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1、神经电生理与膜片钳技术神经电生理与膜片钳技术一、基本概念一、基本概念二、离子通道的结构二、离子通道的结构三、离子通道的主要类型三、离子通道的主要类型四、离子通道的主要研究方法四、离子通道的主要研究方法五、离子通道相关疾病五、离子通道相关疾病六、膜片钳技术六、膜片钳技术二、神经电生理与膜片钳技术二、神经电生理与膜片钳技术Equilibrium potentialsThe electrical potential difference that exactly balances an ionic concentration gradient is called an ionic equilibri
2、um potential, or simply equilibrium potential (当离子移动所产生的电位差和离子移动所造成的浓度势能差平衡时，不再有离子的净移动，这时膜两侧的电位差称为离子的平衡电位)Generating a steady electrical potential difference across a membrane requires An ionic concentration gradient Selective ionic permeability25The most potassium channels have four subunits that a
3、re arranged like the staves of a barrel to form a poreOf particular interest is a region called the pore loop (孔袢孔袢), which contributes to the selectivity filter that makes the channel permeable mostly to K+ ions.K 离子通道离子通道Two protective mechanisms in the brainBlood-brain barrier (血脑屏障) limits the m
4、ovement of potassium (and other blood-borne substances) into the extracellular fluid of the brainGlia, particularly astrocytes, take up extracellular K+ whenever concentrations rise, as they normally do during periods of neural activity.Potassium spatial buffering by astrocytes.When brain K+o increa
5、ses as a result of local neural activity, K+ enters astrocytes via membrane channels. The extensive network of astrocytic processes helps dissipate the K+ over a large area.40KCNQ钾离子通道钾离子通道-基因类型基因类型KCNQ钾离子通道钾离子通道-调控机制调控机制KCNQ钾离子通道钾离子通道-药物开发药物开发Jervell-Lange-Nielsen综合征(JLNS)Jervell-Lange-Nielsen综合征(J
6、LNS)是一种罕见的遗传性心脏、听觉异常综合征.表现为感觉神经性耳聋、QT间期延长、异常T波和室性心动过速,大多为常染色体隐性遗传.报道对一个JLNS家系KCNQ1基因扫描及发现其突变形式.方法该家系成员共13例,经仔细询问病史、体格检查、做同步12导联心电图、超声心动图,采集静脉血标本,提取基因组DNA.PCR扩增KCNQ1 基因各外显子及相邻内含子部分序列,直接测序分析筛查基因突变点. 结果发现家系中6例KCNQ1发生单一杂合突变,第917个核苷酸G变为T,导致代表甘氨酸残基的第306密码子突变为缬氨酸残基(G306V),家系中正常人和50例正常对照无此突变.结论首次发现KCNQ1单一杂合
7、突变导致JLNS,提示不仅KCNQ1纯合突变和复合杂合突变能够导致JLNS,而且KCNQ1单一杂合突变也可以导致JLNS. 遗传性长QT综合征遗传性长QT综合征亦称遗传性QT间期延长综合征，是一种常染色体遗传性心脏病。该病多见于儿童和年轻人，临床上表现为心慌、晕厥、抽搐甚至猝死。死亡率高，未经治疗的患者10年死亡率达50。患者大多在运动（如跑步、游泳等）或情绪激动（如恐惧、生气和惊吓）时犯病，常被误诊为癫痫。近年来，随着分子遗传学的发展，已明确遗传性长QT综合征是由于编码离子通道蛋白的基因异常造成的。目前已发现6种类型，第13型的基因致病分别为KCNQ1、HERG和SCN5A，第56型分别为K
8、CNE1和KCNE2，第4型基因尚不明确。许多猝死患者的病因是遗传性心脏病。 运动可以降低遗传性心脏病的风险。 Liddle综合征综合征Liddle综合征又称假性醛固酮增多症，是1963年Liddle等首先报告，故称为Liddle综合征。本病的特征是：严重的高血压、低钾血症、代谢性碱中毒、低肾素血症。临床症状与醛固酮增多症相似，但是醛固酮分泌率很低，对螺内酯治疗无反应对氨苯蝶啶或限盐治疗有效。本病呈常染色体显性遗传，本病的病变部位在集合管，对钠重吸收增加，排钾泌氢增多，属全身性遗传性钠转运异常性疾病。 囊肿性纤维化囊肿性纤维化 (Cystic fibrosis) 囊性纤维化跨膜转运调节体(cy
9、stic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)是ATP结合转运体超家族(ATP-binding cassette transporter superfamily)的一名特殊成员,因为它是一个具有相当复杂调控机制的氯离子通道 。CFTR的活动与细胞代谢有紧密联系:CFTR与代谢酶形成大分子复合体,当细胞能量需求增加时,CFTR活动会受到抑制而使细胞能量得以保存.CFTR广泛分布于机体上皮组织,它通过促进水盐转运而控制上皮细胞分泌物的量与组成.值得注意的是,在呼吸道,CFTR还对机体的防御机制起重要作用.CFTR功能失常严重影响跨上皮
10、离子转运,进而引起或加重某些疾病. 囊肿性纤维化是遗传疾病，目前仍未有治疗的方法。囊肿性纤维化可能会影响身体多处，其中以肺部和消化系统所受的影响最为严重。 白种人最常患上囊肿性纤维化。大约每2,500个初生婴儿中，便有一个会患上这种基因遗传疾病。非洲人和亚裔人患上此病则较少。 囊肿性纤维化囊肿性纤维化 (Cystic fibrosis) 1. 肺部及呼吸道感染肺部及呼吸道感染2. 消化道、肝脏、及胰脏方面疾病消化道、肝脏、及胰脏方面疾病3. 内分泌疾病及成长发育方面内分泌疾病及成长发育方面4. 不孕不育不孕不育诊 断 大约每五个患者之中，便有一个在出生时即被诊断为患有囊肿性纤维化。大约每五个患
11、者之中，便有一个在出生时即被诊断为患有囊肿性纤维化。 他们的肠道被大量黏稠的胎粪阻塞（在正常情况下他们的肠道被大量黏稠的胎粪阻塞（在正常情况下, 每个每个婴儿婴儿出生后不久，出生后不久，都会将黑色焦油般的排泄物排出体外），这种情况可能需要动手术。都会将黑色焦油般的排泄物排出体外），这种情况可能需要动手术。约有一半患有囊肿性纤维化的患者在婴孩时证实染有此病，这是由于他们约有一半患有囊肿性纤维化的患者在婴孩时证实染有此病，这是由于他们没有像正常的婴孩般生长或增加体重。这是由于没有像正常的婴孩般生长或增加体重。这是由于胰脏胰脏未能制造所需的化学未能制造所需的化学物质物质酶。酶会在食物离开胃部时进入肠
12、道；没有酶，食物中的脂肪便不酶。酶会在食物离开胃部时进入肠道；没有酶，食物中的脂肪便不能消化。由于脂肪在消化前已直接排出肠道，患有此病症的小孩不能吸取能消化。由于脂肪在消化前已直接排出肠道，患有此病症的小孩不能吸取脂肪中的热量和营养，即使正在发育，体重也难以增加。此外，由于粪便脂肪中的热量和营养，即使正在发育，体重也难以增加。此外，由于粪便中有大量脂肪，故患者的大便通常十分油腻，而且发出恶臭。中有大量脂肪，故患者的大便通常十分油腻，而且发出恶臭。约有一半患有囊肿性纤维化的人会重复感染胸腔感染和肺炎。约有一半患有囊肿性纤维化的人会重复感染胸腔感染和肺炎。诊断及追踪诊断及追踪 诊断囊肿性纤维化的方
13、法包括新生儿检验、诊断囊肿性纤维化的方法包括新生儿检验、汗液汗液氯氯钠钠电解质电解质浓度检验、以及浓度检验、以及基因基因检验等测试检验等测试方法。目前在美国国内，有方法。目前在美国国内，有10%的患者是在出生后马上进行的新生儿检验时被诊断出患有囊的患者是在出生后马上进行的新生儿检验时被诊断出患有囊肿性纤维化的病症，在这些肿性纤维化的病症，在这些婴儿婴儿的体内都有一致的的体内都有一致的胰蛋白（胰蛋白（Trypsin）过高）过高的检验结果。由于的检验结果。由于在许多地方囊肿性纤维化的检验并不是例行的新生儿检验的一部分，因此大部分的患者都是在许多地方囊肿性纤维化的检验并不是例行的新生儿检验的一部分，
14、因此大部分的患者都是在囊肿性纤维化的症状出现后才就医发现患有此病。在囊肿性纤维化的症状出现后才就医发现患有此病。在对非新生儿做测试时，最常用的检验方法是在对非新生儿做测试时，最常用的检验方法是汗液汗液检验法；受试者会被接上电极连接到测试检验法；受试者会被接上电极连接到测试仪器以及被刺激排汗，这个过程称为离子电渗疗法（仪器以及被刺激排汗，这个过程称为离子电渗疗法（Iontophoresis），之后测试人员会对收），之后测试人员会对收集到的受试者的汗液进行汗液中集到的受试者的汗液进行汗液中钠钠与与氯氯的含量测验的含量测验，而汗液中含有过高的钠氯含量则代表该而汗液中含有过高的钠氯含量则代表该受试者患
15、有囊肿性纤维化病症。受试者患有囊肿性纤维化病症。除了汗液检验法之外，基因检验法也可以由确认CFTR基因是否有突变来诊断。膜片钳技术膜片钳技术膜片钳技术（膜片钳技术（patch clamp）1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 意意 义义膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一具有重大意义的变革。这是一
16、种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个）的离子通道分子活动的技术。此技术的出现自然将细胞水平和分子水平以及生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同领域融汇在一起。技术发展历史技术发展历史该技术是由电压钳（voltageclamp）发展而来的，电压钳技术由Cole和Marment设计，后经Hodgkin和Huxley改进并成功地应用于神经纤维动作电位的研究。其设计原理是根据离子作跨膜移动时形成了跨膜离子电流（I），而通透性即离子通过膜的难易程度，其膜电阻（R）的倒数，也就是膜电导（G）。因此，膜对某种离子通透性增大时，实际上时膜电阻变小，即膜对该离子的电导加大。根据欧姆定律
17、U=IR，即I=U/R=UG，所以，只要固定膜所以，只要固定膜两侧电位差（两侧电位差（U）时，测出的跨膜电流（）时，测出的跨膜电流（I）的变化，就可作为膜电导变）的变化，就可作为膜电导变化的度量，即可了解膜通透性的改变情况。化的度量，即可了解膜通透性的改变情况。 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100G的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片
18、电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1m的空间分辨率和10s的时间分辨率。1983年10月，Single-Channel Recording一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。技术发展历史技术发展历史技术原理技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实
19、上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。膜片钳技术的进步膜片钳技术的进步膜片钳技术被称为研究离子通道的膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从目前膜片钳技术已从常规常规膜片钳技术（膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到发展到全自动全自动膜片钳技术（膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。）。传统膜片钳技术传统
20、膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整
21、个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。选。标本种类标本种类使用的标本种类繁多。从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母
22、细胞发展到鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等；从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上。研研 究究 对对 象象研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。应用学科应用学科目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。应应 用用 举举 例例(1)膜片钳技术在通道研究中的重要作用(2)与药物作用有关的心肌离子通道 (3)对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究 (4)对单细胞形态与功能关系的研究 (5)对药物作用机制的研究 (6)在心血管药理研究中的应用 (7)创新药物研究与高通量筛选 (8)在神经科学中的应用
