【课件】细胞凋亡分子机制及检测

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1、细胞凋亡细胞凋亡分子机制及检测分子机制及检测 细胞发生代谢停止、结构破坏和功能细胞发生代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡细胞死亡。细。细胞死亡包括胞死亡包括坏死和凋亡坏死和凋亡两大类型。相比起两大类型。相比起细胞坏死，细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式形式。 在在2020世纪世纪7070年代，科学家们发现了细年代，科学家们发现了细胞凋亡，这一研究成果获得了胞凋亡，这一研究成果获得了20022002年诺贝年诺贝尔生理尔生理/ /医学奖。医学奖。有丝分裂有丝分裂 细胞增多细胞增多 动态平衡动态平衡细胞凋亡细胞凋亡 细胞减

2、少细胞减少新生细胞出现，产生相应功能新生细胞出现，产生相应功能 机体机体 正常生正常生原有的、不必要的、有害的细胞除去原有的、不必要的、有害的细胞除去 长发育长发育 细细胞胞程程序序性性死死亡亡的的概概念念是是19561956年年提提出出的的，PCDPCD是是个个功功能能性性概概念念，描描述述在在一一个个多多细细胞胞生生物物体体中中某某些些细细胞胞死死亡亡是是个个体体发发育育中中的的一一个个预预定定的的，并并受到严格程序控制受到严格程序控制的正常组成部分。的正常组成部分。 特特征征: :即即散散在在地地、逐逐个个地地从从正正常常组组织织中中死死亡亡和和消消失失, ,机机体体无无炎炎症症反反应应

3、，而而且且对对整整个个机机体体的的发发育是有利和必须的。育是有利和必须的。 细细胞胞程程序序性性死死亡亡是是一一个个发发育育学学概概念念，而而细细胞胞凋凋亡亡则则是是一一个个形形态态学学概概念念，描描述述一一件件有有着着一一整整套套形形态态学学特特征征的的与与坏坏死死完完全全不不同同的的细细胞胞死死亡亡形形式式。但但是是一一般般认认为为凋凋亡亡和和程程序序性性死死亡亡两两个个概概念念可可以以交交互使用，具有同等意义。互使用，具有同等意义。凋亡概念的形成凋亡概念的形成 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞。这些细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于

4、细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。 1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。细胞凋亡的形态学及生物化学形态学及生物化学研究阶段（1972-1987）1）利用光光镜镜和和电电镜镜对形态学特征进行了详细的研究。2）染染色色体体DNA的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。3）RNA/蛋白质蛋白质大分子的合成。4）钙钙离离子子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。 5）内

5、内源源性性核核酸酸内内切切酶酶：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。细胞凋亡的分子生物学分子生物学研究阶段1）细胞凋亡相关基因基因及其调控2）细胞凋亡的信号转导信号转导3）细胞凋亡各种分子相互作用及相互关系4) 细胞凋亡的临床应用基础研究阶段 细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。 细细胞胞的的生生长长发发育育、增增殖殖、分分化化和和死死亡亡是是细细胞胞的的4 4大大特特点点，细细胞胞死死亡亡分分为为细细胞胞凋凋亡亡和和细细胞胞坏坏死死。细细胞胞凋凋亡亡(apoptosis)(apoptosis)是是由由死死亡亡信信号号诱诱发发的的受受调调节节的

6、的细细胞胞死死亡亡过过程程, , 是是细细胞胞生生理理性性死死亡亡的的普普遍遍形形式式。凋凋亡亡过过程程中中DNADNA发发生生片片段段化化，细细胞胞皱皱缩缩分分解解成成凋凋亡亡小小体体，被被邻邻近近细细胞胞或或巨巨噬噬细细胞胞吞吞噬噬，不不发发生炎症。生炎症。 第一节第一节 概述概述一、细胞凋亡概念和特征一、细胞凋亡概念和特征 细细胞胞坏坏死死（necrosisnecrosis）是是在在各各种种致致病病因因素素（如如缺缺氧氧、物物理理、化化学学和和生生物物学学因因素素）的的剧剧烈烈刺刺激激下下的的病病理理性性死死亡亡。其其特特点点是是: : 引引起起死死亡亡的的因因素素剧剧烈烈，死死亡亡迅迅

7、速速。表表现现为为能能量量代代谢谢下下降降膜膜通通透透性性增增加加细细胞胞水水肿肿细细胞胞器器破破裂裂，细细胞胞溶溶解解，DNADNA不不断断裂裂内含物释放内含物释放引起炎症反应。引起炎症反应。 细细胞胞凋凋亡亡: :细细胞胞在在一一定定的的生生理理或或病病理理条条件件下下, ,遵遵循循自自身身的的程程序序, ,结结束束其其生生命命的的生生理理性性死死亡亡，是是受受基基因因严严格格调调控控的的细细胞胞自自杀杀现现象象。凋凋亡亡过过程程中中，细细胞胞骨骨架架蛋蛋白白分分解解细细胞胞和和细细胞胞器器浓浓缩缩而而不不裂裂解解染染色色体体DNADNA断断裂裂和和形形成成凋凋亡亡小小体体细细胞胞内内含含

8、物物不不外外泄泄，不不引引起起炎炎症症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。细胞凋亡细胞凋亡Apoptosis Apoptosis 和细胞坏死和细胞坏死NecrosisNecrosis细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的形态学特征细细胞胞：首首先先变变圆圆，体体积积缩缩小小，与与邻邻近近细细胞胞的的连连接接丧丧失失，失失去去微微绒绒毛毛，胞胞浆浆浓浓缩缩，细细胞胞膜膜结结构构仍保持完整。仍保持完整。细细胞胞核核的的变变化化：胞胞核核内内染染色色质质浓浓缩缩形形成成密密集集颗颗粒，位于核被膜下。粒，位于核被膜下。细胞器：细胞器： 线粒体：保持完整呈正常状态线粒

9、体：保持完整呈正常状态 溶酶体：保持完整，内容物不外泄溶酶体：保持完整，内容物不外泄 形形成成凋凋亡亡小小体体： 内内质质网网、高高尔尔基基复复合合体体及及核核被被膜膜膨膨大大, ,形形成成泡泡状状结结构构与与细细胞胞膜膜融融合合，以以出出泡泡方方式式离离开开正正在在死死亡亡的的细细胞胞，将将所所包包含含的的完完整整细细胞胞器器和和核核碎碎片片等等细细胞胞内内容容物物以以细细 胞胞 质质 膜膜 包包 被被 成成 凋凋 亡亡 小小 体体 (apoptosis (apoptosis bodiesbodies）释释放放到到细细胞胞外外。凋凋亡亡小小体体很很快快被被周周围围邻邻近近间间质质细细胞胞或或

10、巨巨噬噬细细胞胞吞吞噬噬，而而不不引引起起周围组织的炎症反应。周围组织的炎症反应。胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡凋亡 生物化学方面：生物化学方面： 核核酸酸内内切切酶酶活活化化与与DNADNA电电泳泳呈呈梯梯子子状状改改变变是是apoptosisapoptosis的的生物化学标志生物化学标志。 核核酸酸内内切切酶酶在在核核小小体体连连接接处处将将DNADNA链链切切断断，从从而而最最终终产产生生寡寡聚聚核核小小体体。这这些些寡寡聚聚核核小小体体的的大大小小均均是是DNADNA长长度度为为180 180 - - 200200个个碱碱基基对对(bp)(bp)的的倍倍数数，因因此此用用琼琼脂脂糖糖凝凝

11、胶胶电电泳泳测测定定细细胞胞DNADNA时时出出现现特特征征性的性的“梯状梯状”（ladderladder）带纹）带纹。Ladder Pattern of Apoptotic Cells二、细胞凋亡的生理意义二、细胞凋亡的生理意义1. 1. 维维持持组组织织器器官官细细胞胞类类型型和和细细胞胞总总量量的的基基本本平平衡衡：清清除衰老损伤的细胞除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。：皮肤、粘膜细胞的更新等。2. 2. 在在胚胎发育胚胎发育中起重要作用中起重要作用 a a 手手指指和和脚脚趾趾的的形形成成等等。 b b 大大脑脑神神经经元元之之间间形形成成连连接接时时多多余余的的神神经经细细胞

12、胞通通过过凋凋亡亡清清除除掉掉。 c c 在在淋淋巴巴细细胞胞发发育育成成熟熟中中起起重重要要作作用用。d d 心心脏脏发发育育过过程程中中左左右右心心室室、房房的的形形成成以以及及左左右右心心室室的的厚厚度度，通通过过细细胞凋亡调节。胞凋亡调节。3. 3. 细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病疾病。 未未成成熟熟B B细细胞胞（immature immature B B cellcell）完完成成骨骨髓髓发发育育阶阶段段后后，进进入入血血液液循循环环。尽尽管管它它表表达达膜膜表表面面抗抗原原受受体体，但但不不具具备备免免疫疫活活性性。因因此此，

13、在在结结合合抗抗原原后后，细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。 只只有有经经过过不不同同阶阶段段的的过过渡渡期期，分分化化为为成成熟熟B B细细胞胞，才具有免疫活性。才具有免疫活性。 过过渡渡期期B B细细胞胞的的发发育育、成成熟熟是是受受复复杂杂的的调调控控。一一方方面面，细细胞胞的的生生存存机机制制促促进进未未成成熟熟B B细细胞胞的的存存活活与与发发育育，保保证证了了B B细细胞胞成成熟熟的的顺顺利利完完成成。另另一一方方面面，70%70%的的细细胞胞凋凋亡亡，消消除除潜潜在在自自身身反反应应性性B B细细胞胞，实实现现了了对对自身组织的免疫耐受。自身组织

14、的免疫耐受。 由HIV感染引起的艾滋病有一个重要特征是随着病情的发展，CD4T细胞数进行性减少，其主要原因是：1，HIV感染细胞后产生一些调控性基因产物，这些产物使未被感染细胞未被感染细胞对CD95介导的凋亡高度敏感凋亡高度敏感（即通过Fas-FasL应答而使未被感染的细胞凋亡）；2，被HIV感染的CD4T细胞大量复制子病毒，导致细胞死亡，同时又使更多的细胞被感染。随感染时间的延长造成免疫系统进行性损伤和崩溃。 由此可见:HIV即可引起细胞凋亡也可引起细胞可引起细胞凋亡也可引起细胞坏死坏死.一一、半半胱胱天天冬冬酶酶（胱胱冬冬酶酶，caspasecaspase，天天冬冬氨氨酸酸特特异异性性半半

15、胱胱氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶，cysteine-containing cysteine-containing aspartate-specific protease)aspartate-specific protease)第二节第二节 细胞凋亡相关基因和蛋白质细胞凋亡相关基因和蛋白质Caspase的含义表现在两个方面（）它们为半胱氨酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团；（）它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。 Asp Asp 特异性半胱氨酸蛋白酶特异性半胱氨酸蛋白酶. . caspasecaspase能够高度选择能够高度选择性地切割某些蛋白质，

16、这种切割只发生在少数位点性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解一种蛋白质。一种蛋白质。 是一类促进细胞凋亡的是一类促进细胞凋亡的蛋白水解酶蛋白水解酶，在诱导细胞凋，在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器中心处理器”，即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细胞凋亡。胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细

17、胞凋亡。1 Caspase1 Caspase的结构和功能的结构和功能Caspase Caspase 共共有有十十多多种种，结结构构相相似似，都都以以酶酶原原的的形形式式分分泌泌。酶酶原原水水解解激激活活后后产产生生前前结结构构域域，大大亚亚基基和和小小亚亚基基三部分，然后大小亚基聚合形成有活性的四聚体。三部分，然后大小亚基聚合形成有活性的四聚体。N N端结构域端结构域参与酶功能激活调节参与酶功能激活调节; ;大大、小小亚亚基基提提供供与与底底物物结结合合及及催催化化所所需需的的氨氨基基酸酸。Caspase Caspase 可可专专一一、高高效效地地特特异异性性水水解解一一系系列列蛋蛋白白质质底

18、底物物, ,并导致蛋白质功能丧失或改变并导致蛋白质功能丧失或改变 。 caspase caspase 酶原酶原 前结构域前结构域 + + 大亚基大亚基 + + 小亚基小亚基 大大 异二聚体异二聚体 小小 大大 大大 异四聚体异四聚体 活性形式活性形式 小小 小小 活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子，球状分子的核心为个螺旋环绕的6个片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。 Crystal Structures of Human Caspases Str

19、ucture of Caspase-7 with Inhibitor Caspase Caspase 作用：作用： 是是一一类类蛋蛋白白水水解解酶酶，可可特特异异水水解解底底物物蛋蛋白白分分子子中中天天冬冬氨氨酸酸残残基基羧羧基基侧侧的的肽肽键键，从从而而激激活活该该蛋蛋白白质质或或改改变变蛋蛋白白质质的的活活性性，从而促进细胞凋亡。从而促进细胞凋亡。 N A-B-C-D-X C N A-B-C-D-X C 不同的不同的CaspaseCaspase对对ABCDABCD种类要求不同。种类要求不同。 CaspaseCaspase是是细细胞胞凋凋亡亡的的执执行行者者，引引起起细细胞胞凋凋亡亡的的各各

20、种种因因素素通通过过凋凋亡亡信信息息传传递递途途经经最最终终激激活活caspasecaspase，caspasecaspase通通过过水水解解不不同同的的蛋蛋白白质质改改变变细细胞胞特特性性，引引起起细细胞胞凋凋亡亡。其其中中caspase caspase 3 3 的的作作用用最最重重要要。但但并并非非所所有有的的凋凋亡亡过过程程都都有有caspase caspase 的的参与。参与。2 Caspase 2 Caspase 的分类的分类（1 1）上游）上游/ /启动型启动型caspase: 2caspase: 2、8 8、9 9、1010，1212 处处于于细细胞胞凋凋亡亡信信号号传传递递途途

21、径径的的上上游游，在在凋凋亡亡信信号号的的刺刺激激下下首首先先被被激激活活，然然后后再再水水解解激激活活下游的下游的caspase.caspase.（2 2）下游）下游/ /执行型执行型caspase: 3caspase: 3、 6 6 、7 7 处处于于细细胞胞凋凋亡亡信信后后传传递递途途径径的的下下游游，被被上上游游caspasecaspase激激活活后后直直接接水水解解与与细细胞胞凋凋亡亡有有关关的的底底物物蛋蛋白白，引引起起细细胞胞形形态态学学和和生生物物化化学学改改变变以以及及DNADNA的断裂。的断裂。3 Caspase3 Caspase的底物的底物1 1、细细胞胞骨骨架架蛋蛋白白

22、：核核纤纤层层蛋蛋白白、肌肌动动蛋蛋白白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白。核分裂相关蛋白等十几种蛋白。2 2、与与DNADNA损损伤伤修修复复相相关关的的蛋蛋白白质质和和酶酶，阻阻止止DNADNA损伤的修复。损伤的修复。 如如：DNADNA依依赖赖性性蛋蛋白白激激酶酶、DNADNA复复制制相相关关蛋蛋白。白。3 3、激活激活DNADNA酶酶，促进，促进DNADNA断裂。断裂。二、死亡受体及相关蛋白二、死亡受体及相关蛋白 是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：* * 死亡配体（细胞外）死亡配体（细胞外）死亡受体（细胞膜）死亡受体（细胞膜）相关蛋白（中介蛋白，细胞

23、内）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）激活激活caspase caspase 诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡1 1 死亡受体死亡受体(death receptor, DR)(death receptor, DR)死亡受体死亡受体是一类跨膜蛋白，与其配体结合后可是一类跨膜蛋白，与其配体结合后可把凋亡信号传递到细胞内部。把凋亡信号传递到细胞内部。主要的死亡受体是主要的死亡受体是TNF-RTNF-R超家族；超家族； 配体配体 死亡受体死亡受体 TNF- TNF-R1 TNF- TNF-R1 FasL Fas FasL Fas（CD95/APO-1CD95/APO-1） APO-3L DR-3 APO-3L DR

24、-3（WOL-1WOL-1） APO-2 DR-4 APO-2 DR-4（TRAIL-R1TRAIL-R1） TRAIL DR-5 TRAIL DR-5（TRAIL-R2TRAIL-R2） （TNFTNF相关的凋亡诱导配体，相关的凋亡诱导配体，TNF-related TNF-related apoptosis-inducing ligandapoptosis-inducing ligand）Death Domain-细胞凋亡细胞凋亡Fasassociated protein withdeath domainTNF receptor-1associated death domain protei

25、n Apoptosiscaspase激活的DNA酶（caspaseactivated deoxyribonuclease，CAD） ICAD（inhibitor of CAD） 2 2死亡受体相关蛋白死亡受体相关蛋白（中介蛋白（中介蛋白/ /接头蛋白）接头蛋白） 是是连连接接死死亡亡受受体体和和caspasecaspase的的中中介介蛋蛋白白，把把凋凋亡信号从死亡受体传递给亡信号从死亡受体传递给caspasecaspase。(1) (1) FADDFADD（ FasFas相相 关关 的的 死死 亡亡 结结 构构 域域 蛋蛋 白白 ， Fas Fas associated associated

26、death death domain domain protein)protein)由由两两部部分分构构成成, ,介导介导FasFas和和TNFRTNFR1 1两种受体的细胞凋亡信号两种受体的细胞凋亡信号: : A A 死亡结构域：与死亡结构域：与FasFas的的DDDD相互作用相互作用 B B 死死亡亡效效应应区区：与与启启动动型型caspase2caspase2、8 8、9 9、1010作用作用 (2) TRADD(2) TRADD（TNFR-1 TNFR-1 相关死亡结构域蛋白相关死亡结构域蛋白） 从从TNFR-1TNFR-1接接受受死死亡亡信信号号，然然后后传传递递给给FADD. FA

27、DD. This This protein protein can can also also interact interact with with receptor receptor FAS, FAS, and and is is involved involved in in the the Fas-Fas-induced cell death pathwayinduced cell death pathway 三、三、凋亡蛋白酶激活因子类凋亡蛋白酶激活因子类（apoptosis protease activation factor, Apafapoptosis protease act

28、ivation factor, Apaf）一一类类促促进进细细胞胞凋凋亡亡的的蛋蛋白白因因子子，参参与与细细胞胞凋凋亡亡的的线粒体信息传递途经。线粒体信息传递途经。细细胞胞凋凋亡亡与与线线粒粒体体膜膜电电位位及及通通透透性性改改变变有有关关。凡凡是是诱诱导导细细胞胞凋凋亡亡的的因因素素，都都可可使使线线粒粒体体的的膜膜电电位位下下降降，膜膜通通透透性性增增加加，线线粒粒体体膜膜通通透透性性转转运运孔孔（MPTMPT）开开放放，释释放放出出多多种种可可激激活活caspasecaspase的的蛋蛋白白因因子子，包包括括细细胞胞色色素素c(Cytc)c(Cytc)，凋凋亡亡诱诱导导因因子子(AIF)

29、(AIF)。 1 1 细胞色素细胞色素c c（CytcCytc）细胞色素细胞色素c c是呼吸链的重要成员，是由线粒体是呼吸链的重要成员，是由线粒体DNADNA编码的蛋白质。编码的蛋白质。细胞凋亡信号细胞凋亡信号 线粒体膜通透性增加，线粒体膜通透性增加，Cytc Cytc 释放到胞浆释放到胞浆 与与Apaf-1Apaf-1和和caspase-9caspase-9结合成复结合成复合体合体，诱导凋亡。，诱导凋亡。2 2 凋亡蛋白酶激活因子凋亡蛋白酶激活因子-1-1（Apoptotic Apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1protease act

30、ivating factor-1, Apaf-1） 在在正正常常情情况况下下Apaf-1Apaf-1以以无无活活性性的的单单体体存存在在于于细细胞胞质质，在在凋凋亡亡信信号号的的作作用用下下，其其N-N-端端与与Caspase-9Caspase-9结结合合，其其C C端端与与细细胞胞色色素素C C结结合合。形形成成Cytc-Apaf-1-Caspase-9 Cytc-Apaf-1-Caspase-9 复复合合体体-凋凋亡亡酶酶体体（apoptosome)apoptosome)。首首先先激激活活caspase-9caspase-9，然然后后激激活下游的活下游的caspase 3caspase 3

31、，6 6，7 7等，诱导细胞凋亡。等，诱导细胞凋亡。3 3 凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（Apoptosis Apoptosis inducing factor, AIFinducing factor, AIF） 凋凋亡亡诱诱导导因因子子是是一一类类存存在在于于线线粒粒体体内内外外膜膜间间隙隙的的保保守守的的黄黄素素蛋蛋白白，具具有有双双重重功功能能。在在细细胞胞正正常常的的生生理理状状态态下下，AIFAIF作作为为线线粒粒体体氧氧化化还还原原酶酶，能能催催化化细细胞胞色色素素c c（Cyt-cCyt-c）和和NADNAD之之间间的的电电子子传传递递，当当细细胞胞受受到到凋凋亡亡的的刺刺激激时时

32、，线线粒粒体体膜膜通通透透性性改改变变，AIFAIF从从 线线 粒粒 体体 转转 位位 到到 核核 内内 ， 与与 线线 粒粒 体体 蛋蛋 白白 质质endonuclease endonuclease G G (Endo (Endo G)G)一一起起引引起起细细胞胞染染色色体体的的凝聚和凝聚和DNADNA大的片段化大的片段化。apoptosis-inducing factor 四、四、Bcl-2Bcl-2家族家族 Bcl-2Bcl-2家家族族成成员员都都含含有有1-41-4个个Bcl-2Bcl-2同同源源结结构构域域（BH1-4BH1-4），并并且且通通常常有有一一个个羧羧端端跨跨膜膜结结构构

33、域域(transmembrane (transmembrane region region ,TM),TM)。其其中中BH4BH4是是抗抗凋凋亡亡蛋蛋白白所所特特有有的的结结构构域域，BH3BH3是是与与促促进进凋凋亡亡有有关关的的结结构构域域。根根据据功功能能和和结结构构可可将将Bcl-Bcl-2 2基基因因家家族族分分为为两两类类，一一类类是是抗抗凋凋亡亡的的（anti-anti-apoptoticapoptotic），如如：Bcl-2Bcl-2、Bcl-xlBcl-xl、Bcl-wBcl-w、Mcl-1Mcl-1；一一类类是是促促进进凋凋亡亡的的（pro-apoptoticpro-apo

34、ptotic），如如：BaxBax、BakBak、BadBad、BidBid、BimBim，在在促促凋凋亡亡蛋蛋白中还有一类仅含白中还有一类仅含BH3BH3结构，如结构，如BidBid、BadBad。（一）（一） Bcl-2 Bcl-2和和Bcl-xlBcl-xl1 1 为膜结合蛋白为膜结合蛋白2 2 降低线粒体膜通透性，抑制降低线粒体膜通透性，抑制CytcCytc、AIFAIF等释放。等释放。4 4 抑抑制制自自由由基基的的产产生生，抑抑制制氧氧化化剂剂对对细细胞胞凋凋亡亡的的诱诱导作用。导作用。5 5 许许多多抗抗癌癌药药物物如如紫紫杉杉醇醇可可使使bcl-2bcl-2磷磷酸酸化化而而失失

35、活活。从而诱导肿瘤细胞凋亡。从而诱导肿瘤细胞凋亡。6 6 HIVHIV病病毒毒蛋蛋白白水水解解酶酶可可水水解解Bcl-2, Bcl-2, 诱诱导导T T淋淋巴巴细细胞凋亡。胞凋亡。 虽虽然然Bcl-2Bcl-2蛋蛋白白存存在在于于线线粒粒体体膜膜、内内质质网网膜膜以以及及外外核核膜膜上上，但但主主要要定定位位于于线线粒粒体体外外膜膜，它它拮拮抗抗促促凋凋亡亡蛋蛋白白的的功功能能。而而大大多多数数促促凋凋亡亡蛋蛋白白则则主主要要定定位位于于细细胞胞质质，一一旦旦细细胞胞受受到到凋凋亡亡因因子子的的诱诱导导，它它们们可可以以向向线线粒粒体体转转位位，通通过过寡寡聚聚化化在在线线粒粒体体外外膜膜形形

36、成成跨跨膜膜通通道道 ，或或者者开开启启线线粒粒体体的的PTPT孔孔，从从而而导导致致线线粒粒体体中中的的凋凋亡亡因因子释放，激活子释放，激活caspasecaspase，导致细胞凋亡。，导致细胞凋亡。（二）（二） Bax Bax、Bcl-xsBcl-xs、BadBad1 1 BaxBax在在线线粒粒体体外外膜膜形形成成寡寡聚聚体体，形形成成通通道道使使线线粒粒体体膜膜的的通通透透性性增增加加，促促进进CytCCytC、Apat-1Apat-1等等的的释释放放，激活激活caspasecaspase，促进凋亡，促进凋亡 。2 2 当当细细胞胞内内BaxBax含含量量远远大大于于Bcl-2Bcl-

37、2和和BclBclxlxl时时，Bax Bax 自身形成的二聚体自身形成的二聚体BaxBaxBaxBax，可诱导细胞凋亡。，可诱导细胞凋亡。 3 3 在在凋凋亡亡信信号号作作用用下下，p53p53表表达达升升高高，p53p53进进一一步步诱诱导导BaxBax表达增加，诱导细胞凋亡。表达增加，诱导细胞凋亡。bcl-2bcl-2 二聚体抑制凋亡，二聚体抑制凋亡，促进细胞增殖促进细胞增殖baxbax 二聚体促进凋亡二聚体促进凋亡p53 p53 促进促进 baxbax 蛋白的合成蛋白的合成BcL-2BcL-2BcL-2BcL-2家族抑制和促进细胞凋亡两类蛋白的比例决定了细胞家族抑制和促进细胞凋亡两类蛋

38、白的比例决定了细胞家族抑制和促进细胞凋亡两类蛋白的比例决定了细胞家族抑制和促进细胞凋亡两类蛋白的比例决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡第三节第三节 细胞凋亡通路细胞凋亡通路目前发现细胞凋亡有目前发现细胞凋亡有3 3条通路：条通路：死亡受体通路死亡受体通路线粒体通路线粒体通路内质网通路内质网通路第三节第三节 细胞凋亡通路细胞凋亡通路1 1 死亡受体通路（外源性凋亡途经）死亡受体通路（外源性凋亡途经） 过过程程： 配配体体（TNF/FasL) TNF/FasL) 死死亡亡受受体体 接接头头蛋蛋白

39、白（FADD/ FADD/ TRADDTRADD） caspase-8(caspase-caspase-8(caspase-10) 10) 凋凋亡亡酶酶体体（apoptosome) apoptosome) caspase-8 caspase-8 (caspase-10)(caspase-10)自自身身切切割割激激活活 激激活活caspase-3 caspase-3 细胞凋亡。细胞凋亡。一、细胞凋亡的三条通路一、细胞凋亡的三条通路Death Domain-细胞凋亡细胞凋亡Fasassociated protein withdeath domainTNF receptor-1associated

40、death domain protein Apoptosis2 2 线粒体通路（内源性凋亡途经）线粒体通路（内源性凋亡途经）过过程程：活活性性氧氧（氧氧自自由由基基）/ / DNADNA损损伤伤 BaxBax穿穿入入线线粒粒体体膜膜 cyt cyt C C 漏漏出出线线粒粒体体 cyt cyt C C + + Apaf-1 Apaf-1 + + caspase-9 caspase-9 + + ATP ATP 凋凋亡亡酶酶体体（位位于于细细胞胞液液） caspasecaspase9 9自自身身切切割割激激活活 水水解解激激活活caspase-3 caspase-3 细胞凋亡细胞凋亡线粒体线粒体线

41、粒体线粒体- -细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡3 3 内质网通路内质网通路过程：过程：内质网（内质网（ER)ER)内内CaCa2+2+错误折叠的蛋白质积累错误折叠的蛋白质积累 ER ER膜上膜上BaxBax和和BakBak聚集聚集 激活膜上的激活膜上的caspase-12caspase-12（自我切割）（自我切割） 水解激活水解激活caspase-3 caspase-3 细胞凋亡细胞凋亡 二、细胞凋亡通路的调节二、细胞凋亡通路的调节1 1 1 1P53P53P53P53是是一一种种很很重重要要的的抑抑癌癌基基因因，其其蛋蛋白白产产物物是是转转录录因因子子，是是一一种种很很强强的的细细胞胞凋凋

42、亡亡诱诱导导因因子子。诱诱导导p21p21表表达达、抑抑制制细细胞胞增增殖殖。p53 p53 对对死死亡亡受受体体通通路路和和线线粒粒体体通通路路均均有有调调节作用。节作用。 p53p53p53p53 Bax bcl-2 Bax bcl-2 线粒体膜通透性增加线粒体膜通透性增加 细胞凋亡细胞凋亡 Fas Fas表达增加，表达增加，Fas-FADDFas-FADD复合物增加复合物增加细胞凋细胞凋 亡。亡。 2.2.Bcl-2Bcl-2家家族族对对线线粒粒体体通通路路和和内内质质网网通通路路有有调调节作用。节作用。 Bcl-2Bcl-2家家族族：（1 1）在在线线粒粒体体外外膜膜形形成成寡寡聚聚体

43、体，影影响响膜膜通通透透性性，影影响响凋凋亡亡；（2 2）聚聚集集在在内内质质网网膜膜上上，影影响响膜膜通通透透性性降降低低，影影响响内内质质网网内内钙钙离离子子积积累，影响细胞凋亡。累，影响细胞凋亡。第四节第四节 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测一、细胞凋亡的形态学检测一、细胞凋亡的形态学检测 1 1、光学显微镜和倒置显微镜光学显微镜和倒置显微镜（1 1）未未染染色色细细胞胞：凋凋亡亡细细胞胞的的体体积积变变小小、变变形形，细细胞胞膜膜完完整整但但出出现现发发泡泡现现象象，细细胞胞凋凋亡亡晚晚期期可可见见凋亡小体。凋亡小体。（2 2）染染色色细细胞胞：常常用用姬姬姆姆萨萨染染色色、瑞瑞氏氏染染色

44、色等等。凋凋亡亡细细胞胞的的染染色色质质浓浓缩缩、边边缘缘化化，核核膜膜裂裂解解、染染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。（放线菌素（放线菌素D D） 姬姆萨染色（肝组织）。A：对照组；B：处理组，凋亡细胞核染色质致密分布于核膜下。AB图1光学显微镜所见：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色400图2透射电子显微镜所见：箭头所示大量凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜80002、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(一种高级的荧光显微镜 ) 一般以细细胞胞核核染染色色质质形形态态学学改改变变为指标来评判细

45、胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特特异异性性染染料料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的的A-T碱碱基基区区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光蓝色荧光。 结果评判：细胞凋亡过程中细细胞胞核核染染色色质质的的形形态态学学改改变变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3、透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘 绕 ， 出 现 许

46、多 称 为 气 穴 现 象（cavitations）的空泡结构；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 （人外周血白血病T细胞）二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依依赖赖性性磷磷脂脂结结合合蛋蛋白白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或bioti

47、n标标记记，以标记了的Annexin-V作为荧荧光光探探针针，利用流流式式细细胞胞仪或荧光显微镜仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。Annexin V/PI双染色法双染色法 PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在结合在细胞膜表面作为凋亡的指示细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料以检测细胞膜完整性的检测方法。 碘化丙啶(pro

48、pidine iodide, PI)是一种核核酸酸染染料料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚晚期期细细胞胞和和死死亡亡细细胞胞，PI能够透过细胞膜而使细细胞胞核核红红染染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。结果判断结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。 三、线粒体膜势能检测三、线粒体膜势能检测 线线粒粒体体跨跨膜膜电电位位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞

49、核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线线粒粒体体跨跨膜膜电电位位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 JC-1染料在正正常常细细胞胞内聚集在线粒体内，形成多聚体，发发红红色色荧荧光光；而在凋凋亡亡细细胞胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发发绿绿色色荧荧光光。荧光显微镜或流式细胞仪检测。 用凋亡诱导剂诱导用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在细胞凋亡，在37，5%CO2培养箱培养箱培养培养46h，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析。进行检测，通过流式细胞仪分析。四、四、DNA片

50、断化检测片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂 , 形 成 50300kbp长长 的的 DNA大大 片片 段段 , 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段整数倍的寡核苷酸片段。 大分子染色体大分子染色体DNA片段的测定片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。其不不能能用用普普通通的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳来分离。泳来分离。通常采用脉冲电泳技术。脉冲电泳技术。 180200bp整整数数倍倍的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法

51、分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和和脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸末末端端转转移移酶酶使DNA标标记记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。五、末端转移酶标记技术五、末端转移酶标记技术 -TUNEL法法 细胞凋亡中, 染色体DNA双双链链断断裂裂或或单单链链断断裂裂而产生大量的3-OH末末端端，可在脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸末末端端转转移移酶酶的作用下，将脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸和和荧荧光光素素、过过氧氧化化物物酶酶、碱碱性性磷磷酸酸酶酶或

52、或生生物物素素形形成成的的衍衍生生物物标标记记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸末末端端转转移移酶酶介介导导的的缺缺口口末末端端标标记记法法（terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。正正常常的的或或正正在在增增殖殖的的细细胞胞几几乎乎没没有有DNA的的断断裂裂，没有没有3-OH形成，很少能够被染色形成，很少能够被染色。TUNEL技术检测技术检测BAK基因过表达后癌细胞凋亡基因过表达后癌细胞凋亡 TUNEL实际上是分分子子生生物物学学与

53、与形形态态学学相结合的研究方法，对完整的单单个个凋凋亡亡细细胞胞核核或或凋凋亡亡小小体体进行原原位位染染色色，能准确地反应细胞凋亡典型的生生物物化化学学和和形形态态特特征征，可用于石石蜡蜡包包埋埋组组织织切切片片、冰冰冻冻组组织织切切片片、培培养养的的细细胞胞和和从从组组织织中中分分离离的的细细胞胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。 六、六、Caspase-3活性检测活性检测 Caspase-3正常以酶酶原原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋凋亡亡的的早早期期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大大亚亚基基（17KD）和两个小小亚亚基基（

54、12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细细胞胞凋凋亡亡的的晚期和死亡细胞晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。1、Western blot 分析分析 分析Procaspase-3，活化的Caspase-3及其对底底物物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。2、荧光分光光度计分析荧光分光光度计分析原 理 ： 活 化 的 Caspase-3能 够 特 异 切 割D(Asp)1E(Glu)2V(Val)3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共共价

55、价偶偶联联时时，AMC不不能能被被激激发发荧荧光光，短短肽肽被被水水解解后后释释放放出出AMC，自自由由的的AMC才才能能被被激激发发发发射射荧荧光光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。七、酶联免疫吸附法七、酶联免疫吸附法(ELISA)(ELISA)核小体测定核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细细胞胞质质内内出出现现核核小小体体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含 有核小体2、在微定量板上吸附抗组蛋白抗体抗组蛋白抗体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加加辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶标记的抗抗DNA抗抗体体使之与核小体上的DNA结合5、加酶的底物，测光吸收。