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1、JournalofImmunologicalMethodsDevelopment and evaluation of a Luminex multiplex serology assay to detect antibodies to bovine herpesvirus1,parainfluenza 3 virus, bovine viral diarrhoea virus, and bovine respiratory syncytial virus, with comparison to existing ELISA detection methods SteveAnderson,Phi
2、lWakeley,GuyWibberley,KathWebster,JasonSawyer摘要在临床上，牛的疱疹病毒(BHV-1),副流感病毒(PI3V),腹泻病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的诊断和监测常用ELISA方法。目前利用Luminex技术在血清学检测的基础上同时检测几种病毒的所有抗体的方法已经成为发展趋势在Luminex体系中，病毒的抗原和荧光微球偶联，检测血清样品。ELISA检测作为对照。与单独的ELISA检测相比，BHV-14和PI3VLuminex的多重检测表现出相似的敏感性和特异性。BVDV和BRSV的检测不是很成功，可能因为这些抗原的信号强度较弱，不能有效
3、区分阳性和阴性样品。在Luminex体系中，BVDV的重组抗原在信号强度方面比未加工的BVDV抗原有所增加。研究背景牛传染性鼻气管炎由牛疱疹病毒(BHV-1)，副流感病毒(PI3V)，牛病毒性腹泻病毒（BVDV)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV）引起的牛的呼吸道传染病。BVDV和BHV-1也引起繁殖障碍，导致先天性流产和死胎。ELISA是常用的血清学检测方法，也适用于高通量筛选。在标准品阻断ELISA检测方法中所用的捕获抗原，是未经处理的病毒或来自组织培养病毒收获的细胞裂解液中纯化的病毒抗原，或者是纯化的具免疫原性的重组病毒蛋白但是ELISA方法的局限是在一个样品中只能使用一种生物素标记。因此，
4、同样的血清样品必须用几种单独的ELISA进行血清学检测在同样的测定体系中能够检测几种靶标的多重检测技术对常规的血清学检测将有利于减少人力和物力，是一种新型的实验室检测方法Luminex多重检测原理液相芯片（Liquid Array)检测系统是由聚苯乙烯材料所制作的大小均一的圆形微球（直径为5.6um)，在其制作过程中包覆不同比例的红光及红外光发色剂两种荧光染料，而产生100种不同比例颜色微球，每个微球都有独特的色彩编号，具有其独特的地址。100种微球可依不同研究目的而偶联100种探针（如抗原、抗体、核酸、酶、各种受体等），这样可以同时对一个待测样本中的100种不同的目标分子进行检测。在检测过程
5、中，微球单个逐一通过检测通道，微球通过检测通道时受到两束激光的同时照射，第一束635nm红色激光微球内部的突光物质，根据焚光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内这两种荧光物质比例不同，则荧光强度比率也不同，从而将不同的特异性反应区分开来（定性、分类）；第二束紫色激光激发报告分子上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子（如SA-PE)的数量，从而确定目标分子数量（定量）系统只记录与红色荧光同时出现的绿色荧光信号，不记录未结合的报告分子荧光信号。最后通过分析软件进行数字化处理，分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样木中有无
6、待检测病原体存在，或检测同时存在几种或数十种病原体。文章布局样品（阳性抗血清的制备；田间样品的采集）抗原制备ELISA检测抗原和Luminex微球的偶联（2步法）Luminex多重检测多重检测的可行性分析试验抗原的最佳稀释度确定阳性抗血清的特异性检测田间样品平行试验批内和批间的变异性分析BVDV的E2重组蛋白作为抗原的分析试验结果讨论2.11阳性抗血清的制备阳性对照抗血清来自试验感染的动物，BHV1抗血清来自断奶牛犊，鼻内或静脉接种BHV1的1和2亚型。BVDV抗血清来自于隔离培养的无特定病原体动物，鼻内和静脉注射BVDV的11亚型。BRSV和PI3V的阳性对照抗血清由疫苗接种获得。2.12田
7、间样品的采集实验组血清来自于一定区域内不同品种，不同饲养场，圈养或散养的牛群（公畜或母畜）采集对象为诊断有呼吸系统疾病动物：如腹泻，抑郁，消瘦等。以及一些有繁殖障碍或死亡的家畜2.2抗原制备BHV1, PI3V, BVDV和BRSV的病毒抗原来自于未处理的细胞增值的病毒。BHV1 (Oxford ED6株) , PI3 (TI 株)来自于牛肾细胞增值的的病毒， BRSV 来自牛肾单层细胞增值的病毒，BVDV来自小牛睾丸细胞增值的病毒，待细胞病变达到80-90时，收集病毒，1500 g离心，收取上清液。作为阳性抗原，阴性对照为没有增值病毒的细胞离心后的上清液。2.3ELISA检测（1）BHV1,
8、 PI3V, BVDV ，BRSV抗原及其对应的阴性对照抗原用包被缓冲液分别做1:1500, 1:900, 1:600 and 1:500稀释，每孔加60 ul。（2）4孵育过夜，用含0.05%Tween20的PBS冲洗酶标板3次，（3）每孔加入50ul1:100稀释的BHV 1, PI3V和BRSV，1:50稀释的BVDV的血清，实验组和阳性血清对照组每孔都分别做两个重复。BHV 1, PI3V 和 BRSV组室温避光孵育2h，BVDV37孵育1h（4）洗涤液冲洗酶标板5次。（5）每孔加入50ul辣根过氧化物酶标记的兔抗牛的二抗。（6）BHV1, PI3V和BRSV室温避光孵育1h。BVDV
9、 37孵育1h。（7）每孔加入50ulTMB37避光显色5-10min（8）每孔加入50 ul 2 M硫酸终止反应。（9）检测OD值2.4抗原和Luminex 微球的偶联2步法：包括微球活化，微球和抗原的偶联步法：包括微球活化，微球和抗原的偶联（1）BHV-1,PI3V,BVDV和BRSV和阴性对照样品用500ul的0.1M的PBS稀释（2）微球储存液超声漩涡震荡20s，取80ul（含106个微球）微球储存液于1.5ml的离心管（3）13,000g离心3min，超声20s（4）小心弃去上清（5）用0.1M的活化缓冲液磷酸盐清洗微球两次，然后用80ul的活化缓冲液悬浮微球（6）先后加入10ul新
10、鲜配制的Sulfo- NHS溶液(50mg/mL)、10ulEDC溶液(50mg/mL),混匀,室温避光振摇20min。（9）然后离心，弃上清。用含0.05%吐温的0.1MPBS（交联缓冲液）清洗两次，（10）加入阳性和阴性抗原稀释液，并用交联缓冲液补足体积至500ul。室温避光温和振荡2h。离心微球，弃上清。沉淀加入1ml交联缓冲液清洗两次。然后加入250ul封闭/贮存液重悬微球，4避光保存。2.5Luminex多重检测每孔加入100ul 储存缓冲液，500g离心30s偶联有BHV1,PI3V,BVDV和BRSV阳性和阴性抗原的8种微球14000g离心3min，超声漩涡震荡分散微球调整微球浓
11、度至8105beads/ml，在滤板的每个检测孔加入10稀释好的微球（每孔含偶联微球总个数约为8000个）。待检血清样品用稀释缓冲液（含0.05%吐温20,0.05%叠氮钠,1%鱼明胶的PBS）按300比例稀释，每个样品孔加入100，每个样品做孔重复；在对照孔中加入100ul阴性血清稀释液个）放置于平板混匀器，室温避光孵1h。每孔用100ul的缓冲液洗涤，500g离心30sLuminex多重检测每孔加入150稀释的生物素标记的鼠抗牛IgG抗体100ul。室温避光孵育1h。洗涤，每孔加入4ug/ul的链霉素藻红蛋白（SA-PE）100ul。放置于平板混匀器，室温避光孵育30min。每孔加入100
12、ul的洗涤缓冲液清洗两次，然后加入100ul的分析缓冲液重悬微球，Luminex检测，设置仪器每次只检测相应编码的荧光微球将反应板放入Luminex检测系统中读取每孔MFI值。BHV1,PI3,BVDV和BRSV与之偶联的微球编号分别为035,033,037和042，相应的阴性抗原偶联的微球分别为036,034,038和043。2.6多重检测的可行性试验在Luminex实验中，用未处理的细胞毒作为抗原在实验的可行性方面和ELISA做了一个比较。BHV1,PI3V,BVDV，BRSV抗原及其分别对应的阴性抗原用偶联缓冲液10倍稀释，分别和8种不同编号的微球偶联。4种病毒的阳性抗血清进行系列稀释，
13、每个稀释孔3个重复。然后用Luminex多重检测检测，平行试验用ELISA分别检测。2.7抗原稀释度的最优化在可行性实验中，与微球偶联的病毒抗原10倍稀释。为了确定病毒抗原稀释后是否能改善实验结果，和微球偶联前将抗原分别作10倍，100倍，500倍，1000倍稀释。结果用300倍稀释的BHV1,PI3，BRSV和BVDV的阳性抗血清进行检测。（抗原稀释后有利于田间样品检验。）2.8阳性抗血清的特异性检测BHV1,PI3V, BVDV 和BRSV阳性对抗血清的特异性检测，已在2.3和2.5中利用ELISA和Luminex技术进行了检测。2.9田间样品平行试验用Luminex和ELISA检测了30
14、6个田间样品，这些样品中至少包含100个阳性对照，和100个阴性对照样品，每个检样孔做两个重复。Luminex多重检测的平均荧光强度（MFI）为阳性样品产生的信号值减去阴性对照样品产生的荧光信号值。ROC曲线可最大限度的展示Luminex检测的敏感性和特异性。2.10批内和批间变异性分析将含针对四种抗原的阳性抗血清300倍稀释，分别进行7个单独的多重检测，每组设2-4个重复，一共21个重复。批内试验设置同批间试验，实验前田间样品已用ELISA检测，确保含有针对以上四种病毒的抗体。2.11BVDV的重组E蛋白作为抗原的检测BVDV的E2基因亚克隆到杆状病毒pBacPAK9载体，将杆状病毒和BVD
15、VE2基因共转染至Sf9昆虫细胞，表达重组蛋白。产生的重组蛋白用western blot方法，BVDV的特异性抗体检测。带His标签的重组E2蛋白用镍离子柱纯化。将重组的E2蛋白和阴性对照抗原，细胞培养获得病毒抗原分别做1:50,1:109，1:350稀释，偶联微球，和相同稀释度的BVDV的阳性抗血清反应，比较重组蛋白和BVDV未处理的细胞毒作为抗原产生的荧光信号值。Luminex技术对含有4种病毒的抗体的阳性抗血清的多重检测Fig. 1. Comparison of signals produced in the Luminex multiplex assay by the four ant
16、igens when testing pooled control antiserum dilutions (containing antibodies to all four antigens). MFI=median fluorescent intensity.Luminex和ELISA检测结果比较Fig. 2. Comparison of signals from the Luminex multiplex assay with the individual ELISA tests, generated from testing dilutions of a pooled control
17、 antiserum sample, containing antibodies to all four antigens. The dotted line represents the ELISA cut off.抗原最佳稀释度的确定（1/500forBHV1,1/100forPI3andBRSV,and1/10forBVDV）Fig.3.ChangesinsignalsresultingfromconjugationofdifferentdilutionsofantigentoLuminexbeadsandsubsequentreactionwithacontrolpooledantise
18、rumsample.Thenegativeantigenrepresentsthesignalproducedbynon-specificbinding.阳性抗血清的特异性检测用Luminex多重检测PI3V的抗血清时，BVDV出现了弱的信号，同样检BVDV的抗血清时，PI3V也出现了弱的信号。用单独的ELISA检测也证实了这一现象。不清楚是因为多重体系本身导致的非特异性交叉反应还是多重检测体系比较精确地检测到了非特异性抗体的存在。但是在检测临床样品时并没有发现很多交叉反应的现象，说明阳性抗血清中确实存在其它病毒的抗体，多重检测体系也精确检测到了此抗体的存在。以ELISA检测结果为标准，Lum
19、inex检测结果的ROC曲线分析Fig. 4. ROC curve analysis for the different tests within the Luminex multiplex assay using ELISA as the gold standard. The areas under the curve (AUC) are shown with the graphs.Table222boxesforeachtestwithintheLuminexmultiplexassay.Luminex相对ELISA检测的特异性和敏感性分析Table 3Diagnostic sensiti
20、vity and specificity of the four assays in the Luminex multiplex assay relative to the individual ELISA tests, determined after ROC analysis to set cut-off values.Luminex相对ELISA检测的特异性和敏感性分析Fig. 5. Scatter diagram illustrating the distribution of MFI signals for the different tests within in the Lumi
21、nex multiplex assay. Data points on the left of the graphs are ELISA negative samples; data points on the right of the graphs are ELISA positive samples.Luminex检测结果的散点图分布Table 4Within and between assay variation of the different assays in the Luminex Multiplex assay.BHV1和PI3V的批内和批间的变异系数（CV）低于10%，说明二
22、者的重复性较好批内和批间的变异性分析Fig. 6. Comparison of signal produced with BVDV recombinant E2 proteinand BVDV viral lysate antigen after testing a BVDV antiserum dilution serieson the Luminex platform.（1.）重组抗原在阳性血清做1：12150稀释时，产生的MFI和virallysateantigen在阳性血清做1:50稀释时产生的MFI值等同，在5000左右。（2.）在阳性抗血清做1:450稀释时，阴性对照抗原产生的MF
23、I有所减少，此时，重组抗原产生的MFI在3,0000左右具免疫原性的rE2不具免疫原性的rE2virallysateantigen阴性对照讨论1.我们利用Luminex体系建立和评估了检测牛四种病毒的抗体的血清学多重检测方法，2.利用细胞培养的病毒裂解物（ELISA检测中常用的抗原）作为抗原可以和微球有效偶联，ROC曲线可以将Luminex多重检测（相对ELISA检测结果）的结果敏感性和特异性上放大到最大化3.在Luminex检测中，BHV-1和PI3V抗原比PI3V和BRSV的抗原更有效。BVDVandBRSV诊断结果的不理想主要是因为MFI值较低，信噪比较弱。因此，和ELISA相比，阳性和
24、阴性样品BVDV和BRSV批内和批间的变异系数相对BHV1和P13的变异较高，主要归因于BVDVandBRSV产生的MFI值相对较低。较高的MFI值将可减少BVDVandBRSV.的变异系数，在检测PI3V阳性对照抗血清时，BVDV出现了弱的荧光信号。在检测BVDV阳性对照抗血清时，PI3V也出现了弱的荧光信号。不确定是多重检测体系本身产生的非特异性交叉反应，还是多重检测体系精确的检测到了存在的非特异性抗体。但是在检测田间样品时并未出现这种现象，可能阳性对照抗血清中确实存在其他病毒的抗体，而且多重检测体系也正确检测到了非特异性的抗体。讨论.本试验结果表明在ELISA中作用效果较好的细胞毒抗原，
25、在Luminex中检测时不一定能表现出好的效果。与Feng（2004）等人的研究结果一致。Khan et al(2006)也报道了类似的现象，Khan et al (2006)进一步指出和Luminex微球结合的裸露的抗原表位和ELISA不同：ELISA中抗原分子可利用的表面积相对更大，其浓度不受限制。相反，抗原分子在和Luminex体系中微球结合时，结合的趋近性和有效性将受到限制。不过也有文献认为Luminex为液相检测体系，对于抗原抗体的结合更有利。Feng等已证实重组蛋白抗原有利于提高检测的敏感性和特异性。本实验中单独检测了重组E2蛋白和未处理的细胞培养的病毒荧光信号（仅阳性抗血清）。但
26、并未将重组E2蛋白和其他病毒的抗原放在Luminex多重检测体系中进行检测，这也是下步实验的方向。Luminex检测体系优缺点优点Luminex为日常的血清学检测提供了一个平台，无需仪器点样，使使用者的消费相对减少，可实用性有所增加。缺点Luminex检测体系需要30-60min的读板时间，可能对检测任务繁忙的实验室应用有所限制相对于传统的ELISA检测，Luminex检测要求专业的技术人员进行操作。总结本实验表明，如果抗原已知，Luminex可用于血清学检测方法中血清抗体的多重检测。在ELISA检测中应用效果较好的抗原不能保证在Luminex检测中也出现较好的效果。重组抗原已被证实可克服未处理的细胞培养的病毒抗原的一些缺点。在以后的多重检测中，将结合重组蛋白和未处理的细胞培养的病毒进行比较试验。
