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1、第十三章第四节第十三章第四节 酶酶 类类 药药 物物第一节第一节 酶类药物的原料来源酶类药物的原料来源一、原料的选择一、原料的选择 选择原料应该注意以下几点：选择原料应该注意以下几点：（1）不同酶的用料选择）不同酶的用料选择（2）注意不同生长发育情况与营养）注意不同生长发育情况与营养（3）从原料来源是否丰富考虑）从原料来源是否丰富考虑（4）从简化提纯步骤着手）从简化提纯步骤着手（5）尽量用新鲜组织）尽量用新鲜组织（6）必要时要考虑用基因工程方法）必要时要考虑用基因工程方法二、微生物酶制剂高产菌株的选育二、微生物酶制剂高产菌株的选育获得优良菌种的途径有三条：获得优良菌种的途径有三条：（1）从自然
2、界分离筛选）从自然界分离筛选（2）用物理或化学方法处理、诱变）用物理或化学方法处理、诱变（3）用基因重组与细胞融合技术，培育出优良菌种）用基因重组与细胞融合技术，培育出优良菌种三、微生物酶制剂生产的发酵技术三、微生物酶制剂生产的发酵技术首先是微生物的培养（即发酵），要选择：培养方法、培养基、培养首先是微生物的培养（即发酵），要选择：培养方法、培养基、培养温度、培养温度、培养pH和通气量等。和通气量等。更细一层的工艺还要考虑：培养基的灭菌方式、种子的培养条件、发更细一层的工艺还要考虑：培养基的灭菌方式、种子的培养条件、发酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和
3、pH调节控制等。调节控制等。此外，还要考虑酶的分离纯化技术和制备工艺等。此外，还要考虑酶的分离纯化技术和制备工艺等。先看发酵技术：先看发酵技术：（一）原料（一）原料1、碳源、碳源 常用的有甘薯、玉米、麸皮、米糠等常用的有甘薯、玉米、麸皮、米糠等2、氮源、氮源 常用的有豆饼、花生饼、菜籽饼等以及硫铵、氯化铵、尿常用的有豆饼、花生饼、菜籽饼等以及硫铵、氯化铵、尿素、磷酸氢二钾等素、磷酸氢二钾等3、无机盐、无机盐 常用有磷酸盐、硫酸盐、钾盐、硫酸镁、氯化钙等常用有磷酸盐、硫酸盐、钾盐、硫酸镁、氯化钙等4、生长因素和产酶促进剂、生长因素和产酶促进剂 如维生素、氨基酸、嘧啶如维生素、氨基酸、嘧啶/嘌呤碱
4、等；酶嘌呤碱等；酶促进剂如吐温促进剂如吐温80、聚乙烯醇、糖脂等、聚乙烯醇、糖脂等（二）培养方法（二）培养方法1、固体培养法、固体培养法 也即麸曲培养法，用麸皮或米糠为主要原料，看情况配以其它辅料，也即麸曲培养法，用麸皮或米糠为主要原料，看情况配以其它辅料，加水搅拌成半固态物料作为培养基。加水搅拌成半固态物料作为培养基。固体培养法不足是：设备简陋、劳动强度大、培养基散热慢、对温固体培养法不足是：设备简陋、劳动强度大、培养基散热慢、对温度度/pH/成分变化难以控制。成分变化难以控制。2、液体培养法、液体培养法 分为液体表面培养法和液体深层培养法；而深层通气培养法是目前分为液体表面培养法和液体深层
5、培养法；而深层通气培养法是目前应用最广的方法。培养条件可以调控，但因不同菌或不同酶而有所应用最广的方法。培养条件可以调控，但因不同菌或不同酶而有所不同。不同。3、影响产酶的一些因素、影响产酶的一些因素（1）培养基组分）培养基组分 （2）温度）温度 （3）pH （4）通气量）通气量 （5）搅拌速）搅拌速度度 （6）泡沫）泡沫 （7）湿度）湿度 （8）诱导剂）诱导剂第二节第二节 酶类药物的提取和纯化酶类药物的提取和纯化一、生物材料的预处理一、生物材料的预处理（一）动物材料的预处理（一）动物材料的预处理1、机械处理、机械处理 如组织绞碎、匀浆等如组织绞碎、匀浆等2、反复冻融、反复冻融3、丙酮粉、丙酮
6、粉 即用丙酮脱水干燥组织制成丙酮粉，对于结合酶的即用丙酮脱水干燥组织制成丙酮粉，对于结合酶的制备特有用。制备特有用。（二）微生物的预处理（二）微生物的预处理1、干燥法、干燥法 有空气干燥、真空干燥和冷冻干燥等有空气干燥、真空干燥和冷冻干燥等2、机械法、机械法 如研磨法、组织匀浆法、超声波法、高压匀浆法等如研磨法、组织匀浆法、超声波法、高压匀浆法等3、酶法处理、酶法处理 如溶菌酶等如溶菌酶等二、酶的提取二、酶的提取1、水溶法、水溶法 常用稀盐溶液或缓冲液提取；一般应在低温下操作，常用稀盐溶液或缓冲液提取；一般应在低温下操作，pH选择也很重选择也很重要，要考虑所提取酶的稳定性、溶解度和结合性质，一
7、般选择在酶要，要考虑所提取酶的稳定性、溶解度和结合性质，一般选择在酶稳定的稳定的pH范围内、偏离等电点的适当范围内、偏离等电点的适当pH。2、有机溶剂法、有机溶剂法 最常用的有机溶剂是丁醇，因为丁醇具有下列性质：亲脂性强、兼最常用的有机溶剂是丁醇，因为丁醇具有下列性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂和水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。具亲水性、在脂和水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。3、表面活性剂法、表面活性剂法 表面活性剂具有亲水性的或憎水性的原子基团；有阳离子型、阴表面活性剂具有亲水性的或憎水性的原子基团；有阳离子型、阴离子型和非离子型的，有天然的和人造的。如胆酸、磷脂、离子型和非离子型的，有
8、天然的和人造的。如胆酸、磷脂、SDS等。等。三、酶制剂的工业提取法三、酶制剂的工业提取法 把酶从菌体中或培养液中提取出来，使之达到与使用目的相适应的把酶从菌体中或培养液中提取出来，使之达到与使用目的相适应的纯度，这是酶提取和精制的任务。工业生产的酶有两种剂型纯度，这是酶提取和精制的任务。工业生产的酶有两种剂型液体制液体制剂和粉剂。剂和粉剂。（一）发酵液的预处理（一）发酵液的预处理 微生物发酵液的分离、过滤，常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、微生物发酵液的分离、过滤，常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和自动板框压滤机。离心沉降分离机和自动板框压滤机。（二）酶液的脱色（二）酶液的脱色 工
9、业上常用活性炭脱色。工业上常用活性炭脱色。（三）盐析法（三）盐析法（四）有机溶剂法（四）有机溶剂法 有机溶剂沉淀蛋白的能力：丙酮异丙醇乙醇甲醇，工业上常有机溶剂沉淀蛋白的能力：丙酮异丙醇乙醇甲醇，工业上常用的是乙醇。用的是乙醇。（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂 但常用是冷冻干燥法但常用是冷冻干燥法四、酶的纯化四、酶的纯化 不同的酶，其纯化工艺可以差得很大。那么，评价一个纯化工艺的不同的酶，其纯化工艺可以差得很大。那么，评价一个纯化工艺的好坏，主要看两个指标：酶的比活、总活力回收。要两者兼得是很难好坏，主要看两个指标：酶的比活、总活力回收。要两者兼得是很难的；目前
10、有关酶的纯化工艺是经验多于理论。一些纯化方法的搭配和的；目前有关酶的纯化工艺是经验多于理论。一些纯化方法的搭配和连贯运用，是靠不断摸索的经验积累。下面讨论一些纯化过程中经常连贯运用，是靠不断摸索的经验积累。下面讨论一些纯化过程中经常遇到的技术难点。遇到的技术难点。（一）杂质的出去（一）杂质的出去 除杂质常用的一些方法：除杂质常用的一些方法：1、pH和加热沉淀法和加热沉淀法2、蛋白质表面变性法、蛋白质表面变性法3、选择性变性法、选择性变性法4、核酸沉淀剂法、核酸沉淀剂法5、将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白、将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白（二）脱盐和浓缩（二）脱盐和浓缩1、脱盐、脱盐 最常用
11、的脱盐方法是透析和凝胶过滤。最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。 常用的凝胶有常用的凝胶有Sephadex G-10, G-15, G-25以及以及Bio-Gel P-2, P-4, P-6, P-10等。等。2、浓缩、浓缩 酶的浓缩方法很多，常用的有冷冻干燥法、离子交换法、超滤法、凝酶的浓缩方法很多，常用的有冷冻干燥法、离子交换法、超滤法、凝胶吸水法和聚乙二醇吸水法等。胶吸水法和聚乙二醇吸水法等。（三）酶的结晶（三）酶的结晶1、酶的结晶方法、酶的结晶方法（1）盐析法）盐析法 在适当的在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定，慢慢改变盐浓度进行结、温度等条件下，保持酶的稳定，慢慢改变盐浓度进行结
12、晶；结晶时常用的盐有硫铵、柠檬酸钠、乙酸铵、硫酸镁和甲酸钠等。晶；结晶时常用的盐有硫铵、柠檬酸钠、乙酸铵、硫酸镁和甲酸钠等。（2）有机溶剂法）有机溶剂法 结晶常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二噁烷，结晶常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二噁烷，二甲亚砜、二氧杂环己烷等。与盐析法相比，用有机溶剂法易引起酶失二甲亚砜、二氧杂环己烷等。与盐析法相比，用有机溶剂法易引起酶失活。活。（3）复合结晶法）复合结晶法（4）透析平衡法）透析平衡法（5）等电点法）等电点法2、结晶条件的选择、结晶条件的选择 影响酶结晶的因素很多，下面几个尤为重要：影响酶结晶的因素很多，下面几个尤为重要
13、：（1）酶的纯度）酶的纯度 一般来说，纯度越高，结晶越容易。一般来说，纯度越高，结晶越容易。（2）酶的浓度）酶的浓度 一般浓度越高，越有利于结晶。通常一般浓度越高，越有利于结晶。通常5-10mg/ml为好。为好。（3）温度）温度 低温下较好，一般低温下较好，一般4 或或25。（4）时间）时间 不一定，因酶而异。不一定，因酶而异。（5）pH 一般选择在被结晶酶的等电点附近。一般选择在被结晶酶的等电点附近。（6）金属离子）金属离子 金属离子有助于酶的结晶，如金属离子有助于酶的结晶，如Ca2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+等。等。（7）晶种）晶种 不易结晶的蛋白和酶，有
14、时需要加入微量的晶种才能结晶。不易结晶的蛋白和酶，有时需要加入微量的晶种才能结晶。（8）结晶器皿处理）结晶器皿处理 要充分洗净、烘干。要充分洗净、烘干。（四）酶分离和纯化工作中的注意事项（四）酶分离和纯化工作中的注意事项1、防止酶蛋白变性、防止酶蛋白变性 因为浓度越大，越容易变性。因为浓度越大，越容易变性。pH不能过高或过低。不能过高或过低。2、防止辅因子的流失、防止辅因子的流失3、防止酶被蛋白水解酶降解、防止酶被蛋白水解酶降解第三节第三节 酶类药物酶类药物一、药用酶类一、药用酶类（一）促进消化酶类（一）促进消化酶类 这类酶的作用是水解和消化食物中的成分，如蛋白质、糖类和脂这类酶的作用是水解和
15、消化食物中的成分，如蛋白质、糖类和脂肪类等。如复合消化剂，内含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。肪类等。如复合消化剂，内含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。（二）消炎酶类（二）消炎酶类 已经用的酶有溶菌酶、菠萝蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶、木瓜已经用的酶有溶菌酶、菠萝蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶等。蛋白酶等。（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类 目前已用于临床的有链激酶、尿激酶、纤溶酶、凝血酶和曲菌蛋目前已用于临床的有链激酶、尿激酶、纤溶酶、凝血酶和曲菌蛋白酶等。白酶等。（四）抗肿瘤的酶类（四）抗肿瘤的酶类 如门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、神经氨酸苷酶、尿激酶
16、等。如门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、神经氨酸苷酶、尿激酶等。（五）其它药用酶（略）（五）其它药用酶（略）二、重要酶类药物二、重要酶类药物（一）胃蛋白酶（一）胃蛋白酶（Pepsin）1、组成（结构）、性质、组成（结构）、性质 药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等。淡黄色粉末，易溶于水；结晶胃蛋白酶呈针状，织蛋白酶、胶原酶等。淡黄色粉末，易溶于水；结晶胃蛋白酶呈针状，分子量分子量34500Da。2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线）工艺路线（2）工艺过程）工艺过程自溶、过滤自溶、过滤 猪胃黏膜在盐酸溶液
17、中消化猪胃黏膜在盐酸溶液中消化3-4h，过滤，收集滤液。，过滤，收集滤液。脱脂、去杂质脱脂、去杂质 滤液降温至滤液降温至30以下，静置以下，静置24-28h，使杂质沉淀，使杂质沉淀，离心得脱脂酶液。离心得脱脂酶液。浓缩、干燥浓缩、干燥 脱脂酶液在脱脂酶液在40以下浓缩至原体积的以下浓缩至原体积的1/4，真空干燥，真空干燥，球磨，即得胃蛋白酶粉。球磨，即得胃蛋白酶粉。（3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺： 向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及60%丙酮沉淀分离胃膜素的母液丙酮沉淀分离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至比重中，边搅拌边加冷丙酮
18、，至比重0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉淀，静放，即有淡黄色胃蛋白酶沉淀，静放过夜，去上清，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。过夜，去上清，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。（4）结晶胃蛋白酶的制备：）结晶胃蛋白酶的制备： 取药用胃蛋白酶原粉，溶于取药用胃蛋白酶原粉，溶于20%酒精，加酒精，加H2SO4调调pH3.0，5静置静置20h后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析；盐析物再在后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析；盐析物再在pH3.8-4.0的乙醇的乙醇中溶解，过滤，滤液用硫酸调中溶解，过滤，滤液用硫酸调pH1.8-2.0，即析出针状胃蛋白酶；沉淀再，即析出针状胃蛋白酶；沉淀再溶于溶于20%pH4.0的乙醇，过
19、滤，滤液用硫酸调的乙醇，过滤，滤液用硫酸调pH1.8，在，在20放置，即可放置，即可得板状或针状晶体。得板状或针状晶体。3、检验方法（略）、检验方法（略）（二）胰蛋白酶（二）胰蛋白酶（Trypsin）1、结构与性质、结构与性质 易溶于水，牛胰蛋白酶原易溶于水，牛胰蛋白酶原229aa组成，游对二硫键，在肠激酶或自组成，游对二硫键，在肠激酶或自身催化下，释放出身催化下，释放出6肽，变成活性胰蛋白酶，分子量肽，变成活性胰蛋白酶，分子量24KDa，223aa。胰蛋白酶专一性作用于精氨酸与亮氨酸组成的肽键。猪胰蛋白酶的胰蛋白酶专一性作用于精氨酸与亮氨酸组成的肽键。猪胰蛋白酶的pI为为10.8。2、生产工
20、艺、生产工艺（1）工艺路线）工艺路线（2）工艺过程）工艺过程浸取浸取 新鲜胰脏，除去脂肪、结缔组织等，浸入预冷的新鲜胰脏，除去脂肪、结缔组织等，浸入预冷的0.125M硫硫酸中，速冷，在酸中，速冷，在0保存。从酸中取出、绞碎，用保存。从酸中取出、绞碎，用0.125M硫酸浸取硫酸浸取24h，并不断搅拌，过滤，滤饼再次浸取，合并滤液。，并不断搅拌，过滤，滤饼再次浸取，合并滤液。分级盐析、结晶分级盐析、结晶 上述滤液中加硫铵使成上述滤液中加硫铵使成40%饱和度，置冷室过饱和度，置冷室过夜，过滤，滤液再硫铵夜，过滤，滤液再硫铵70%饱和度冷室过夜沉淀，过滤，滤液再硫铵饱和度冷室过夜沉淀，过滤，滤液再硫铵
21、70%饱和度沉淀，过滤，沉淀溶于冷水，再重复硫铵沉淀，过滤。饱和度沉淀，过滤，沉淀溶于冷水，再重复硫铵沉淀，过滤。 沉淀溶于冷水，用沉淀溶于冷水，用5M NaOH调调pH5.0，25保温保温48h，即有针状结，即有针状结晶析出（胰蛋白酶原粗品）；过滤，滤液用硫铵也可再沉淀出部分胰晶析出（胰蛋白酶原粗品）；过滤，滤液用硫铵也可再沉淀出部分胰蛋白酶原粗品。蛋白酶原粗品。溶解、分级盐析溶解、分级盐析 胰蛋白酶原精制。胰蛋白酶原精制。活化活化 使胰蛋白酶原变为胰蛋白酶。使胰蛋白酶原变为胰蛋白酶。除钙、盐析、透析、冻干除钙、盐析、透析、冻干 硫铵除钙；硫铵饱和沉淀；沉淀用硼酸硫铵除钙；硫铵饱和沉淀；沉淀
22、用硼酸缓冲液溶解，调缓冲液溶解，调pH8.0，过滤除杂，滤液透析除盐；结晶；晶体溶解，过滤除杂，滤液透析除盐；结晶；晶体溶解于蒸馏水，再透析，硅藻土吸附杂质后，过滤，滤液冻干即得产品。于蒸馏水，再透析，硅藻土吸附杂质后，过滤，滤液冻干即得产品。3、检验方法、检验方法（1）质量标准）质量标准 性状（白色粉末）、澄清度、性状（白色粉末）、澄清度、pH（5-7）、干燥失重（不得超过）、干燥失重（不得超过8%）、糜蛋白酶限度检查（不得超过）、糜蛋白酶限度检查（不得超过5%）（2）效价检测（略）效价检测（略） 底物与酶反应，测定底物与酶反应，测定A253值，按公式计算效价。值，按公式计算效价。（三）尿激
23、酶（三）尿激酶（Urokinase）1、组成、性质、组成、性质 一种碱性蛋白，由肾脏产生。分子量有一种碱性蛋白，由肾脏产生。分子量有31.3KDa和和54.7KDa两种；两种；尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸；尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸；血纤维蛋白酶原是它唯一的天然蛋白质底物。尿激酶血纤维蛋白酶原是它唯一的天然蛋白质底物。尿激酶pI为为8-9。临床上，。临床上，尿激酶已广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。尿激酶已广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线）工艺路线（2）工艺过程）工艺过程收尿
24、收尿 最好是男性尿。最好是男性尿。沉淀处理沉淀处理 用用NaOH调调pH8.58，静止，静止1h，沉淀，取上清。，沉淀，取上清。硅藻土吸附硅藻土吸附 上清尿液用硅藻土搅拌吸附。上清尿液用硅藻土搅拌吸附。洗脱洗脱 吸附好的硅藻土装柱，用吸附好的硅藻土装柱，用0.02%氨水加氨水加0.1M氯化钠洗脱，洗脱氯化钠洗脱，洗脱液变混时开始收集。液变混时开始收集。除热原、去色素除热原、去色素 过过QAE-Sephadex层析柱。层析柱。CM-C柱浓缩柱浓缩透析除盐透析除盐 4对水透析除盐。对水透析除盐。3、检验方法、检验方法（1）性状）性状 无色或白色粉末。无色或白色粉末。（2）活力检测）活力检测 气泡上
25、升法和平板法（气泡上升法和平板法（p372-373，自己看看），自己看看）（四）细胞色素（四）细胞色素C（五）糜蛋白酶（五）糜蛋白酶（六）溶菌酶（六）溶菌酶（七）超氧化物歧化酶（七）超氧化物歧化酶（以上四种酶的生产工艺和工艺过程自己看看）（以上四种酶的生产工艺和工艺过程自己看看）本章思考练习本章思考练习1、酶类药物的原料来源主要有哪些？、酶类药物的原料来源主要有哪些？2、发酵法微生物酶制剂生产过程中影响酶产生的因素有、发酵法微生物酶制剂生产过程中影响酶产生的因素有哪些？哪些？3、酶制剂的工业提取方法有哪些？、酶制剂的工业提取方法有哪些？4、酶类药物有哪几类？、酶类药物有哪几类？5、胃蛋白酶的生产工艺如何？、胃蛋白酶的生产工艺如何？6、胰蛋白酶生产的工艺过程如何？、胰蛋白酶生产的工艺过程如何？7、从人尿液中如何分离提取尿激酶？、从人尿液中如何分离提取尿激酶？
