抗原抗体反应ppt课件

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1、第一章第一章 抗原抗体反应抗原抗体反应免疫学诊断技术概述免疫学诊断技术概述(4(4学时学时) )检测抗原制备技术检测抗原制备技术1 第一节第一节 抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的原理第二节第二节 抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点第三节第三节 影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素第四节第四节 免疫学检测技术的类型免疫学检测技术的类型2第一节第一节 抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的原理 抗原抗体反应，主要是指抗原和抗体在抗原抗体反应，主要是指抗原和抗体在体体外结合外结合所表现的反应。由于抗体主要存在所表现的反应。由于抗体主要存在于血清中，并且临床上多用血清做试验，于血清中，并且临床上多

2、用血清做试验，所以体外实验中的抗原抗体反应曾称作所以体外实验中的抗原抗体反应曾称作血血清学反应清学反应（serological reaction)serological reaction)。但。但是随着免疫学的发展，血清学的含义已不是随着免疫学的发展，血清学的含义已不能概括目前的研究内容，现在多以抗原抗能概括目前的研究内容，现在多以抗原抗体反应代替血清学反应一词。体反应代替血清学反应一词。 Ag:Antigen Ab:Antibody Ag:Antigen Ab:Antibody3第一节第一节 抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的原理 抗原抗体反应抗原抗体反应: :指抗原与相应抗体之间所指抗原与相

3、应抗体之间所发生的特异性结合反应。发生的特异性结合反应。 物质基础物质基础: : 抗原表位与抗体高变区间的互补结合抗原表位与抗体高变区间的互补结合 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合面的结合 抗原抗体之间的结合力抗原抗体之间的结合力 亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体4静电引力静电引力（electrostatic forces）范德华引力范德华引力:作用最小作用最小（van der Waals interactions）氢键氢键:最具特异性最具特异性（hydrogen bond ）疏水作用力疏水作用力:作用最大作用最大 （hydrophobic

4、interactions） 抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力示意图一、抗原抗体结合力一、抗原抗体结合力5l. l. 静电引力静电引力 抗原抗原和抗体分子带有相反电荷的和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧氨基和羧基基团基基团之间相互的引力，称为静电之间相互的引力，称为静电引力，引力，又称库伦又称库伦引力。引力。例如例如，抗体分子上带电荷的碱性氨基酸的游，抗体分子上带电荷的碱性氨基酸的游离氨基离氨基(-NH(-NH3+3+) )和和酸性氨基酸的游离羧基酸性氨基酸的游离羧基(-(-COOCOO- -) )可可与抗原分子上带相反电荷的对应基与抗原分子上带相反电荷的对应基团相互吸引。这种团相互吸引。这种引

5、力的大小与两个相互引力的大小与两个相互作用基团间的作用基团间的距离平方距离平方成反比。成反比。 62.2.范德华引力范德华引力 抗原和抗体相互接近时，由于抗原和抗体相互接近时，由于分子的极分子的极化作用化作用而出现的引力，称范德华引力。而出现的引力，称范德华引力。结合力的大小与两个相互作用基团的极化结合力的大小与两个相互作用基团的极化程度的乘积成正比、与它们之间距离的程度的乘积成正比、与它们之间距离的 7 7 次方成反比，键能约为次方成反比，键能约为4.2-12.5kJ/moL4.2-12.5kJ/moL。这种引力的能量小于静电引力。这种引力的能量小于静电引力。 73.3.氢键结合力氢键结合力

6、 供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力力。在抗原抗体反应中，羧基、氨基和。在抗原抗体反应中，羧基、氨基和羟基是主要供氢体，而羧基氧、羧基碳羟基是主要供氢体，而羧基氧、羧基碳和肽键氧等原子是主要受氢体。和肽键氧等原子是主要受氢体。氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的的6 6次方成反比，键能约次方成反比，键能约20.9kJ/mol20.9kJ/mol。 84.4.疏水作用力疏水作用力 两两个个疏疏水水基基团团在在水水溶溶液液中中相相互互接接触触时时，由由于于对对水水分分子子排排斥斥而而趋趋向向聚聚集集的的力力称称为为疏疏水水作用力

7、，或称为疏水键。作用力，或称为疏水键。当当抗抗原原抗抗体体反反应应时时，抗抗原原决决定定簇簇与与抗抗体体上上的的结结合合点点靠靠近近，互互相相间间正正、负负极极性性消消失失，由由静静电电作作用用形形成成的的亲亲水水层层立立即即失失去去，从从而而促促进进抗抗原原与与抗抗体体的的相相互互吸吸引引而而结结合合。疏疏水水作作用用力力在在抗抗原原抗抗体体反反应应中中的的结结合合是是很很重重要要的的。提提供供的的作作用用力力最最大大，约约占占总总结结合合力力的的50%50%。910抗体分子上一个抗抗体分子上一个抗原结合点与对应的原结合点与对应的抗原决定簇之间相抗原决定簇之间相适应而存在着的引适应而存在着的

8、引力，是力，是抗原抗体间抗原抗体间固有的结合力固有的结合力亲和力亲和力( (affinity)抗原抗体亲和力示意图抗原抗体亲和力示意图二、抗原抗体的亲和力和亲合力二、抗原抗体的亲和力和亲合力11抗体结合部位抗体结合部位与抗原表位之与抗原表位之间间结合的强度结合的强度亲合力亲合力( (avidity)抗原抗体亲合力示意图抗原抗体亲合力示意图12抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其 亲和常数亲和常数 K= K= 抗原抗体复合物浓度抗原抗体复合物浓度 游离抗原浓度游离抗原浓度游离抗体浓度游离抗体浓度K K代表抗体结合抗原的亲和力代表抗体结合抗原的亲和力。 K

9、K值值大大的的抗抗体体与与抗抗原原牢牢固固结结合合，不不易易解解离离，称该抗体有高亲和力。称该抗体有高亲和力。13三、三、亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体抗体和大多数抗原同属蛋白质。在通常的血抗体和大多数抗原同属蛋白质。在通常的血清学反应条件下均带有负电荷，使极化的水清学反应条件下均带有负电荷，使极化的水分子在其周围形成分子在其周围形成水化层水化层，成为，成为亲水胶体亲水胶体，因此蛋白质不会自行凝集出现沉淀。当因此蛋白质不会自行凝集出现沉淀。当AgAg与与AbAb结合后，表面电荷减少，水化层变薄；而结合后，表面电荷减少，水化层变薄；而且由于且由于Ag-AbAg-Ab复合物形成后，与

10、水接触的表复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体疏水胶体。此。此时在电解质时在电解质( (如如NaCl)NaCl)的作用下，使各疏水胶的作用下，使各疏水胶体之间进一步靠拢、沉淀，形成可见的体之间进一步靠拢、沉淀，形成可见的Ag-Ag-AbAb复合物。复合物。 14 可见反应可见反应抗原抗体复合物抗原抗体复合物 ( (疏水胶体疏水胶体) )电解质电解质 抗原抗原( (亲水胶体亲水胶体) ) 抗体抗体( (亲水胶体亲水胶体) ) + +三、三、亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体15第二节第二节 抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点特异性特异

11、性 可逆性可逆性比例性比例性 阶段性阶段性16特异性：特异性：抗原与抗体抗原与抗体结合反应的专一性结合反应的专一性抗原抗体反应特异性示意图抗原抗体反应特异性示意图分子基础分子基础: :抗原表位与抗抗原表位与抗体分子高变区之间空间体分子高变区之间空间构型的互补性构型的互补性一、特异性一、特异性17两种不同的抗原两种不同的抗原分子具有部分相分子具有部分相同或类似结构的同或类似结构的抗原表位，可与抗原表位，可与彼此相应的抗血彼此相应的抗血清发生反应清发生反应交叉反应交叉反应（cross reactions）抗原抗体交叉反应示意图抗原抗体交叉反应示意图18二、可逆性二、可逆性可逆性：可逆性：抗原与相应

12、抗体结合成复合物后，在抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性 影响因素：影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结亲合力越高，结合越牢固，越不易解离合越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响环境因素对复合物的影响pHpH、离子强度、离子强度 19 vAg与与Ab的结合常需适当比例才出现可见反应，的结合常需适当比例才出现可见反应，在最适比例时反应最明显；在最适比例时反应最明显；v 这种现象可以用这种现象可以用“格子学说格子学说”来解释：来解释：Ab(IgG)为二价，为二价，Ag通常为多价，只有

13、通常为多价，只有Ag，Ab结合形成大的复合物，肉眼才可见。结合形成大的复合物，肉眼才可见。三、比例性三、比例性20格子学说格子学说Myoglobin：肌红蛋白肌红蛋白21只有当只有当Ag与与Ab比例适当时，才能形成大的比例适当时，才能形成大的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而抑制反应现象的出现，此所谓物而抑制反应现象的出现，此所谓带现象带现象；前带现象前带现象：AbAb过剩，过剩，AgAg过少；过少； 稀释稀释AbAb，凝集反应常见；，凝集反应常见；后带现象后带现象：AgAg过剩，过剩，AbAb过少；过少； 稀释稀释AgAg、沉淀反应常见。、沉淀反

14、应常见。22前带现象前带现象后带现象后带现象23前带前带(prezone)：抗体过量：抗体过量后带后带(postzone)：抗原过量：抗原过量等价带等价带(equivalence zone)(equivalence zone)： 抗原抗体比例合适抗原抗体比例合适 抗原抗体反应比例性示意图抗原抗体反应比例性示意图比例性：比例性：抗原与抗体抗原与抗体发生可见反应需遵循发生可见反应需遵循一定的量比关系一定的量比关系三、比例性三、比例性24第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集

15、、 沉淀和细胞溶解等现象沉淀和细胞溶解等现象 四、阶段性四、阶段性25第三节第三节 影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素抗原、抗体反应物的自身因素抗原、抗体反应物的自身因素环境因素环境因素26一、反应物自身因素一、反应物自身因素抗原抗原: :理化性状、表位种类和数目理化性状、表位种类和数目抗体抗体: :来源、特异性、亲和性、效价来源、特异性、亲和性、效价271 1、抗原、抗原 抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均可影响血清学反应结果均可影响血清学反应结果 例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗

16、原与相应抗体反应则出现凝集；而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集；单价抗原与抗体结合不出现可见反应；粗糙单价抗原与抗体结合不出现可见反应；粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与IgGIgG类抗体结合不出现直接凝集等。类抗体结合不出现直接凝集等。 一、反应物自身因素一、反应物自身因素28抗体对抗体对反应的影响表现在以下三个方面反应的影响表现在以下三个方面: : ( (1)1)来源来源: :来自不同动物的免疫血清，其反来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时清具

17、有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现才易出现可溶性免疫复合物；马可溶性免疫复合物；马等大动物等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物；可溶性免疫复合物；家禽家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（并且在高盐浓度（8.5% NaCl8.5% NaCl）溶液）溶液中沉中沉淀现象明显。淀现象明显。单克隆抗体一般不适用于沉单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应淀反应或凝集反应。 2 2、抗体、抗体29(2)(2)特异性与亲和力特异性与亲和力: :特特异异性性

18、和和亲亲和和力力是是影影响响血血清清学学反反应应的的两两个个关关键键因因素素，它它们们共共同同影影响响试试验验结结果果的的准准确确程度。程度。免免疫疫动动物物早早期期获获得得的的抗抗血血清清特特异异性性较较好好，但但亲亲和和力力低低；后后期期获获得得的的抗抗血血清清一一般般亲亲和和力力较较高高，但但长长期期免免疫疫易易使使免免疫疫血血清清中中抗抗体体的类型和反应性变得更为复杂。的类型和反应性变得更为复杂。因因此此，用用于于诊诊断断的的试试剂剂必必须须尽尽量量选选用用特特异异性性高高、亲亲和和力力强强的的抗抗体体，才才能能保保证证和和提提高高试验结果的可靠性。试验结果的可靠性。 30（3 3）浓

19、度）浓度: :抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合适的浓度才出现明显的反应现象。因此适的浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行抗体预滴定，找出最适许多试验应进行抗体预滴定，找出最适反应浓度。反应浓度。 31 l.l.电解质电解质 抗抗原原抗抗体体结结合合后后由由亲亲水水性性变变为为疏疏水水性性，此此时时易易受受电电解解质质影影响响，如如有有适适当当浓浓度度电电解解质质存存在在，就就会会使使抗抗原原抗抗体体失失去去一一部部分分电电荷荷而而相相互互凝凝集集或或沉沉淀淀，出出现现可可见见反反应应; ;若若无无电电解解质质存存在在，则则不不出出现现可可见见反反应应

20、。通通常常在在血血清清学学试试验验中中，以以8.5% 8.5% NaClNaCl溶溶液液作作为为抗抗原原抗抗体体的的稀稀释释液液及及反反应应液液，其其中中NaNa+ +和和ClCl- -可可分分别别中中和和胶胶体体颗颗粒粒上上的的电电荷荷，使使胶胶体体颗颗粒粒的的电电势势下下降降，形形成成可可见见的的沉沉淀淀物物或或凝凝集集物物。但但如如果果电电解解质质浓浓度度过过高高，则则会会出出现现非非特特异性蛋白质沉淀，即盐析异性蛋白质沉淀，即盐析。二、环境因素二、环境因素32332 2. .酸碱度酸碱度 合适合适的的pHpH是抗原抗体反应的必要条件之是抗原抗体反应的必要条件之一。血清学试验一般以一。血

21、清学试验一般以pH6-9pH6-9为宜，超出为宜，超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质，此范围可影响抗原和抗体的理化性质，导致假阳性或假阴性结果。当导致假阳性或假阴性结果。当pHpH为为3 3左右左右时，接近细菌抗原的等电点，可出现非时，接近细菌抗原的等电点，可出现非特异性酸凝集，造成假象。特异性酸凝集，造成假象。 34353 3. .温度温度 抗抗原原抗抗体体反反应应一一般般在在15-4015-40范范围围内内均均可可进进行行，最最适适温温度度为为3737。在在此此范范围围内内温温度度越越高高，分分子子运运动动速速度度加加快快，增增加加抗抗原原抗抗体体接接触触机机会会，反反应应速速度度越越快

22、快，但但亦亦容容易易引引起起复复合合物物解解离离; ;温温度度越越低低，反反应应速速度度缓缓慢慢，但但抗抗原原抗抗体体结结合合牢牢固固，易易于于观观察察。某某些些特特殊殊的的抗抗原原抗抗体体反反应应需需要要特特定定的的温温度度，如如冷冷凝凝集集素素在在44时时与与红红细细胞胞结结合合，2020以以上上反反而而解解离离。36374 4、作用时间、作用时间 抗原抗体反应应有足够的时间，不同反抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。应时间不同。38 此外，抗原抗体反应在液相中反应时，此外，抗原抗体反应在液相中反应时，适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触，

23、加速反应。子的接触，加速反应。 39电解质电解质: : 生理盐水或缓冲液生理盐水或缓冲液酸碱度酸碱度: pH6pH9温温 度度: 1540，37最适最适二、环境因素二、环境因素40反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断凝集反应凝集反应 直接凝集试验直接凝集试验观察凝集现象观察凝集现象间接凝集试验间接凝集试验同上同上抗球蛋白试验抗球蛋白试验同上同上沉淀反应沉淀反应 液相沉淀试验液相沉淀试验观察沉淀，检测浊度观察沉淀，检测浊度免疫电泳技术免疫电泳技术观察扫描沉淀峰、沉淀弧观察扫描沉淀峰、沉淀弧补体参与补体参与的反应的反应补体溶血试验补体溶血试验观察测定溶血现象观察测定溶血现象补体结合试验

24、补体结合试验同上同上第四节第四节 免疫学检测技术的类型免疫学检测技术的类型41反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断中和反应中和反应病毒中和试验病毒中和试验检测病毒感染性检测病毒感染性毒素中和试验毒素中和试验检测外毒素毒性检测外毒素毒性标记免疫反应标记免疫反应荧光免疫技术荧光免疫技术检测荧光现象检测荧光现象放射免疫技术放射免疫技术检测放射性强度检测放射性强度酶免疫技术酶免疫技术检测酶底物显色检测酶底物显色发光免疫技术发光免疫技术检测发光强度检测发光强度金免疫技术金免疫技术检测金颗粒沉淀检测金颗粒沉淀42n原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如果二者相应，则可在抗原、抗体两液接触界面形成

25、白色的沉淀环环状沉淀反应试验组阳性对照组 阴性对照组43n 原理：原理： 可溶性可溶性Ag与与Ab在含有电解质的半固体（在含有电解质的半固体（1%）琼）琼脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相遇处遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相遇处形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于组成它的组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而对其它具有特异地不可透过性，而对其它的的Ag与与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代表一种是可透过的，所以一条沉淀带仅代表

26、一种AgAb系统的沉淀物。系统的沉淀物。双向琼脂扩散试验4445检测抗原制备技术检测抗原制备技术抗原是一类能刺激机体免疫系统产生特异抗原是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物性免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外发生特（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性反应的物质，或称免疫原。异性反应的物质，或称免疫原。完全抗原完全抗原:反应原性反应原性+免疫原性免疫原性半抗原半抗原(不完全抗原不完全抗原):只具备反应原性而无只具备反应原性而无免疫原性的物质。免疫原性的物质。46来源于病原体及其病原体的代谢、分泌和来源于病原体及其病原体的代谢、分泌和排

27、泄物等排泄物等天然抗原天然抗原，均可作为良好的检测，均可作为良好的检测抗原。抗原。其种类，因病原体的种株不同而异。微生其种类，因病原体的种株不同而异。微生物中的衣原体、支原体、细菌、螺旋体、物中的衣原体、支原体、细菌、螺旋体、立克次体、真菌和放线菌等病原体表层结立克次体、真菌和放线菌等病原体表层结构蛋白以及各种外毒素、内毒素和酶等毒构蛋白以及各种外毒素、内毒素和酶等毒力因子，噬菌体、病毒的各种结构蛋白，力因子，噬菌体、病毒的各种结构蛋白，如衣壳蛋白、包膜上的各种糖蛋白、基质如衣壳蛋白、包膜上的各种糖蛋白、基质蛋白以及病毒编码的复制酶等均是良好的蛋白以及病毒编码的复制酶等均是良好的检测抗原。检测

28、抗原。47大多数寄生虫是多细胞生物，其抗原具有大多数寄生虫是多细胞生物，其抗原具有复杂性、多源性，同时又具有种属和生活复杂性、多源性，同时又具有种属和生活史不同期的特异性。来源于虫体结构性物史不同期的特异性。来源于虫体结构性物质的虫体抗原、虫体排泄物和分泌物中的质的虫体抗原、虫体排泄物和分泌物中的蛋白或多蛋白或多肽肽类、糖脂或多糖等代谢性抗原类、糖脂或多糖等代谢性抗原以及生活虫体排放或脱落到宿主体内可出以及生活虫体排放或脱落到宿主体内可出现于血循环的现于血循环的大分子大分子微粒性循环抗原等均微粒性循环抗原等均可作为检测抗原。可作为检测抗原。抗生素抗生素等药物因其分子量较小，不具有抗等药物因其分

29、子量较小，不具有抗原性。原性。与牛血清白蛋白等大分子偶联后才与牛血清白蛋白等大分子偶联后才具有完全抗原的特性具有完全抗原的特性。48来源于自然感染或人工感染以及人工培养来源于自然感染或人工感染以及人工培养病原生物体的生物大分子物质，如蛋白质、病原生物体的生物大分子物质，如蛋白质、多肽、酶类等，必须进行多肽、酶类等，必须进行分离纯化分离纯化，才能，才能作为特异性较好的检测抗原。作为特异性较好的检测抗原。分离纯化方法有选择性沉淀法、有机溶剂分离纯化方法有选择性沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、电泳法、超速离沉淀法、等电点沉淀法、电泳法、超速离心法、层析法等。心法、层析法等。其中用于蛋白质和酶的

30、提取，多采用选择其中用于蛋白质和酶的提取，多采用选择性沉淀法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀性沉淀法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法。法。49（一）分离纯化法（一）分离纯化法（1）饱和硫酸铵法）饱和硫酸铵法：盐析沉淀法是经典的：盐析沉淀法是经典的蛋白质和酶纯化分离技术。最常用的方法蛋白质和酶纯化分离技术。最常用的方法是以是以33%50%的饱和硫酸铵依次沉淀的饱和硫酸铵依次沉淀3次。次。将盐析沉淀后的蛋白质溶液装入透析袋中，将盐析沉淀后的蛋白质溶液装入透析袋中，用蒸馏水或缓冲液，用蒸馏水或缓冲液，4冰箱内进行透析，冰箱内进行透析，更换蒸馏水或缓冲液更换蒸馏水或缓冲液3次，直至袋内盐充分次，直至袋内盐充

31、分透析除尽为止。此外，亦可用葡聚糖凝胶透析除尽为止。此外，亦可用葡聚糖凝胶层析法脱盐。层析法脱盐。50（一）分离纯化法（一）分离纯化法（2）有机溶剂沉淀法：常用乙醇或丙酮，）有机溶剂沉淀法：常用乙醇或丙酮，加入时应搅拌均匀，加入时应搅拌均匀，pH值大多控制在待值大多控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，置沉淀蛋白质的等电点附近，置4冰箱内冰箱内进行进行。（3）分子筛层析法：）分子筛层析法：又称凝胶过滤法，它是利用分子筛将抗又称凝胶过滤法，它是利用分子筛将抗原分成大、中、小三种类型。特别是经过原分成大、中、小三种类型。特别是经过初步纯化后的蛋白质和酶抗原采用此种方初步纯化后的蛋白质和酶抗原采用此种方法

32、进一步纯化，效果尤为显著。法进一步纯化，效果尤为显著。51（一）分离纯化法（一）分离纯化法（4）亲和层析法：亲和层析法则是利用生）亲和层析法：亲和层析法则是利用生物大分子的生物学特异性而设计的层析分物大分子的生物学特异性而设计的层析分离技术。例如抗原抗体、酶和酶抑制剂或离技术。例如抗原抗体、酶和酶抑制剂或配体、酶蛋白和辅酶、配体、酶蛋白和辅酶、DNA和和RNA、激、激素和受体等之间具有特殊的亲和力，在一素和受体等之间具有特殊的亲和力，在一定条件下，二者能紧密结合形成复合物。定条件下，二者能紧密结合形成复合物。如果将其中的一方面固定在载体上，则可如果将其中的一方面固定在载体上，则可从溶液中提取和

33、分离相应的另一方。亲和从溶液中提取和分离相应的另一方。亲和层析可以达到很高的纯度。有时仅需进行层析可以达到很高的纯度。有时仅需进行一步纯化即可达到纯化的目的。一步纯化即可达到纯化的目的。52（二）抗原定性鉴定（二）抗原定性鉴定纯化蛋白质抗原的定性鉴定常用的方法纯化蛋白质抗原的定性鉴定常用的方法有有：免疫电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等免疫电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质抗原浓度的定量测定可用双缩纯化蛋白质抗原浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法。脲法、酚试剂法或紫外光吸收法。53（三）抗原的浓缩（三）抗原的浓缩（1）纯化后的抗原常用聚乙二醇纯化后的抗原常用聚乙二醇（PEG）、凝胶

34、和蔗糖等吸收剂进行）、凝胶和蔗糖等吸收剂进行浓缩浓缩。使用使用PEG或蔗糖吸收剂时，先将生物大分或蔗糖吸收剂时，先将生物大分子溶液装入透析袋里，扎紧袋口，外加吸子溶液装入透析袋里，扎紧袋口，外加吸收剂覆盖，袋内溶剂渗出被吸收剂吸去，收剂覆盖，袋内溶剂渗出被吸收剂吸去，吸收剂被溶剂饱和后，亦可更换，直至浓吸收剂被溶剂饱和后，亦可更换，直至浓缩至所需浓度为止。吸收剂可经加热除去缩至所需浓度为止。吸收剂可经加热除去吸收的水分后再次使用。将生物大分子溶吸收的水分后再次使用。将生物大分子溶液装入透析袋，扎紧袋口，然后将透析袋液装入透析袋，扎紧袋口，然后将透析袋置电扇旁吹风，促使水分缓慢蒸发，可起置电扇旁

35、吹风，促使水分缓慢蒸发，可起到浓缩作用。到浓缩作用。54（三）抗原的浓缩（三）抗原的浓缩（2）超滤浓缩是使用一种特定孔径的超滤浓缩是使用一种特定孔径的滤膜滤膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。溶液在一定压力下通过滤膜时，溶方法。溶液在一定压力下通过滤膜时，溶液和小分子物质可以通过，而大分子仍保液和小分子物质可以通过，而大分子仍保留于原来的溶液中。留于原来的溶液中。超滤浓缩尤其适用于蛋白质和酶的浓缩和超滤浓缩尤其适用于蛋白质和酶的浓缩和脱盐，并可用于生物大分子的分离纯化。脱盐，并可用于生物大分子的分离纯化。55（四四）抗原的保存）抗原的保存浓缩抗原可用

36、于液态或干燥状态低温保存。浓缩抗原可用于液态或干燥状态低温保存。液态贮存样品浓缩至一定浓度后封装储存液态贮存样品浓缩至一定浓度后封装储存，并并应有严格的防腐措施应有严格的防腐措施。常用防腐剂有甲苯、氯仿、常用防腐剂有甲苯、氯仿、叠氮钠叠氮钠、硫柳汞硫柳汞等。等。常用的稳定剂有甘油、蔗糖等。常用的稳定剂有甘油、蔗糖等。低温干燥保存低温干燥保存：将抗原冻干，于将抗原冻干，于04保存保存。56小结小结 抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。的特异性结合反应。 抗原抗体之间的结合力涉及静电引力、范德华抗原抗体之间的结合力涉及静电引力、范德华引

37、力、氢键和疏水作用力。引力、氢键和疏水作用力。 抗原抗体反应的特点是特异性、可逆性、比例抗原抗体反应的特点是特异性、可逆性、比例性和阶段性。性和阶段性。 影响抗原抗体反应的因素包括反应物的自身因影响抗原抗体反应的因素包括反应物的自身因素和环境因素。素和环境因素。 免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应，免疫免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应，免疫学技术有凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、学技术有凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、中和反应和标记免疫反应五种类型。中和反应和标记免疫反应五种类型。571 1什么是抗原抗体反应？什么是抗原抗体反应？ 抗原抗体反应的原理是什么？抗原抗体反应的原理是什么？

38、 2 2抗原抗体的结合力有哪些？抗原抗体的结合力有哪些？3 3抗原抗体反应有哪些特点？抗原抗体反应有哪些特点？ 4 4如何理解抗原抗体反应的特异性和交叉反应？如何理解抗原抗体反应的特异性和交叉反应？5 5什么是抗原抗体反应的可逆性？有何应用？什么是抗原抗体反应的可逆性？有何应用？6 6如何理解抗原抗体反应的亲和力和亲合力？如何理解抗原抗体反应的亲和力和亲合力？7 7抗原抗体反应体系中为何要确定抗原、抗体的最适比例？抗原抗体反应体系中为何要确定抗原、抗体的最适比例？ 8 8抗原抗体反应有哪些影响因素？抗原抗体反应有哪些影响因素？9 9基于抗原抗体反应的免疫学检测技术有哪些？基于抗原抗体反应的免疫学检测技术有哪些？1010抗原常用的分离纯化法有哪些？抗原常用的分离纯化法有哪些？思考题思考题58