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1、第五节 食品中维生素类的分析测定 维生素（vitamin）的种类很多，按其溶解性质可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类。 水溶性维生素有维生素B族和维生素C（抗坏血酸ascorbic acid ）。维生素B族包括：VB1（硫胺素 thiamin）、VB2（核黄素 riboflavin）、VB3（泛酸 pantothenic acid）、VB5（烟酸 niacin、尼克酰胺）、VB6（吡哆醇 pyridoxin）、VB7（生物素 biotin）、VB11（叶酸 folic acid）、VB12（钴胺素）。脂溶性维生素有：VA（包括胡萝卜素 carotene）、VD、VE、VK。一、水溶性维生素
2、类的测定（一）理化性质 水溶性维生素都易溶于水，不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在加热情况下，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响，如维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。 所以测定水溶性维生素一般都在酸性溶液中进行前处理。 （二）维生素B族的测定 维生素B1、B2通常采用稀盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶酶解，使结合态维生素游离出来，再进行提取。为了去除杂质，可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。1、维生素B1的测定 （1）硫色素荧光法：国标法。 原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中能被氧化
3、成一种强蓝色荧光物质噻嘧色素（硫色素）。硫色素在紫外线照射下，发出荧光，其强度与硫色素浓度成正比，也即与溶液中硫胺素含量成正比。 激发波长365nm；发射波长435nm。 样品提取：对于一般样品、高蛋白样品、淀粉质样品处理方法不同，如样品中所含杂质较多，可用柱层析法处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。操作过程：试样匀浆或粉碎，称样于三角瓶中加稀盐酸，放入高压锅中加热水解加淀粉酶、蛋白酶酶解，过滤得提取液将提取液加入已准备好的盐基交换柱中，过柱热蒸馏水冲洗交换柱，去杂质热酸性氯化钾过柱，收集滤液，即为试样净化液净化液分别加入A、B两个反应瓶避光，A瓶中加入氢氧化钠溶液，B瓶中加入碱性
4、铁氰化钾溶液，振摇15s加10mL正丁醇，同时振摇1.5min，静置分层吸去下层碱性溶液，加无水硫酸钠使溶液脱水上机测定。 （2）高效液相色谱法待测样品 色谱方式 检 测 器肉及肉制品 正相液相色谱 荧光检测器米粉 反相键合相色谱 柱后衍生化后 荧光检测器食品 离子交换色谱 紫外检测器米及米制品 反相离子对色谱 紫外检测器GBGBT5009.84-2003 食品中硫胺素(维生素B1)的测定.pdf 2、维生素B2的测定 国标第一法为荧光法，第二法为微生物法。 （1）荧光分光光度法 原理：样品经酸解、酶解处理使核黄素游离出来，用高锰酸钾和过氧化氢氧化杂质，再经硅镁吸附剂进行柱层析，吸附提取核黄素
5、，最后用洗脱液丙酮冰乙酸水洗脱并收集核黄素。VB2水溶液呈黄绿色荧光，在440nm的激发波长，525nm发射波长处可产生最大荧光强度。 测定谷物中VB2时最好在样品酸解后，加入一定量的淀粉酶，在3540酶解15小时左右，这样有利于结合型的VB2转化成游离型的VB2 。 （2）高效液相色谱法待测样品 色谱方式 检 测 器食品 反相键合相色谱 荧光检测器肉及肉制品 正相液相色谱 荧光检测器蛋及奶制品 反相键合相色谱 紫外检测器米及米制品 反相离子对色谱 紫外检测器 3、维生素B5的测定 国标方法为微生物法。 （1）溴化氰比色法 VB5与溴化氰结合后可与对氨基苯乙酮（或其它芳香族胺）作用生成黄色化合
6、物，因而可在420nm波长处测定光密度，求出VB5的含量。 （2）气相色谱法 烟酸分子具有羟基，不溶于有机溶剂，不能直接用气相色谱法进行测定，但烟酸经酯化转变成烟酸乙酯或N2基烟酰胺之后，可以用气相色谱法进行分离测定。 （3）高效液相色谱法 利用酸水解法提取VB5，经高效液相色谱分离，测定。 4、维生素B6的测定 国标法为微生物法。 （1）荧光分析法 样品经硫酸加压水解，采用CGS树脂的柱层析分离，以氯化钾的磷酸缓冲液洗脱。洗脱液在二氧化锰和乙醛酸钠溶液存在下，可使VB6的混合物即吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺一次转化为吡哆醛。吡哆醛在氰化钾作用下生成强荧光物质吡哆醛氰醇衍生物。在激发波长355nm，
7、发射波长434nm处，测定其荧光强度，就可计算出样品中VB6的含量。 （2）气相色谱法 VB6与七氟丁基咪唑反应可生成挥发性的衍生物，该衍生物在气相色谱中可以很好地分离。最低检出限10ng。气相色谱条件：电子捕获检测器；3%SE52，固定相Chromosorb WHPO （3）液相色谱法 样品水解后上机测定。 C18柱荧光检测器：激发波长290nm，发射波长395nm。 5、维生素B12的测定 （1）比色法 样品用浓硫酸和高氯酸钾消化后，样品中的钴与M吡啶联腙生成钴的红色化合物，可以进行比色测定，再从钴的含量换算成VB12的含量。注意：样品中存在游离钴离子将使测定结果偏高，可以预先用8羟基奎宁
8、氯仿溶液提取，分离除去。 （2）原子吸收分光光度法 维生素B12的分子中含有钴离子，占VB12的4.35%，采用原子吸收分光光度法可以测定其钴含量，再换算成VB12的含量。 样品预处理： 样品用VB12提取液（无水磷酸氢二钠1.3g柠檬酸1.2g无水焦亚硫酸钠1.0g加水至100ml）提取，滤液中加入EDTA，用氨水调pH至7，再加入活性炭，振摇，用无灰滤纸过滤，VB12被吸附在活性炭上，将活性炭连同滤纸一起在600下灰化完全，用硝酸将残渣溶解，以原子吸收分光光度法测定钴的含量。 从钴换算为VB12的换算系数=22.99。GBGBT 5009.217-2008 保健食品中维生素B12的测定.p
9、dfGBGBT 5009.210-2008 食品中泛酸的测定.pdfGBGBT 5009.211-2008 食品中叶酸的测定.pdf文章高效液相色谱法测定蔬菜中B族维生素.pdf（三）维生素C的测定 在食品中VC有三种存在形式：还原型抗坏血酸（2H，氧化）脱氢型抗坏血酸 二酮古洛糖酸。 1、提取方法 食品中的维生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸对维生素C有很好的稳定性能；偏磷酸能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量较高的样品。2、还原型抗坏血酸的测定 （1）分光光度法 在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐
10、B反应生成黄色的草酰肼-2-羟基丁酰内酯衍生物。在最大吸收波长420nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。 非蛋白性样品在乙酸溶液中提取，过滤后上清液供测定；蛋白性样品需再加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，沉淀蛋白质。 （2）2,6二氯靛酚滴定法 还原型抗坏血酸可以还原染料2,6二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色，被还原后成无色溶液。在终点时，过量的未被还原的染料在酸性溶液中呈粉红色，因此，在滴定过程中当溶液从无色转变成微红色时，表示还原型抗坏血酸全部被氧化为脱氢抗坏血酸，此时即为滴定终点。3、总抗坏血酸的测定 （1）荧光法： 国标第一法。 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与
11、邻苯二胺（OPDA）反应生成有荧光的喹喔啉衍生物，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 激发光波长338nm，发射波长420nm。 当食物中含有丙酮酸时，也与邻苯二胺反应生成一种荧光物质，干扰测定。这时加入硼酸。硼酸与脱氢抗坏血酸结合生成硼酸脱氢抗坏血酸螯合物，此螯合物不能与邻苯二胺反应生成荧光物质；而硼酸不与丙酮酸反应，丙酮酸仍可发生上述反应。因此，加入硼酸后测出的荧光值即为空白的荧光值。 注意事项： 试样用偏磷酸-乙酸溶液提取； 活性炭加入量要适量，量过多，对抗坏血酸有吸附作用，使结果偏低； 空白氧化液中加入硼酸溶液后需在4 冰箱中
12、放置2-3h，使反应完全，否则本底偏高。 （2）2,4二硝基苯肼比色法： 国标第二法。 样品中VC用草酸提取，活性炭使提取液中还原型抗坏血酸氧化成为脱氢抗坏血酸，然后与2,4二硝基苯肼作用生成红色的脎。在85硫酸溶液的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物双-2,4二硝基苯。最大吸收波长500nm，吸光度与总抗坏血酸的总量成正比，进行定量分析。文章猕猴桃中维生素C的高效液相色谱分析.pdf二、脂溶性维生素类的分析测定（一）理化性质 1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2、耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，VE对酸稳定。VA、D对碱稳定，VE对碱不稳定，但在
13、抗氧化剂存在下也能经受碱的煮沸。 3、耐热性、耐氧化性：VA、D、E耐热性好；VA、E易氧化，光、热能促进氧化；VD不易被氧化。 根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常先用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。然后用有机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化物），浓缩后溶于适当的溶剂中测定。为了防止氧化，常加入抗氧化剂。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。 操作在避光条件下进行。 （二）维生素A的测定 1、比色法 国标第二法。 维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑作用，生成蓝色化合物，在波长620nm处有特异吸收。 适用于维生素A含量较高的样品。 该法的主要缺点是生成的蓝色
14、络合物的稳定性差，比色测定必须在6s内完成，否则蓝色会迅速消退，造成极大误差。 2、高效液相色谱法 国标第一法。 （1）原理： 试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱C18反相柱将维生素A及维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。 内标物：苯并e芘标准液 流动相：甲醇水（982） 紫外检测器：波长300nm （2）样品处理： 皂化：准确称样于皂化瓶中加无水乙醇，搅匀加抗坏血酸（抗氧化剂），加苯并e芘标准液（内标物）加氢氧化钾（11）于沸水浴回流30min，使皂化完全立即放入冰水中冷却。 提取：皂化物移入分液漏斗加乙醚提取弃去水
15、层。 洗涤：用水洗乙醚层，至水层不显碱性。 浓缩：将乙醚提取液脱水（经无水硫酸钠过滤）后移入旋转蒸发器的球形蒸发瓶中55 水浴中减压蒸馏蒸发瓶中剩余2mL乙醚时，取下蒸发瓶，用氮气吹干加乙醇溶解提取物离心，上清液供色谱分析。 （三）维生素E的测定 1、比色法 维生素E与FeCl3反应，Fe3+被还原成Fe2+，Fe2+可与 联氮苯发生颜色反应，呈红色，因此在520nm处测定吸光度，可定量测定样品中VE的含量。 2、GC法 3、HPLC法维生素E测定的GC分析条件化合物 检测器 固定相 检测波长 内标物生育酚 FID SE30 275nm 十六烷基 棕榈酸酯生育酚 FID DB5 300nm 胆
16、甾烷胆固醇 （程序升温，260 300）（四）胡萝卜素的测定 1、高效液相色谱法 国标第一法。 试样中的胡萝卜素，用石油醚-丙酮（8020）混合液提取，提取液于旋转蒸发器上蒸发至干，残渣用少量石油醚溶解，然后经三氧化二铝柱纯化，收集洗脱液，用0.45m微孔滤膜过滤，滤液用C18反相柱进行HPLC分析。 流动相：甲醇乙腈（9010） 紫外检测器：波长448nm 2、纸层析法 国标第二法。 试样经过皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。（五）维生素D
17、的测定1、比色法维生素D与三氯化锑在氯仿中产生橙黄色物质，于500nm处定量测定。 2、HPLC法样品经过抽出脂肪、碱性皂化、乙醚抽提不皂化物以及经过毛地黄皂苷硅藻土和皂土二次柱层析，将脂肪、VA和VE等干扰物除去，然后注入液相色谱仪中，用含0.7%乙醇的异辛烷为流动相，以紫外检测器，波长254nm处进行测定，即可求出样品中VD的含量。（六）维生素K的测定维生素K易分解，因此提取样品中的VK不采用皂化方法，而采用有机溶剂直接提取。一般植物样品经干燥后，将其置于有机溶剂如乙醚、丙酮、石油醚中剧烈振摇，把VK抽提出来。动物组织样品也要预先干燥，再用有机溶剂抽提。GC法主要用于VK3的测定。 目前测定VK1的常用方法为HPLC法。 高效液相色谱法测定维生素K1 维生素K1广泛存在于绿色蔬菜中。 蔬菜中的维生素K1经石油醚提取后，注入经磷酸盐处理的氧化铝色谱柱中进行分离，除去干扰物。收集含VK1的淋洗液流分，浓缩定容后注入高效液相色谱C18柱，用紫外检测器测定。以外标法计算试样中VK1的含量。 流动相：甲醇正已烷（982） 紫外检测器：波长248nm
