。 同源蛋白质：仅指同一基因进化而来的蛋白质。同源蛋白质：仅指同一基因进化而来的蛋白质。 相似（相似（analogy）序列：序列相似

15、，但非进化相）序列：序列相似，但非进化相关的关的2个蛋白质的序列，常被称为相似序列个蛋白质的序列，常被称为相似序列 。不同种属有同样功能的蛋白质，活性部位的氨基不同种属有同样功能的蛋白质，活性部位的氨基酸是保守的，进化过程中，变化较少或基本不酸是保守的，进化过程中，变化较少或基本不变。变。 第二节第二节 肽、蛋白质的高级结构肽、蛋白质的高级结构Three Dimentional Structure of Peptides and Proteins一、一、蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构蛋蛋白白质质的的二二级级结结构构是是指指蛋蛋白白质质多多肽肽链链主主链链原原子子（氨氨基基N、 -碳碳原原子子

16、、羰羰基基碳碳）局局部部的的空空间间结结构构，不不包包括括与与其其他他肽肽段段的的相相互互关系及侧链构象的内容。关系及侧链构象的内容。维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。（一）肽单元（一）肽单元 1.1.由由于于C=OC=O（羰羰基基）双双键键中中的的电电子子云云与与N N原原子子上上的的未未共共用用电电子子对对发发生生“电电子子共共振振”，使使肽肽键键具具有有部部分分双双键键的的性性质质，不不能能自由旋转。自由旋转。 2.2.与与肽肽键键相相连连的的六六个个原原子子构构成成刚刚性性平平面面结结构构，称为肽单元或肽键平面。称为肽单元或肽键平面。但但由由于

17、于-碳碳原原子子与与其其他他原原子子之之间间均均形形成成单单键键，因因此此两两相相邻邻的的肽肽键键平平面面可可以以作作相相对对旋旋转。转。肽肽键键平平面面由由于于肽肽键键具具有有部部分分双双键键的的性性质质，使使参参与与肽肽键键构构成成的的六六个个原原子子被被束束缚缚在在同同一一平平面面上上，这这一一平平面称为面称为肽键平面或肽单元肽键平面或肽单元。（二）蛋白质二级结构的类型：（二）蛋白质二级结构的类型：蛋蛋白白质质的的二二级级结结构构主主要要包包括括-螺螺旋旋，-折折迭迭，-转转角角及及无无规规卷卷曲曲等等几几种类型。种类型。1. -螺旋螺旋： -螺螺旋旋是是多多肽肽链链的的主主链链原原子子

18、沿沿一一中中心心轴轴盘盘绕绕所所形形成成的的有有规规律律的的螺螺旋旋构构象象，其其结结构构特特征为：征为： 走向为顺时针方向，为一右手螺旋；走向为顺时针方向，为一右手螺旋； 螺螺旋旋每每圈圈包包含含3.63.6个个氨氨基基酸酸残残基基， 螺螺距距为为5.445.44埃；埃； 螺螺旋旋以以氢氢键键维维系系。每每个个肽肽键键N-HN-H的的和和第第四四个肽键的羰基氧形成氢键；个肽键的羰基氧形成氢键；（） -螺螺旋旋常常具具两两性性特特点点，几几个个疏疏水水性性氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽段段和和几几个个亲亲水水性性氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽段段交交替替出出现现，使使之之能能在在极极性性和和非非极

19、极性环境中存在。性环境中存在。毛毛发发的的角角蛋蛋白白，肌肌肉肉的的肌肌球球蛋蛋白白，血血凝凝块块中中的的纤纤维维蛋蛋白白 ，它它们们的的多多肽肽链链几几乎乎都都卷卷曲曲成成-螺旋。具较好的伸缩性。螺旋。具较好的伸缩性。-折折迭迭是是由由若若干干肽肽段段或或肽肽链链排排列列起起来来所所形成的扇面状片层构象，其结构特征为：形成的扇面状片层构象，其结构特征为： 由由若若干干条条肽肽段段或或肽肽链链平平行行或或反反平平行行排排列列组成片状结构；组成片状结构； 主链骨架伸展呈锯齿状；主链骨架伸展呈锯齿状； 借借相相邻邻肽肽链链主主链链肽肽键键羰羰基基氧氧和和亚亚氨氨基基氢氢之间形成的氢键维系。之间形成

20、的氢键维系。蚕丝蚕蛋白几乎都是蚕丝蚕蛋白几乎都是-折迭折迭2. -折迭：折迭：-折迭包括平行式和反平行式两种类型折迭包括平行式和反平行式两种类型3. -3. -转角：转角：-转转角角是是多多肽肽链链180180回回折折部部分分所所形形成成的的一种二级结构，其结构特征为：一种二级结构，其结构特征为： 主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约180180回折回折; ; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成回折部分通常由四个氨基酸残基构成; ; 构构象象依依靠靠第第一一残残基基的的-CO-CO基基与与第第四四残残基基的的-NH-NH基之间形成氢键来维系。基之间形成氢键来维系。 4. 4. 无规卷曲：无规卷曲

21、：无无规规卷卷曲曲是是指指多多肽肽链链主主链链部部分分形形成成的的无无规规律律的卷曲构象。的卷曲构象。蛋蛋白白质质的的二二级级结结构构不不同同形形式式间间在在一一定定条条件件下下可可以以转转变变。毛毛发发水水蒸蒸气气拉拉伸伸-螺螺旋旋可可变变成成-转角转角RNaseRNase的分子结构的分子结构-螺旋螺旋-折迭折迭-转角转角无规卷曲无规卷曲（三）模体（三）模体（motif)motif)在在许许多多蛋蛋白白质质分分子子中中可可发发现现二二个个或或三三个个具具有有二二级级结结构构的的肽肽段段 ，形形成成一一个个具具有有特特殊殊功能的空间结构被称为功能的空间结构被称为模体或超二级结构。模体或超二级结

22、构。一一个个模模体体总总有有其其特特征征性性的的氨氨基基酸酸序序列列，并并发挥特殊的功能。发挥特殊的功能。锌指结构是一个常见的模体。锌指结构是一个常见的模体。由一个由一个-螺旋和两个反向平行的螺旋和两个反向平行的-折迭折迭组组成，形似手指。成，形似手指。端两个半胱氨酸，端两个组氨酸，端两个半胱氨酸，端两个组氨酸，此四个氨基酸残基在空间上构成一个洞穴，此四个氨基酸残基在空间上构成一个洞穴，容纳一个锌，具结合锌离子功能。容纳一个锌，具结合锌离子功能。含锌指结构的蛋白质都可与或含锌指结构的蛋白质都可与或结合。结合。锌指结构锌指结构 ( (折迭折迭- -折迭模序折迭模序) )亮氨酸拉链结构：亮氨酸拉链

23、结构： 见见于于真真核核生生物物DNA结结合合蛋蛋白白质质的的C端端，与与癌基因表达调控有关。癌基因表达调控有关。由由两两段段-螺螺旋旋平平行行排排列列构构成成，其其-螺螺旋旋中中存存在在每每隔隔7个个残残基基规规律律性性排排列列的的Leu残残基基，Leu侧侧链链交交替替排排列列而而呈呈拉拉链链状状。两两条条肽肽链链呈呈钳状与钳状与DNA结合。结合。 （四）氨基酸侧链对二级结构形成的影响（四）氨基酸侧链对二级结构形成的影响影响影响-螺旋稳定的因素有：螺旋稳定的因素有： 极大的极大的侧链基团侧链基团（存在空间位阻）；（存在空间位阻）； 连连续续存存在在的的侧侧链链带带有有相相同同电电荷荷的的氨氨

24、基基酸酸残残基（同种电荷的互斥效应）；基（同种电荷的互斥效应）； 有有ProPro等等亚氨基酸存在亚氨基酸存在（不能形成氢键）。（不能形成氢键）。(4)Gly:(4)Gly:由于由于自由度过大自由度过大而不稳定。而不稳定。 二、二、蛋白质三级结构蛋白质三级结构蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构(tertiary structure)是是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，的排布位置，包括一级结构中相距甚远包括一级结构中相距甚远的肽段的空间位置关系。的肽段的空间位置关系。（一）三级结构是

25、指整条多肽链的空间分布（一）三级结构是指整条多肽链的空间分布 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) N 端端 C端端肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin）是一个单个肽链的球状蛋白质，由是一个单个肽链的球状蛋白质，由153个氨基酸残基构成，含有个氨基酸残基构成，含有1个个血红素（血红素（heme）辅基。）辅基。 ( (二二) ) 维持三级结构稳定主要依靠非共价键维持三级结构稳定主要依靠非共价键蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠弱的蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠弱的相互作用力或称非共价键、次级键，相互作用力或称非共价键、次级键，主要有氢键、范德华力（主要有氢键、范德华力（Van der Waals for

26、ce）、疏水作用（）、疏水作用（hydrophobic interactin）和盐键（）和盐键（salting bond）（又）（又称离子键）等。称离子键）等。 1. 1. 氢键：氢键：氢氢键键(hydrogen (hydrogen bond)bond)的的形形成成常常见见于于连连接接在在一一电电负负性性很很强强的的原原子子上上的的氢氢原原子子，与与另另一电负性很强的原子之间。一电负性很强的原子之间。氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。重要的作用。氢键的键能较低氢键的键能较低( (12kJ/mol)12kJ/mol)，因而易被，因而易被破坏。破坏

27、。氢键的作用是：协同蛋白质的折叠氢键的作用是：协同蛋白质的折叠帮助稳定球蛋白的天然构象。帮助稳定球蛋白的天然构象。 蛋白质分子中氢键的形成蛋白质分子中氢键的形成2. 2. 疏水键：疏水键：非非极极性性物物质质在在含含水水的的极极性性环环境境中中存存在在时时，会会产产生生一一种种相相互互聚聚集集以以避避开开水水的的力力，这这种种力称为疏水键或疏水作用力。力称为疏水键或疏水作用力。蛋蛋白白质质分分子子中中的的许许多多氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链也也是是非非极极性性的的，这这些些非非极极性性的的基基团团在在水水中中也也可可相互聚集，形成疏水键。相互聚集，形成疏水键。疏疏水水相相互互作作用用在在维维持

28、持蛋蛋白白质质构构象象中中起起着着主主要的作用。要的作用。非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内部，而大多数极性侧链在蛋白质表面子内部，而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与水的接触。维持着与水的接触。3. 3. 离子键（盐键）：离子键（盐键）：离离子子键键(salt (salt bond)bond)是是由由带带正正电电荷荷基基团团与与带带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。在在近近中中性性环环境境中中，蛋蛋白白质质分分子子中中的的酸酸性性氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链电电离离后后带带负负电电荷荷，而而碱碱性性氨氨基基酸

29、酸残残基基侧侧链链电电离离后后带带正正电电荷荷，二二者者之之间间可可形形成成离离子子键键。能能帮帮助助稳稳定定球球蛋蛋白白，虽虽然然这种作用很弱。这种作用很弱。离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，所以是溶剂化的。所以是溶剂化的。对于整个球蛋白的稳定性的贡献是最小的对于整个球蛋白的稳定性的贡献是最小的4范德华氏（范德华氏（van der Waals)引力引力范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力只有当两个非极性残基之间处于范德华力只有当两个非极性残基之间处于一定距离时才能达到最大。一定距离时才能达到最大。虽然范

30、德华力相对来说比较弱，但由于范虽然范德华力相对来说比较弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具有加和性，德华力相互作用数量大，并且具有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有贡献。因此范德华力对球蛋白的稳定性也有贡献。（三）结构域（三）结构域 分子量大的蛋白质三级结构，常常可分割分子量大的蛋白质三级结构，常常可分割成数个结构紧密的球状或纤维状区域。成数个结构紧密的球状或纤维状区域。这些区域在功能上相对独立，由几个超这些区域在功能上相对独立，由几个超二级结构单位汇集在一起组成，形成发挥二级结构单位汇集在一起组成，形成发挥生物学功能的特定区域，生物学功能的特定区域，称为结构称为结构域域（domai

31、n）。）。结构域结构域(domain)(domain)在空间上相对独立在空间上相对独立免疫球蛋白免疫球蛋白（四）根据结构域可对蛋白质进行分类：（四）根据结构域可对蛋白质进行分类：根据结构域可将球状蛋白质分为根据结构域可将球状蛋白质分为4类：类：反平行反平行螺旋结构域（全螺旋结构域（全-结构）结构）平行或混合型平行或混合型折叠片结构域（折叠片结构域（，-结构）结构）反平行反平行折叠片结构域折叠片结构域(全全-结构结构)富含金属或二硫键结构域（不规则小蛋白质富含金属或二硫键结构域（不规则小蛋白质结构）结构）（五）分子伴侣（五）分子伴侣除一级结构外，蛋白质空间构象的正确形除一级结构外，蛋白质空间构象

32、的正确形成还需分子伴侣（成还需分子伴侣（molecular chaperonmolecular chaperon）。）。有些蛋白质被合成以后，自己不能独立形有些蛋白质被合成以后，自己不能独立形成自由能最低的稳定立体结构，而需要一成自由能最低的稳定立体结构，而需要一类蛋白质来催化，这类蛋白质称为分子伴类蛋白质来催化，这类蛋白质称为分子伴侣。许多分子伴侣是侣。许多分子伴侣是ATPATP酶。酶。它们普遍存在于真核生物和原核生物中，它们普遍存在于真核生物和原核生物中，一般使用一般使用ATPATP的能量帮助其它蛋白质形成自的能量帮助其它蛋白质形成自由能最低的立体结构，但不改变自己。由能最低的立体结构，但

33、不改变自己。分子伴侣可分为分子伴侣可分为3类：类：热激蛋白热激蛋白70(Hsp70)：Hsp70在真核和原核生在真核和原核生物中高度保守，它可部分逆转变性或聚集的物中高度保守，它可部分逆转变性或聚集的蛋白质蛋白质 。伴侣蛋白伴侣蛋白(chaperonin)：伴侣蛋白普遍存在伴侣蛋白普遍存在于细菌、线粒体、叶绿体和真核生物，主要于细菌、线粒体、叶绿体和真核生物，主要有有2个家族：个家族：热激蛋白热激蛋白60( Hsp60)和和Hsp10。 核质蛋白核质蛋白(nucleoplasmin) 各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。 三、多亚基的蛋白质具有四级结构形式三

34、、多亚基的蛋白质具有四级结构形式蛋蛋白白质质分分子子中中各各亚亚基基的的空空间间排排布布及及亚亚基基接接触触部部位位的的布布局局和和相相互互作作用用，称称为为蛋蛋白白质质的的四级结构。四级结构。体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基称为蛋白质的亚基 (subunit)(subunit)。（一）具有四级结构形式的蛋白质由多亚基组成（一）具有四级结构形式的蛋白质由多亚基组成血血红红蛋蛋白白的的四四级级结结构构（二）（二）亚基通过亚基间的相互作用联系在一起亚基通过亚基间的相互

35、作用联系在一起由由2个个亚亚基基组组成成的的蛋蛋白白质质四四级级结结构构中中，若若亚亚基基分分子子结结构构相相同同，称称 之之 为为 同同 二二 聚聚 体体(homodimer)，若若亚亚基基分分子子结结构构不不同同，则则称称之之 为为 异异 二二 聚聚 体体(heterodimer)。 （三）生物体内有很多由多亚基组成的蛋白质（三）生物体内有很多由多亚基组成的蛋白质生物体内许多蛋白质往生物体内许多蛋白质往往由多个亚基组成，亚基之往由多个亚基组成，亚基之间凭借次级键形成蛋白质四间凭借次级键形成蛋白质四级结构。级结构。 胰岛素受体：由胰岛素受体：由4个亚基个亚基组成组成(22) ，亚基与亚基与亚

36、基形亚基形成单体成单体(monomer)，2个单体个单体形成二聚体形成二聚体(dimer)。 血红蛋白的一、二、三、四级结构血红蛋白的一、二、三、四级结构蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系Structure and Function of Proteins第三节第三节（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构是高级结构与功能一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础的基础牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶的一级结构的一级结构二二硫硫键键通过研究通过研究ribonuclease (ribonuclease (核糖核酸酶核糖核酸酶) )的变性的变性和重折叠证明氨基

37、酸序列可以决定蛋白质和重折叠证明氨基酸序列可以决定蛋白质最后的三维结构。最后的三维结构。用尿素和用尿素和巯基乙醇处理核糖核酸酶，巯基乙醇处理核糖核酸酶，破坏次级键和二硫键，空间结构被破坏，破坏次级键和二硫键，空间结构被破坏，但肽键不受影响，一级结构还存在，酶活但肽键不受影响，一级结构还存在，酶活性丧失。性丧失。用透析方法去除尿素和用透析方法去除尿素和巯基乙醇，二巯基乙醇，二硫键正确配对，肽链折叠成天然酶的空间硫键正确配对，肽链折叠成天然酶的空间构象。酶恢复活性。构象。酶恢复活性。牛牛核核糖糖核核酸酸酶酶一一级级结结构构与与空空间间结结构构的的关关系系（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级（二

38、）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能结构与功能不同的哺乳动物胰岛素都由不同的哺乳动物胰岛素都由A A、B B两条链组成两条链组成, ,一级结一级结构相似构相似, ,仅个别氨基酸差异仅个别氨基酸差异. . 氨基酸残基序号氨基酸残基序号胰岛素胰岛素 A8 A9 A10 B30A8 A9 A10 B30 人人 Thr Ser Ile ThrThr Ser Ile Thr 牛牛 Ala Ser Val AlaAla Ser Val Ala 猪猪 Thr Ser Ile AlaThr Ser Ile Ala 羊羊 Ala Gly Val AlaAla Gly Val Ala 马马 Thr Gl

39、y Ile AlaThr Gly Ile Ala 狗狗 Thr Ser Ile AlaThr Ser Ile Ala促促肾肾上上腺腺皮皮质质激激素素(ACTH)和和促促黑黑激激素素(-MSH, -MSH)共共有有一一段段相相同同的的氨氨基基酸酸序序列列，因因此此，ACTH也也可促进皮下黑色素生成，但作用较弱。可促进皮下黑色素生成，但作用较弱。 ( (三三) )氨基酸序列提供氨基酸序列提供重要的生物化学信息重要的生物化学信息一一些些广广泛泛存存在在于于生生物物界界的的蛋蛋白白质质如如细细胞胞色色素素(cytochrome C)，比比较较它它们们的的一一级级结结构构，可可以以帮帮助助了了解解物物种

40、种进进化化间间的关系。的关系。 （四）（四）重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系（一）肌红蛋白和血红蛋白的结构（一）肌红蛋白和血红蛋白的结构血红蛋白、肌红蛋白是氧的运载体，血红蛋白

41、、肌红蛋白是氧的运载体，分别存在于红细胞和肌肉中。分别存在于红细胞和肌肉中。一级结构不同一级结构不同, 但空间构象极为相似但空间构象极为相似1肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构肌红蛋白只有三级结构单链蛋白肌红蛋白只有三级结构单链蛋白, ,含血红素含血红素辅基。它是典型的球形蛋白质，高度折叠辅基。它是典型的球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。在分子内部，极性残基在表面。肌红蛋白中有肌红蛋白中有8 8条条-螺旋。由多肽的折叠螺旋。由多肽的折叠形成的疏水空隙内是血红素辅基，通过肽形成的疏水空隙内是血红素辅基，通过肽链上的链

42、上的HisHis残基与肌红蛋白分子内部相连，残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与O O2 2结结合）。合）。肌红蛋白的三级结构2 2 血红蛋白的结构血红蛋白的结构脊椎动物的脊椎动物的HbHb由由4 4个多肽链亚基组成，其中个多肽链亚基组成，其中2 2个是一种亚基，个是一种亚基，2 2个是另一种亚基。个是另一种亚基。如成人的血红蛋白主要是如成人的血红蛋白主要是HbAHbA，亚基组成为，亚基组成为2222，每个血红蛋白分子都有，每个血红蛋白分子都有4 4个血红素，个血红素，每个血红素分别位于每个多肽链中的裂隙每个血红素分别位于每个多肽链中

43、的裂隙处，并暴露在分子的表面。处，并暴露在分子的表面。血红蛋白（血红蛋白（HbHb）的主要功能是在血液中结）的主要功能是在血液中结合并转运氧气，它存在于红细胞中。合并转运氧气，它存在于红细胞中。脱氧脱氧脱氧脱氧HbHb亚基之间的八对盐键亚基之间的八对盐键亚基之间的八对盐键亚基之间的八对盐键（二）血红蛋白的构象变化与结合氧（二）血红蛋白的构象变化与结合氧1、肌红蛋白（、肌红蛋白（Mb）与血红蛋白（）与血红蛋白（Hb）的氧解离曲线）的氧解离曲线HbHb和和MbMb都能可逆地与都能可逆地与O O2 2结合，其氧解离曲结合，其氧解离曲线，前者为线，前者为S S状曲线，后者直角双曲线。状曲线，后者直角双

44、曲线。 MbMb易与氧结合，易与氧结合， HbHb在氧分压低时较难。在氧分压低时较难。根据根据S S状曲线特点，第一个亚基与氧结合后状曲线特点，第一个亚基与氧结合后促进第二和第三亚基及第四亚基与氧结合。促进第二和第三亚基及第四亚基与氧结合。2 2、协同效应：一个亚基与其配体（、协同效应：一个亚基与其配体（HbHb中的配中的配体为体为O O2 2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。与配体的结合能力。如果是促进作用则称为正协同效应（如果是促进作用则称为正协同效应（positive positive cooperativitycooperativit

45、y）；反之则为负协同效应）；反之则为负协同效应（negative cooperativitynegative cooperativity）。）。肌红蛋白肌红蛋白对氧的亲和力比血红对氧的亲和力比血红蛋白的高蛋白的高血红蛋白血红蛋白血红蛋白与氧的结合是血红蛋白与氧的结合是协作的协作的协同效应协同效应3、血红蛋白与氧结合的机制、血红蛋白与氧结合的机制1.1.未与未与O O2 2结合的结合的4 4个亚基靠彼此形成盐键而个亚基靠彼此形成盐键而紧密结合紧密结合紧张态（紧张态（T T 态态 tense state).tense state).此时的血红蛋白与此时的血红蛋白与O O2 2结合能力小；当第一个结

46、合能力小；当第一个亚基与亚基与O O2 2结合而破坏了该亚基与其相邻亚基结合而破坏了该亚基与其相邻亚基间的盐键，结构开始松散，便于第二个亚间的盐键，结构开始松散，便于第二个亚基与基与O O2 2结合，使结构更松散结合，使结构更松散由由T T态转变态转变为松弛态为松弛态R R态。四个亚基全处于态。四个亚基全处于R R态。态。2.2.脱氧脱氧HbHb的的FeFe2+2+半径大，结合氧后其半径变半径大，结合氧后其半径变小，引起相关肽段的一系列微小的变化，小，引起相关肽段的一系列微小的变化，使得亚基间盐键断裂，使得亚基间盐键断裂，HbHb结构变松散。结构变松散。脱氧脱氧HbHb为为T T型结构型结构氧

47、合氧合HbHb为为R R型型结构结构氧连接导致血红素构象的变化4 4、变构效应、变构效应 当当血血红红蛋蛋白白的的一一个个亚亚基基与与氧氧分分子子结结合合以以后后，可可引引起起其其他他亚亚基基的的构构象象发发生生改改变变，对对氧氧的的亲亲和和力力增增加加，从从而而导导致致整整个个分分子子的的氧氧结结合合力力迅迅速速增增高高，使使血血红红蛋蛋白白的的氧氧饱饱和和曲曲线线呈呈“S S”形形。这这种种由由于于蛋蛋白白质质分分子子构构象象改改变变而而导导致致蛋蛋白白质质分分子子功功能能发发生生改改变变的的现现象象称为变构效应。称为变构效应。 某某些些代代谢谢物物能能与与变变构构酶酶分分子子上上的的变变

48、构构部部位位特特异异性性结结合合，使使酶酶的的分分子子构构象象发发生生改改变变，从从而而改改变变酶酶的的催催化化活活性性以以及及代代谢谢反反应应的的速速度度，这这种种调调节节作作用用就就称称为为变变构构调调节节(allosteric regulation)(allosteric regulation)血红蛋白血红蛋白(Hb)是一种变构蛋白是一种变构蛋白O2, CO2, H+变构效应剂变构效应剂亚基间的亚基间的相互作用相互作用构像改变脱氧脱氧HbHb氧合氧合HbHb（三）蛋白质构象改变与疾病三）蛋白质构象改变与疾病由于蛋白质构象的改变而引起的疾病称为由于蛋白质构象的改变而引起的疾病称为蛋白质构象

49、病。蛋白质构象病。如：当蛋白质由于折叠错误而相互聚集，如：当蛋白质由于折叠错误而相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀。常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀。可导致人类纹状体脊髓变形病、老年痴呆、可导致人类纹状体脊髓变形病、老年痴呆、亨丁顿舞蹈病（亨丁顿舞蹈病（Huntington diseaseHuntington disease）、）、疯牛病疯牛病疯牛病疯牛病疯牛病是阮病毒蛋白（疯牛病是阮病毒蛋白（prion protein, prion protein, PrPPrP）引起的人和动物神经退行性病变。这）引起的人和动物神经退行性病变。这类疾病具有传染性、遗传性或散在发病的类疾病具有传染

50、性、遗传性或散在发病的特点。特点。其在动物间的传播是由其在动物间的传播是由PrPPrP组成的传染性颗组成的传染性颗粒（不含核酸）完成的。粒（不含核酸）完成的。PrPPrPc c 为基因正常编码蛋白，水容性好，对为基因正常编码蛋白，水容性好，对蛋白酶敏感，二级结构为多个蛋白酶敏感，二级结构为多个-螺旋。螺旋。 PrPPrPscsc 为致病蛋白。在某种未知的蛋白质作为致病蛋白。在某种未知的蛋白质作用下，富含用下，富含-螺旋的螺旋的PrPPrPc c 全转变为全转变为-折折迭的致病迭的致病PrP PrP 叫叫PrPPrPscsc 。 PrPPrPscsc水容性差，对蛋白酶不敏感，对热稳水容性差，对蛋

51、白酶不敏感，对热稳定，可以相互聚集，最终形成淀粉样纤维定，可以相互聚集，最终形成淀粉样纤维沉淀而致病沉淀而致病 。PrPPrPc c与与PrPPrPscsc 一级结构完全相同。一级结构完全相同。 一条肽链对应一个一条肽链对应一个特定的空间结构特定的空间结构 这条法则的破坏是这条法则的破坏是灾难性的。疯牛病的灾难性的。疯牛病的prionprion就是一个例子就是一个例子。正常正常prion异常异常prion第四节第四节蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质Chemical and Physical Properties of Proteins 一、一、蛋白质具有两性电离性质蛋白质具有两性电离性质蛋蛋白

52、白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件件下下都都可可解解离离成成带带负负电电荷荷或或正正电荷的基团。电荷的基团。当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷荷为为零零，此此时时溶溶液液的的pH称称为为蛋蛋白质的等电点。白质的等电点。蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 蛋白质在等电点的溶解度最小蛋白质在等电点的溶解度最小 二、蛋白

53、质具有胶体性质二、蛋白质具有胶体性质蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可自自1万万至至100万万之之间间，其其分分子子的的直径可达直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 蛋白质胶体稳定的因素：蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚集

54、和沉淀溶液中蛋白质的聚集和沉淀三蛋白质的变性、沉淀和凝固：三蛋白质的变性、沉淀和凝固： 在在某某些些物物理理或或化化学学因因素素的的作作用用下下，蛋蛋白白质质严严格格的的空空间间结结构构被被破破坏坏（不不包包括括肽肽键键的的断断裂裂），从从而而引引起起蛋蛋白白质质若若干干理理化化性性质质和和生生物物学学性性质质的改变，称为蛋白质的变性的改变，称为蛋白质的变性(denaturation)(denaturation)。蛋蛋白白质质的的变变性性主主要要发发生生在在二二硫硫键键和和非非共共价价键键的的破破坏坏，不不涉涉及及一一级级结结构构中中氨氨基基酸酸序序列列的的改改变。变。引起蛋白质变性的因素有：

55、引起蛋白质变性的因素有： 物理因素：高温、高压、紫外线、电离物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等；辐射、超声波等； 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。金属盐等。变性蛋白质的性质改变：变性蛋白质的性质改变： 物物理理性性质质：旋旋光光性性改改变变，溶溶解解度度下下降，沉降率升高，粘度升高等；降，沉降率升高，粘度升高等； 化化学学性性质质：官官能能团团反反应应性性增增加加，易易被蛋白酶水解。被蛋白酶水解。 生生物物学学性性质质：原原有有生生物物学学活活性性丧丧失失，抗原性改变。抗原性改变。 应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒临

56、床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。及灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 蛋白质变性的可逆性：复性蛋白质变性的可逆性：复性复复性性：若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度轻轻，去去除除变变性性因因素素后后，有有些些蛋蛋白白质质可可恢恢复复或或部部分分恢复其原有的构象和功能。恢复其原有的构象和功能。1） 蛋蛋白白质质在在体体外外变变性性后后，绝绝大大多多数数情情况下是不能复性的；况下是不能复性的；2） 如如变变性性程程度度浅浅，蛋蛋白白质质分分子子的的构构象象未未被被严严重重破破坏坏；或或者

57、者蛋蛋白白质质具具有有特特殊殊的的分分子子结结构构，并并经经特特殊殊处处理理则则可可以复性。以复性。核核糖糖核核酸酸酶酶的的变变性性与与复复性性沉淀、凝固沉淀、凝固 蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。称为沉淀。变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。 四四、蛋白质在紫外光谱区

58、有特征性吸收峰、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因此此在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可可作作蛋蛋白白质质定定量量测定。测定。五、蛋白质呈色反应可用于溶液五、蛋白质呈色反应可用于溶液蛋白质测定蛋白质测定（一）蛋白质经水解后产生茚三酮反应（一）蛋白质经水解后产生茚三酮反应蛋白质经水解后产生的氨基酸也可蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应发生茚三酮反应(ninhydrin reaction) 。（二）肽链

59、中的肽键可与双缩脲试剂反应（二）肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应为双缩脲反应(biuret reaction) 。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。蛋白质的分离、纯化、鉴定蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析和结构分析Isolation, Purification, Identificationand Structural Analysis of Proteins第五节第五节利用透析袋把大分子蛋白质与小分子

60、化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法叫透析。分开的方法叫透析。1 可分离蛋白质和小分子物质，可分离蛋白质和小分子物质，2透析袋外放吸水剂如聚乙二醇，袋内水伴透析袋外放吸水剂如聚乙二醇，袋内水伴同小分子物质透出袋外，蛋白质可达到浓同小分子物质透出袋外，蛋白质可达到浓缩目的。缩目的。利用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定利用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。叫超滤法液的目的。叫超滤法一透析及超滤一透析及超滤二二、常用的蛋白质沉淀方法、常用的蛋白质沉淀方法丙丙酮酮沉沉淀淀，必必须须在在04低低温温下下

61、进进行行，丙丙酮酮用用量量一一般般10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，应应立立即即分分离离。除除了了丙丙酮酮以以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。沉沉淀淀原原理理是是： 脱脱水水作作用用； 使使水水的的介介电电常数降低，蛋白质溶解度降低。常数降低，蛋白质溶解度降低。 盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫

62、酸钠等。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最在蛋白质的等电点处效果最好。好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。性。 将将某某一一纯纯化化蛋蛋白白质质免免疫疫动动物物，可可获获得得抗抗该该蛋蛋白白的的特特异异抗抗体体。利利用用特特异异抗抗体体识识别别相相应应的的抗抗原原蛋蛋白白，并并形形成成抗抗原原抗抗体体复复合合物物的的性性质质，可可从从蛋蛋白白质质混混合合溶溶液液中中分分离获得抗原蛋白。离获得抗原蛋白。 免疫沉淀法免疫沉淀法（immunoprecipitation）三三、电泳是蛋

63、白质分离与鉴定的常、电泳是蛋白质分离与鉴定的常用方法用方法蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质的技术质的技术, 称为电泳称为电泳(elctrophoresis) 。根根据据支支撑撑物物的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶电泳等。胶电泳等。 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳 SDS-PAGE SDSSDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入中

64、加入SDSSDS和巯基乙醇后，与和巯基乙醇后，与SDSSDS结合的蛋结合的蛋白质带有一致的负电荷；巯基乙醇可使蛋白质带有一致的负电荷；巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。白质分子中的二硫键还原。SDSSDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。的改变。蛋白质蛋白质-SDS-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。质量的函数。 等电聚焦电泳：等电聚焦电泳：等电聚焦电泳是根据两性物质等电

65、点（等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）不同而进行分离的一种电泳技术，具有极不同而进行分离的一种电泳技术，具有极高的分辨率，可以分辨出等电点相差高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的的蛋白质。蛋白质。等电聚焦主要用于蛋白质的分离分析，但也等电聚焦主要用于蛋白质的分离分析，但也可以用于纯化制备。可以用于纯化制备。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）利用蛋白质的等电点和分子量的差异，通过双利用蛋白质的等电点和分子量的差异，通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质分离开。向凝胶电泳的方法将各种蛋白质分离开。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技

66、术结合了等电聚焦技术和技术和SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的双重聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的双重优点。优点。第一向电泳是等电聚焦，在细管中进行，蛋白第一向电泳是等电聚焦，在细管中进行，蛋白质根据其等电点不同进行分离。质根据其等电点不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用而后将凝胶从管中取出，用SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶进行第二向电泳。在第二向电泳过程中，胶进行第二向电泳。在第二向电泳过程中，蛋白质依据其分子量大小进行分离蛋白质依据其分子量大小进行分离 。由于双向电泳具有很高的分辨率，它可以直接由于双向电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白从细胞提取液中检测

67、某个蛋白 。Two-dimensional gel electrophoresis, a technique for separating proteins based on their charge charge and their massmass. 双向电泳等电聚焦等电聚焦 SDSSDSPAGEPAGE蛋白质组学技术蛋白质组学技术四四、应用相分配或亲和原理可将蛋白、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少

68、及亲和力等，的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的的目的 。层析层析(chromatography) 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。量及性质不同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。析，利用各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法凝胶过滤分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质五五、利

69、用蛋白质颗粒沉降行为不同、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离可进行超速离心分离超超速速离离心心法法(ultracentrifugation)既既可可以以用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质也也可可以以用用作作测测定定蛋蛋白白质质的分子量。的分子量。 蛋蛋白白质质在在离离心心场场中中的的行行为为用用沉沉降降系系数数(sedimentation coefficient, S)表表示示，沉沉降降系数与蛋白质的密度和形状相关系数与蛋白质的密度和形状相关 。因因为为沉沉降降系系数数S大大体体上上和和分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分分子

70、量。子量。但但对对分分子子形形状状高高度度不不对对称称的的大大多多数数纤纤维状蛋白质不适用。维状蛋白质不适用。六、用化学或反向遗传学方法可分析或六、用化学或反向遗传学方法可分析或演绎多肽链的氨基酸序列演绎多肽链的氨基酸序列蛋白质一级结构的测定测定多肽链的数目蛋白质测序的步骤拆分多肽链拆分多肽链断开多肽链内的二硫键断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端末端裂解多肽链为较小的肽段裂解多肽链为较小的肽段测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构确定二硫键

71、的位置确定二硫键的位置一）、氨基酸顺序分析一）、氨基酸顺序分析 蛋蛋白白质质多多肽肽链链的的氨氨基基酸酸顺顺序序分分析析，即即蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定，主主要要包包括括以以下下几几个个步骤：步骤： 1. 1. 分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质，得得到到一一定定量量的的蛋蛋白白质纯品。质纯品。 2. 2. 取取一一定定量量的的样样品品进进行行完完全全水水解解，再再用用氨氨基基酸酸自自动动分分析析仪仪，测测定定蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸组成。各氨基酸的含量，不是组成。各氨基酸的含量，不是序列。序列。 蛋白质的氨基酸组成分析蛋白质的氨基酸组成分析3. 分析蛋白质的分析蛋白质的N-端和端

72、和C-端氨基酸。端氨基酸。 SangerSanger采用采用2,4-2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法确定蛋白质的）法确定蛋白质的N-N-端端氨基酸。氨基酸。 2,4-2,4-二硝基氟苯与多肽链的二硝基氟苯与多肽链的a-a-氨基生成二硝基苯氨基酸，后氨基生成二硝基苯氨基酸，后将多肽水解，分离出二硝基苯氨基酸。将多肽水解，分离出二硝基苯氨基酸。现多用丹酰氯生成丹酰衍生物，具荧光，易鉴别。现多用丹酰氯生成丹酰衍生物，具荧光，易鉴别。用羧肽酶将用羧肽酶将C-C-端氨基酸水解确定蛋白质的端氨基酸水解确定蛋白质的C-C-端氨基酸。端氨基酸。 2,4-2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DN

73、FBDNFB）法分析）法分析N-N-端氨基酸残基端氨基酸残基 4. 4. 采采用用特特异异性性的的酶酶（如如胰胰蛋蛋白白酶酶）或或化化学学试试剂剂（如如溴溴化化氰氰）将将蛋蛋白白质质裂裂解解成成为为长长短不一的若干条肽段（至少作两套）。短不一的若干条肽段（至少作两套）。溴化氰：水解蛋氨酸羧基侧的肽键。溴化氰：水解蛋氨酸羧基侧的肽键。胰胰蛋蛋白白酶酶（trypsin)trypsin)的的裂裂解解作作用用：水水解解芳芳香香族氨基酸羧基侧的肽键族氨基酸羧基侧的肽键胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsin)trypsin)的裂解作用：水解芳香的裂解作用：水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键族氨基酸羧基侧的肽键5.

74、5. 分离纯化单一肽段分离纯化单一肽段6. 6. 使用氨基酸顺序测定仪，测定各条肽段的氨使用氨基酸顺序测定仪，测定各条肽段的氨基酸顺序。基酸顺序。一般采用一般采用EdmanEdman降解法降解法: :由埃德曼（由埃德曼（PEdman）在上世纪）在上世纪50年代所创年代所创立。立。1)用异硫氰酸苯酯进行反应，只与游离用异硫氰酸苯酯进行反应，只与游离的的a-a-氨基作用氨基作用; ;2)2)后用冷稀酸处理，氨基末端的氨基酸脱落，后用冷稀酸处理，氨基末端的氨基酸脱落，成异硫氰酸苯酯衍生物成异硫氰酸苯酯衍生物; ;3)3)用层析鉴定。后面的肽链用层析鉴定。后面的肽链a-a-氨基继续与异硫氨基继续与异硫

75、氰酸苯酯反应氰酸苯酯反应; ;特点：从特点：从N-段依次对氨基酸进行鉴定段依次对氨基酸进行鉴定EdmanEdman降解法测定氨基酸序列降解法测定氨基酸序列异异硫硫氰氰酸酸苯苯酯酯 7. 7. 将将两两套套不不同同肽肽段段的的氨氨基基酸酸顺顺序序进进行行比比较较，以以获获得得完完整整的的蛋蛋白白质质分分子子的的氨氨基基酸顺序。酸顺序。二）通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：二）通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列七、应用物理学、生物信息

76、学原理可七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测进行蛋白质空间结构测定或预测通通常常采采用用圆圆二二色色光光谱谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺螺旋旋的的CD峰峰有有222nm处处的的负负峰峰、208nm处的负峰和处的负峰和198nm处的正峰处的正峰3个成分；个成分；而而 -折叠的折叠的CD谱不很固定。谱不很固定。 （一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例X射射线线衍衍射射法法(X-ray diffraction)和和核核磁磁共共振振技技术术(

77、nuclear magnetic resonance, NMR)是是研研究究蛋蛋白白质质三三维维空空间间结结构构最最准准确确的方法。的方法。 （二）（二）X射线衍射法和核磁共振技术用于射线衍射法和核磁共振技术用于 三维空间结构分析三维空间结构分析* * 用用分分子子力力学学、分分子子动动力力学学的的方方法法，根根据据物物理理化化学学的的基基本本原原理理，从从理理论论上上计计算算蛋蛋白质分子的空间结构。白质分子的空间结构。 （三）根据蛋白质的氨基酸序列预测三维空间（三）根据蛋白质的氨基酸序列预测三维空间 结构结构* * 通通过过对对已已知知空空间间结结构构的的蛋蛋白白质质进进行行分分析析，找找出

78、出一一级级结结构构与与空空间间结结构构的的关关系系，总总结结出出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。第六节第六节 血浆蛋白质血浆蛋白质 Plasma Proteins一、采用电泳法可将血浆蛋白质分成若一、采用电泳法可将血浆蛋白质分成若干组分干组分 电泳法是分离、分析血浆蛋白质的主要电泳法是分离、分析血浆蛋白质的主要方法。采用醋酸纤维素膜电泳，可将血浆蛋方法。采用醋酸纤维素膜电泳，可将血浆蛋白质分为白质分为5个组分。个组分。 按泳动快慢依次为：清蛋白、按泳动快慢依次为：清蛋白、1-、2-、-和和-球蛋白（球蛋白（globulin）。而采用聚丙烯酰）。而采用聚丙

79、烯酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳(PAGE)可将血浆蛋白分离出可将血浆蛋白分离出100种以上。种以上。 A 白蛋白白蛋白 1 2 血浆蛋白的电泳图血浆蛋白的电泳图血浆蛋白质主要成分及功能血浆蛋白质主要成分及功能功 能血浆蛋白质抗蛋白酶抗凝乳蛋白酶、1-抗胰蛋白酶、2-巨球蛋白、抗凝血酶血液凝固各种凝血因子、纤维蛋白原酶血液中功能酶：如凝血因子、胆碱酯酶组织细胞漏出的酶：如转氨酶激素红细胞生成素免疫功能-免疫球蛋白、补体蛋白、2-微球蛋白参与炎症反应急性时相反应蛋白：如C反应蛋白、1-酸性糖蛋白（血清类黏蛋白）肿瘤胚胎性蛋白1甲胎蛋白（AFP）转运或结合蛋白清蛋白结合、运输胆红素、非酯化脂肪酸、离子（C

80、a2），金属离子（Cu2、Zn2）、正铁血红素、类固醇激素和各种药物分子血浆铜蓝蛋白含有Cu2（但Cu2转运可能主要依赖清蛋白）皮质类固醇结合球蛋白（运皮质激素蛋白）结合皮质醇结合珠蛋白结合细胞外的血红蛋白脂蛋白（乳糜微粒、VLDL、LDL、HDL）运输甘油三酯、胆固醇、磷脂等 血红素结合蛋白结合血红素视黄醇结合蛋白结合视黄醇性激素结合球蛋白结合睾酮、雌二醇甲状腺素结合球蛋白结合T3、T4运铁蛋白运输铁甲状腺素运载蛋白结合T4并与视黄醇结合蛋白形成复合物急性时相蛋白急性时相蛋白: :在急性炎症或某种类型组织损伤中，某些在急性炎症或某种类型组织损伤中，某些血浆蛋白水平会增高，这些蛋白被称为急血浆

81、蛋白水平会增高，这些蛋白被称为急性时相蛋白。性时相蛋白。例如，例如，C C反应蛋白（反应蛋白（CRPCRP）、）、 1 1抗胰蛋白酶、抗胰蛋白酶、 1 1酸性糖蛋白、结合珠蛋白、纤维蛋白酶酸性糖蛋白、结合珠蛋白、纤维蛋白酶原等。原等。此外，三种蛋白则相应减少：前清蛋白、此外，三种蛋白则相应减少：前清蛋白、清蛋白、运铁蛋白。清蛋白、运铁蛋白。二、血浆中大多数蛋白质具有特殊的二、血浆中大多数蛋白质具有特殊的生物学功能生物学功能（一）血浆蛋白质大多数属于分泌性蛋白质（一）血浆蛋白质大多数属于分泌性蛋白质绝大多数在绝大多数在肝脏肝脏合成，合成，合成场所一般位于合成场所一般位于多核糖体多核糖体上，上，从

82、粗面内质网到高尔基复合体到质膜而分泌入从粗面内质网到高尔基复合体到质膜而分泌入血液。血液。 球蛋白由浆细胞合成。球蛋白由浆细胞合成。除清蛋白外，几乎所有的血浆蛋白都为除清蛋白外，几乎所有的血浆蛋白都为糖蛋白糖蛋白（二）清蛋白是血浆中含量最多的蛋白质（二）清蛋白是血浆中含量最多的蛋白质在肝中合成，先合成前清蛋白，占肝合成总蛋在肝中合成，先合成前清蛋白，占肝合成总蛋白的白的25%。肝病时清蛋白含量下降，如肝病时清蛋白含量下降，如慢性肝炎和肝硬化慢性肝炎和肝硬化患者的清蛋白产生减少，而同时球蛋白产生患者的清蛋白产生减少，而同时球蛋白产生增加，增加，出现清蛋白与球蛋白比值（）出现清蛋白与球蛋白比值（）

83、下降，严重时比值到置。下降，严重时比值到置。 A/G正常比值为正常比值为1-2.5/1维持血浆渗透压较重要，清蛋白减少可引起严维持血浆渗透压较重要，清蛋白减少可引起严重水肿。重水肿。（三）很多血浆蛋白具有特殊的结合功能（三）很多血浆蛋白具有特殊的结合功能1 1前清蛋白运输视黄醇前清蛋白运输视黄醇 2 2运铁蛋白是铁的转运载体运铁蛋白是铁的转运载体 3 3甲状腺素结合球蛋白运输甲状腺素甲状腺素结合球蛋白运输甲状腺素 4 4结合珠蛋白结合珠蛋白- -血红蛋白复合物可防止血红血红蛋白复合物可防止血红 蛋白在肾小管沉积蛋白在肾小管沉积 5 5血浆铜蓝蛋白可结合铜血浆铜蓝蛋白可结合铜 6 6免疫球蛋白与

84、机体的防御机制免疫球蛋白与机体的防御机制转铁蛋白转铁蛋白血清中与铁转运相关的蛋白质叫转铁蛋白血清中与铁转运相关的蛋白质叫转铁蛋白（transferrin)，是一种在肝脏合成的，是一种在肝脏合成的糖糖蛋白，在一条多肽链中含有两个铁结合位点，蛋白，在一条多肽链中含有两个铁结合位点，价铁与转铁蛋白结合的亲和力高，价铁与转铁蛋白结合的亲和力高， 价铁价铁不能结合。不能结合。不同物种中铁与转铁蛋白结合的常数不等，从不同物种中铁与转铁蛋白结合的常数不等，从某种意义上讲，转铁蛋白过量的区域没有游某种意义上讲，转铁蛋白过量的区域没有游离的铁离子。离的铁离子。在正常生理状况下，大概在正常生理状况下，大概1/9的

85、转铁蛋白分子的转铁蛋白分子被铁饱和，被铁饱和，4/9半饱和，半饱和，4/9不含铁。不含铁。未饱和的转铁蛋白有助于预防感染。未饱和的转铁蛋白有助于预防感染。某些微生物如一些嗜盐弧菌（存在于部分牡某些微生物如一些嗜盐弧菌（存在于部分牡蛎、贝类中）他们是铁依赖的，在通常情蛎、贝类中）他们是铁依赖的，在通常情况下不致病。但当人体出现铁超负荷时，况下不致病。但当人体出现铁超负荷时，血清转铁蛋白被饱和，出现血清游离铁。血清转铁蛋白被饱和，出现血清游离铁。进食这些食物后，会发生迅速的进行性感进食这些食物后，会发生迅速的进行性感染。染。正常个体进食这些食物，不会有症状。正常个体进食这些食物，不会有症状。细菌的生长分泌需要铁。细菌的生长分泌需要铁。通常转铁蛋白对铁的紧密结合使铁不被利通常转铁蛋白对铁的紧密结合使铁不被利用，但发生酸中毒，用，但发生酸中毒，pH降低会显著降低转降低会显著降低转铁蛋白对铁的结合力，有较多细菌生长所铁蛋白对铁的结合力，有较多细菌生长所需铁，使个体易发感染。需铁，使个体易发感染。如糖尿病患者。如糖尿病患者。在酸性溶酶体基质中，铁离子释放。在酸性溶酶体基质中，铁离子释放。受体脱辅转铁蛋白复合物回细胞表面。受体脱辅转铁蛋白复合物回细胞表面。在细胞表面脱辅转铁蛋白释放到血浆中重在细胞表面脱辅转铁蛋白释放到血浆中重新利用。新利用。